一种宫颈癌预后评分系统及其应用的制作方法

1.本发明涉及生物医药领域，尤其是涉及宫颈癌预后评分系统及其应用。


背景技术：

2.宫颈癌是我国最常见的妇科恶性肿瘤。对于早期宫颈癌患者，手术治疗是最主要的治疗手段，对于术后有高危因素患者，应接受辅助放化疗。目前，宫颈癌治疗方式的选择主要是根据临床分期及术后病理因素(如肿瘤大小、肿瘤浸润深度、脉管瘤栓lvsi、宫旁浸润、手术切缘情况及淋巴结转移)。2018年国际妇产联盟figo修订了宫颈癌分期，将原来的临床分期改为了临床病理分期，将影像学检查及病理结果纳入了宫颈癌分期中。对于不保留生育功能的患者，ia1期伴有lvsi及ia2期的主要治疗手段是改良的根治性子宫切除术 盆腔淋巴结切除术；对于ib
–
iia期的治疗方式有根治性子宫切除术 盆腔淋巴结切除术或同步放化疗 近距离放疗，对于手术患者，根据术后病理有高危因素患者应接受辅助同步放化疗。
3.figo分期(2018)如下：
4.i期癌局限于宫颈(不考虑扩散至宫体)
5.ia期只是在显微镜下诊断的、所测量的最大浸润深度≤5.0mm的浸润癌
6.ia1所测量间质浸润小于<3.0mm
7.ia2所测量间质浸润≥3.0mm而≤5.0mm
8.ib期所测量的最大浸润深度＞5.0mm的浸润癌
9.ib1浸润深度＞5.0mm而最大径线≤2.0cm的浸润癌
10.ib2最大径线＞2.0cm而≤4.0cm的浸润癌
11.ib3最大径线＞4.0cm的浸润癌
12.ii期宫颈癌浸润超出子宫，但未达阴道下1/3或骨盆壁。
13.iia期无宫旁浸润
14.iia1期浸润癌最大径线≤4.0cm
15.iia2期浸润癌最大径线＞4.0cm
16.iib期宫旁浸润
17.iii期癌累及阴道下1/3，和/或扩散到骨盆壁，和/或导致肾积水或无功能肾，和/或累及盆腔和/或腹主动脉旁淋巴结
18.iiia期癌累及阴道下1/3，未扩散到骨盆壁
19.iiib期扩散到骨盆壁，和/或肾积水或无功能肾
20.iiic期盆腔和/或腹主动脉旁淋巴结受累，无论肿瘤的大小与范围(采用r与p标记)
21.iiic1期只是盆腔淋巴结转移
22.iiic2期腹主动脉旁淋巴结转移
23.iv期癌已扩散超出真骨盆或累及膀胱或直肠粘膜(活检证实)
24.iva期扩散至邻近的盆腔器官
25.ivb期转移至远处器官
26.宫颈癌的临床病理分期是以体格检查和病理诊断为基础，然而肿瘤浸润深度的测量、lvsi的判断是以形态病理为基础，相对主观。尽管临床病理分期对判断预后有一定的指导意义，但是仍有一定的争议。病理因素的判读(如lvsi、间质浸润深度)的标准不够客观和统一，导致部分患者治疗过度或治疗不足。因此，需要更加客观的、更加精准的方法判断患者的预后，用于指导宫颈癌患者术后的辅助治疗。


技术实现要素：

27.为了解决上述问题，本发明的目的在于提供一种客观的、可行的、重复性高的基于肿瘤微环境中免疫分子评分及临床病理分期的综合预后评分系统，根据评分系统对子宫颈癌术后患者判断复发风险和预后，从而制定出不同的管理策略和治疗方案。本评分系统适用于接受手术治疗的figo i
–
ii期及术后发现的iiic期宫颈癌患者。
28.为实现上述目的，本发明具体技术方案如下：
29.本发明第一方面提供了一种子宫颈癌预后评分系统，包括figo分期判断部分和免疫评分部分；
30.所述各部分含有检测试剂，所述figo分期判断部分包括figo分期判断；所述免疫评分部分检测pd
‑
l1、vista和/或b7
‑
h4表达。
31.进一步地，所述检测的方法为免疫组织化学方法。
32.进一步地，所述figo分期判断标准为宫颈癌figo分期(2018)。
33.进一步地，所述figo分期判断部分ia期赋予为0分，ib期赋予1分，ii期赋予2分，iiic期赋予3分；所述免疫评分部分pd
‑
l1阳性赋予1分，pd
