一种小儿肺热咳喘颗粒中黄芩含量的高效液相色谱分析方法与流程

1.本发明涉及小儿药物检测领域，特别涉及一种小儿肺热咳喘颗粒中黄芩含量的高效液相色谱分析方法。


背景技术：

2.小儿肺热咳喘颗粒为十一味中药的复方制剂，具有清热解毒、宣肺止咳、化痰平喘的功能，主要用于感冒、支气管炎、喘息性支气管炎、支气管肺炎属痰热壅肺证者。黄芩主要具有清热燥湿，泻火解毒，止血安胎等作用，已有悠久的用药历史，是我国中医临床常用中药品种之一。黄芩苷是黄芩的有效成分之一，现代药理研究证实，黄芩苷具有广谱抗菌，抗病毒和解热作用，其抗炎作用疗效确切。因此黄芩苷作为本品的活性成分之一，可以作为衡量小儿肺热咳喘颗粒中黄芩含量的依据。参照现有方法，如黄芩药材、白芍药材中黄芩苷含量检测方法，柱温为40℃，不利于色谱柱长期使用，还影响色谱柱稳定性，降低色谱柱的使用寿命，而且检测效果不理想。


技术实现要素：

3.鉴于此，本发明提出一种小儿肺热咳喘颗粒中黄芩含量的高效液相色谱分析方法，解决上述问题。
4.本发明的技术方案是这样实现的：
5.一种小儿肺热咳喘颗粒中黄芩含量的高效液相色谱分析方法，包括以下步骤：
6.(1)供试品溶液的配制：取小儿肺热咳喘颗粒供试品，以三正辛基氧化膦乙醇溶液为溶剂，密塞，超声处理，放冷至室温，继续使用三正辛基氧化膦乙醇溶液定容，制得供试品溶液；
7.(2)对照品溶液的配制：精密称取黄芩苷对照品，以三正辛基氧化膦乙醇溶液为溶剂，制得对照品溶液；
8.(3)色谱条件：分别取对照品溶液和供试品溶液，注入高效色谱仪中进行测定，以2,4
‑
二甲基
‑3‑
戊醇为流动相a，磷酸三丁酯为流动相b，以乙醇为流动相c，进行梯度洗脱。
9.进一步的，所述三正辛基氧化膦乙醇溶液由三正辛基氧化膦和乙醇按照质量比5
‑
10：90
‑
95制得。
10.进一步的，所述超声处理时间为2
‑
4min，超声功率为100
‑
120w，超声频率为20
‑
25khz，优选超声处理时间为3min，超声功率为110w，超声频率为23khz。
11.进一步的，洗脱程序为：
[0012] 流动相a(v/v)流动相b流动相c0
‑
8.0063％12％25％8.01
‑
15.0055％35％10％15.01
‑
30.0035％55％10％30.01
‑
40.0012％63％25％
[0013]
进一步的，采用inertsustain c18色谱柱，长150mm，内径3.0mm，填充料粒径为3μm。
[0014]
进一步的，柱温为23
‑
28℃，流速为0.8
‑
1.2ml/min，检测波长为272～282nm。优选，所述柱温为25℃，流速为1.0ml/min，检测波长为277nm。
[0015]
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
[0016]
采用本发明的高效液相色谱分析方法，优选流动相结合梯度洗脱，有效降低柱温，能够在近室温条件下有效检测，不但能够提高色谱柱寿命，而且峰形良好，与其他相邻峰也分离良好，能够较好检测小儿肺热咳喘颗粒中黄芩苷含量，检测方法线性关系、重复性、精密度、定量限等均良好。而且，采用优选复配溶剂，降低超声功率和时间，减少溶剂损失，提高检测稳定性。
附图说明
[0017]
图1为本发明实施例1的供试品溶液的hplc图谱照片；
[0018]
图2为本发明实施例1的对照品溶液的hplc图谱照片。
具体实施方式
[0019]
为了更好理解本发明技术内容，下面提供具体实施例，对本发明做进一步的说明。
[0020]
本发明实施例所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0021]
本发明实施例所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0022]
实施例1
[0023]
取小儿肺热咳喘颗粒样品，按以下步骤进行检测：
[0024]