‑
l1阴性vista阴性赋予2分，pd
‑
l1阴性vista阳性b7
‑
h4阳性赋予0分，pd
‑
l1阴性vista阳性b7
‑
h4阴性赋予1分。
34.所述pd
‑
l1的检测：采用联合阳性分数(combined positive score，cps)的方法：cps≥1定义为pd
‑
l1阳性，cps＜1定义为pd
‑
l1阴性。
35.所述vista的检测：vista在肿瘤间质免疫细胞中阳性的比例≥1％定义为vista阳性；＜1％定义为vista阴性。仅评估vista在免疫细胞中的表达，不评估在肿瘤细胞中的表达。
36.所述b7
‑
h4的检测：b7
‑
h4仅表达中肿瘤细胞，≥1％的肿瘤细胞的细胞膜或细胞质着色定义为b7
‑
h4阳性，＜1％定义为b7
‑
h4阴性。
37.进一步地，所述两部分得分相加，得到总分，总分范围0
–
5分，将子宫颈癌进一步地危险分层如下：0
–
1分为低危，2
–
3分为中危，4
–
5分为高危。
38.本发明第二方面提供了所述评分系统和/或模型在制备判断子宫颈癌术后复发风险的产品中的用途。
39.本发明所述的产品包括试剂、试剂盒和/或系统等。
40.本发明第三方面提供了检测pd
‑
l1表达的试剂在制备判断子宫颈癌术后复发风险或预后的产品中的应用。
41.进一步地，所述产品还包括检测vista和/或b7
‑
h4表达的试剂。
42.本发明第四方面提供了一种判断子宫颈癌术后复发风险的试剂盒包括检测pd
‑
l1、vista和/或b7
‑
h4表达的试剂。
43.进一步地，所述检测的方法包括免疫学方法检测；优选地，免疫组化。
44.进一步地，所述子宫颈癌为figo i
–
ii期及iiic期。
45.基于上述技术方案，本发明具有以下有益效果：
46.本发明是基于518例接受手术治疗的2018figo i
–
ii及figo iiic期子宫颈癌建立的。本发明达到了以下几方面的效果：
47.(1)根据本发明的评分系统制定的不同风险分层患者无复发生存期的差异显著(p＝0.002)。figo分期患者的无复发生存期的无显著差异(p＝0.14)。生存曲线见图3。
48.(2)对于患者的无复发生存期(rfs)，本发明模型的c指数为0.70(95％可信区间0.60
–
0.79)，而figo分期的c指数为0.60(95％可信区间为0.48
–
0.71)，两个模型的预测能力具有差异(p＝0.003)，说明本发明的预后评分系统比现有的figo分期具有更高的预测能力。本发明模型和figo分期的c指数见图4。
49.对于2年无复发生存期的预测能力，本发明模型与figo分期相比，idi＝1.2％，95％可信区间为0.2％
–
2.4％，p＝0.01。由此可以看出，本发明的预后评分模型比现有figo分期的预测能力更好，预测患者预后的能力更强。
50.本发明预后评分模型是以免疫组化检测和临床病理分期为基础，具有相对客观、临床可行的特点，比现有figo分期具有更高的判读复发的能力，有助于避免过度治疗和治疗不足。
附图说明
51.图1.figo分期的方法及复发风险评分。
52.图2.免疫评分的步骤及复发风险评分。
53.图3.本发明中的预后评分模型(复发风险模型)及figo分期中不同风险分层患者的生存曲线。a.根据现有figo分期的患无复发生存曲线；b.根据本发明模型分层的患者无复发生存曲线。
54.图4.本发明中的预后评分模型(复发风险模型)及现有figo分期c指数的比较，本发明中模型的c指数显著高于现有figo分期的c指数。
具体实施方式
55.以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
56.下述实施例所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