(1)溶剂配制：由三正辛基氧化膦和乙醇按照质量比5：95混合制得三正辛基氧化膦乙醇溶液，即得溶剂；
[0025]
(2)供试品溶液的配制：取小儿肺热咳喘颗粒供试品约0.4g，精磨称定，置50ml容量瓶中，加入步骤(1)三正辛基氧化膦乙醇溶液(溶剂)，密塞，超声处理3min，超声功率为110w，超声频率为23khz，放冷至室温，继续使用步骤(1)三正辛基氧化膦乙醇溶液定容，制得供试品溶液，取续滤液用0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液；
[0026]
(3)对照品溶液的配制：精密称取黄芩苷对照品，以步骤(1)三正辛基氧化膦乙醇溶液为溶剂，使溶解，定容，制成每lml含黄芩苷约60μg的溶液，即得对照品溶液，用0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液。
[0027]
(4)色谱条件：分别取对照品溶液和供试品溶液，注入高效色谱仪中进行测定，进样体积10μl。以2,4
‑
二甲基
‑3‑
戊醇为流动相a，磷酸三丁酯为流动相b，以乙醇为流动相c，进行梯度洗脱，洗脱程序为：
[0028] 流动相a(v/v)流动相b流动相c0
‑
8.0063％12％25％8.01
‑
15.0055％35％10％15.01
‑
30.0035％55％10％30.01
‑
40.0012％63％25％
[0029]
检测条件：采用inertsustain c18色谱柱，长150mm，内径3.0mm，填充料粒径为3μ
m，
[0030]
柱温为25℃，
[0031]
流速为1.0ml/min，
[0032]
检测波长为277nm。
[0033]
如图1所示，实施例1的供试品溶液(样品)的hplc图谱照片。
[0034]
如图2所示，实施例1的对照品溶液的hplc图谱照片。
[0035][0036][0037]
供试品图谱中黄芩苷峰形良好，与其他相邻峰也分离良好。
[0038]
实施例2
[0039]
采用实施例1的色谱条件，在实施例1基础上，使用溶剂由三正辛基氧化膦和乙醇按照质量比10：90混合制得。
[0040]
实施例3
[0041]
采用实施例1制备的对照品溶液和供试品溶液，在实施例1基础上，调整色谱条件中柱温为23℃。
[0042]
实施例4
[0043]
采用实施例1制备的对照品溶液和供试品溶液，在实施例1基础上，调整色谱条件中柱温为28℃。
[0044]
实施例5
[0045]
采用实施例1制备的对照品溶液和供试品溶液，在实施例1基础上，调整色谱条件中流速为0.8ml/min。
[0046]
实施例6
[0047]
采用实施例1制备的对照品溶液和供试品溶液，在实施例1基础上，调整色谱条件中流速为1.2ml/min。
[0048]
实施例7
[0049]
采用实施例1制备的对照品溶液和供试品溶液，在实施例1基础上，调整色谱条件中检测波长为272nm。
[0050]
实施例8
[0051]
采用实施例1制备的对照品溶液和供试品溶液，在实施例1基础上，调整色谱条件中检测波长为282nm。
[0052]
对比例1
[0053]
在实施例1基础上，未采用梯度洗脱，采用体积比为47：53：0.2的甲醇
‑
水
‑
磷酸为流动相。结果显示，黄芩苷峰形不好，而且拖尾因子大于1.5。
[0054]
对比例2
[0055]
在实施例1基础上，未采用梯度洗脱，采用体积比为1：1：1的2,4
‑
二甲基
‑3‑
戊醇、磷酸三丁酯和乙醇为流动相。结果显示，黄芩苷峰形不好，拖尾因子小于1.5。
[0056]
试验例
[0057]
将实施例1的色谱条件进行方法学考察。结果如下：
[0058]
2.1系统适用性试验
[0059]
按照实施例1配制供试品溶液和对照品溶液。
[0060]
实验结果表明，理论板数均高于4600(按黄芩苷峰计算)。符合系统适用性要求(理论板数高于2500)。
[0061]
2.2线性关系试验
[0062]
取黄芩苷对照品10.45mg(含量是94.0％)，精密称定，置50ml量瓶中，加5wt％三正辛基氧化膦乙醇溶液溶解并稀释至刻度，摇匀。再分别精密量取3、4、5、6、7ml置10ml量瓶中，加5wt％三正辛基氧化膦乙醇溶液稀释至刻度，摇匀。按照实施例1的色谱条件进行测定。
[0063]
实验结果：线性方程为：y＝37218x
‑
60709，r＝0.9999，结果表明，黄芩苷对照品在58.464～137.415μg/ml浓度范围内，与峰面积呈良好的线性关系(r2＝0.9999)。
[0064]
2.3精密度
[0065]
2.3.1进样精密度：由不同分析人员，间隔一天，在同一实验室分别采用两台不同的液相(第一台：双泵
‑
自动进样；第二台：单泵
‑
手动进样)测定黄芩苷对照品溶液(参照实施例1配制)，计算其峰面积的平均值，考察分析人员采用不同设备测定的精密度。精密量取10μl对照品溶液注入液相色谱仪，记录色谱图，重复测定6次。结果表明仪器的精密度良好。
[0066]
2.3.2中间精密度：按照实施例1配制供试品溶液。由不同的分析人员，间隔一天，在同一实验室分别采用两台的液相色谱仪测定其含量，每次取6份样品，计算其含量平均值(mg/g)。所有样品的含量的平均值是10.02mg/g，其rsd是1.05％。结果表明中间精密度良好。
[0067]
2.3.3样品的重复性试验
[0068]
按照实施例配制供试品溶液和对照品溶液。按照实施例1的色谱条件进行测定。平均值是9.74mg/g，其rsd是0.78％。结果表明具有良好的重复性。
[0069]
2.4定量限
[0070]
以信噪比为10：1时的样品浓度作为本品的定量限，精密称取黄芩苷对照品10.13mg(含量为94.0％)，加5wt％三正辛基氧化膦乙醇溶液逐步稀释，并过滤，备用。调试色谱仪，待基线平稳后取各不同浓度样品10μl进样，并记录色谱图；从色谱图可知：当供试品溶液浓度为0.0096μg/ml时主峰的信噪比为10：1，故本品的最小定量限为(0.0096μg/ml
×
10μl)0.096ng。定量限浓度样品连续进样6次，其主峰保留时间的rsd％是0.11％，峰面积的rsd％是1.45％，符合主峰保留时间rsd％不大于2.0％、主峰峰面积rsd％不大于5.0％的要求。
[0071]
2.5加样回收试验
[0072]
取本品，按80％、100％和l20％分别制备三个浓度，每个浓度各制备三份样品，在9份样品中分别加入等比例的本品对照品，照上法分别制备9份供试品溶液，进行加样回收试验。取上述溶液，按照实施例1的色谱条件进行测定。精密量取10μl注入液相色谱仪，记录色
谱图。另取对照品溶液，同法测定，按外标法以峰面积计算，即得。
[0073]
结果显示，在80％～120％的浓度范围内，回收率为99.01％～100.12％，rsd为0.35％～1.34％，符合95％～105％、rsd<5％的要求。实验结果表明，本品回收率试验良好。
[0074]
2.6溶液稳定性试验
[0075]
按照实施例1的方法配制供试品溶液，取续滤液于室温下放置12h，分别于第0、2、4、6、8、10、12小时后进样，测定其峰面积，考察溶液的稳定性。
[0076]
试验结果表明，各时间点的峰面积rsd为0.13％，本品在室温放置12小时基本稳定。
[0077]
2.7本品黄芩苷含量测定结果
[0078]
按照实施例1测定方法，对本品同一规格(每袋装4g)三批样品的黄芩苷含量进行测定，结果如下。
[0079]
小儿肺热咳喘颗粒黄芩苷含量测定结果
[0080]
批号150501150502150503黄芩苷含量mg/袋40.2140.2539.98
[0081]
另外，采用同一批供试品，按照实施例2
‑
8检测小儿肺热咳喘颗粒中黄芩含量测定。结果表明，各实施例黄芩峰保留时间、拖尾因子(小于1.1)和分离度(大于1.9)均符合要求。
[0082]
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。