57.下述实施例中所有的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
58.实施例
59.1、研究对象
60.本实施案例的研究对象为figo i
–
ii期及iiic其子宫颈癌患者术后的肿瘤组织标本。纳入标准：明确病理诊断为子宫颈癌鳞癌、腺鳞癌或普通型腺癌；病理切片及石蜡标本完整；随访时间至少3个月；临床数据完整。
61.排除标准：figo iiia、iiib及iv期；术前接受新辅助化疗；术前接受放射治疗；合
并卵巢癌、宫颈癌等妇科恶性肿瘤；其他病理类型，如黏液腺癌、透明细胞癌、小细胞癌；病理切片或石蜡标本缺失；无随访时间小于3个月。
62.2、研究方法
63.2.1临床资料的收集
64.通过查阅患者住院病历及门诊病历，记录患者的年龄、手术方式、术前是否接受化疗、术后是否接受辅助治疗、辅助治疗的方式，通过电话或门诊病历随访，记录患者是否复发、复发时间、复发部位。
65.2.2figo分期的判断
66.通过显微镜下观察病理he切片，判读以下病理参数，包括组织学类型、分化程度、肿瘤分级、肿瘤浸润深度、lvsi、间质浸润情况。根据病理参数、体格检查及影像学检查确定figo分期。赋分系统见图1。
67.2.3免疫组织化学染色
68.1)病理标本的筛选：挑选含有肿瘤组织的石蜡组织标本，有条件可制备石蜡包埋标本的组织芯片。
69.2)切片，展片，贴片，烤片：切片厚度为4μm，然后将展开的切片用防脱粘附载玻片捞起，放于切片架晾干，在烤片机上70℃烘烤30min。
70.3)脱蜡：将至切片一次放入二甲苯ⅰ、二甲苯ⅱ、100％酒精、95％酒精、90％酒精、85％酒精、75％酒精、50％酒精、蒸馏水中各5min，进行脱蜡。
71.4)抗原修复：将一定量的柠檬酸钠抗原修复液(ph＝6.0)加入烧杯中，将烧杯放入高压锅中，加热至沸腾，高压沸腾2～3min，抗原修复液冷却恢复至室温，用pbs冲洗2次。
72.5)灭活过氧化物酶：滴加3％双氧水至组织切片，室温孵育15min，pbs冲洗3遍，以阻断内源性过氧化物酶。
73.6)封闭：使用防水记号笔勾勒出组织标本部分，滴加封闭用血清，置于湿盒中室温下封闭30min,pbs冲洗3次。
74.7)孵育一抗：在组织切片滴加抗vista(稀释比例1:200)、b7
‑
h4(稀释比例1:200)及pd
‑
l1(稀释比例1:200)的抗体置于湿盒中，4℃过夜。同型igg作为阴性对照。
75.8)孵育二抗：一抗孵育4℃过夜后，取出，在37℃复温1h，pbs洗三次,滴加二抗，室温孵育1h；然后pbs冲洗三次。
76.9)dab显色：孵育完毕后，滴加新鲜配置的dab显色液，显色5min左右，观察染色情况，根据染色的程度，流动水冲洗10min，及时终止显色。
77.10)苏木素复染，蓝返：切片在苏木素染液中室温染色2min左右，流动水冲洗后放入0.1％盐酸乙醇中5
‑
10s，自来水冲洗后，放入氨水中5
‑
10s蓝返。
78.11)脱水：依次在浓度为50％酒精
→
70％酒精
→
80％酒精
→
90％酒精
→
95％酒精
→
100％酒精(两次)脱水5min，二甲苯透明：二甲苯ⅰ、二甲苯ⅱ中10min透明。
79.12)封片：中性树胶封片，盖上盖玻片，注意避免出现气泡，通风橱内晾干后观察。
80.2.4免疫组化结果的评估
81.利用免疫组织化学的方法检测pd
‑
l1，vista和b7
‑
h4在子宫颈癌中的表达。
82.pd
‑
l1的评估：采用联合阳性分数(combined positive score，cps)的方法：cps≥1定义为pd
‑
l1阳性，cps＜1定义为pd
‑
l1阴性。
[0083][0084]
vista的评估：viata在肿瘤间质免疫细胞中阳性的比例≥1％定义为vista阳性；＜1％定义为vista阴性。仅评估vista在免疫细胞中的表达，不评估在肿瘤细胞中的表达。
[0085]
b7
‑
h4的评估：b7
‑
h4仅表达肿瘤细胞中，≥1％的肿瘤细胞的细胞膜或细胞质着色定义为b7
‑
h4阳性，＜1％定义为b7
‑
h4阴性。
[0086]
(1)首先进行pd
‑
l1的评估，对于pd
‑
l1阳性者赋予1分。pd
‑
l1阴性者，进入下一步vista的评估。
[0087]
(2)vista阴性者赋予2分，对于vista阳性者，进入下一步b7
‑
h4的评估。
[0088]
(3)b7
‑
h4阳性者赋予0分，b7
‑
h4阴性者赋予1分。
[0089]
复发风险评分流程见图2。
[0090]
2.5根据预后评分系统判断复发风险
[0091]
将以上2项预后因素得分相加，得到总分，总分范围0
–
5分，危险分层如下：0
–
1分为低危，2分为中危，3分为高中危，4
–
5分为高危。
[0092]
2.6统计分析
[0093]
利用r语言中的survival包及ggplot包绘制两种模型的患者生存曲线，利用r语言中的survival包和survcomp包比较本发明模型与figo分期的c指数，利用r语言中的survidinr包计算两种模型的综合判别改善指数(integrated discrimination improvement,idi)。
[0094]
c指数即一致性指数(c
‑
index，concordance index)，用来评价模型的预测能力。c指数是指所有病人对子中预测结果与实际结果一致的对子所占的比例，它估计了预测结果与实际观察到的结果相一致的概率。
[0095]
综合判别改善指数(integrated discrimination improvement,idi)，总体来说idi越大，则提示新模型预测能力越好。若idi>0，则为正改善，说明新模型比旧模型的预测能力有所改善，若idi<0，则为负改善，新模型预测能力下降，若idi＝0，则认为新模型没有改善。
[0096]
本发明评分系统是基于518例接受手术治疗的2018figo i
–
ii及figo iiic期子宫颈癌建立的。
[0097]
(1)根据本发明的评分系统制定的不同风险分层：低危患者39例，仅1例(1.4％)复发，5年无复发生存率为98.6％；中危患者329例，38例(11.6％)复发，5年无复发生存率为84.7％；高危患者120例，其中24例(20.0％)复发，5年无复发生存率为75.2％；不同风险组患者之间的生存率有显著差异(p＝0.002)。figo ia期17例，无一例复发，5年无复发生存率100％,figo ib期患者317例，共35例(11％)复发,5年无复发生存率85.9％；figo ii期40例，3例(7.5％)复发,5年无复发生存率85.0％；figo iiic期144例，25例(17.4％)，5年无复发生存率79.1％。figo分期患者的无复发生存期的无显著差异(p＝0.141)。生存曲线见图3。
[0098]
(2)本发明的预后评分系统比现有的figo分期具有更高的预测能力。对于患者的无复发生存期(rfs)，本发明中的预后模型的c指数为0.70(95％可信区间0.60
–
0.79)，而figo分期的c指数为0.60(95％可信区间为0.48
–
0.71)，两个模型的预测能力具有差异(p＝
0.003)。本发明中的预后评分模型和figo分期的c指数见图4。
[0099]
对于2年无复发生存期的预测能力，本发明模型与figo分期相比，idi＝1.2％，95％可信区间为0.2％
–
2.4％，p＝0.01。由此可以看出，本发明模型比现有figo分期的预测能力更好，预测患者预后的能力更强。
[0100]
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。