灵活的检测系统的制作方法

灵活的检测系统
交叉引用
1.本技术要求2019年1月8日提交的美国临时专利申请号62/789,935的优先权，该美国临时专利的全部内容通过引用并入本文。


背景技术：

2.1942年，抗体首次用于组织切片分析，以使得来自注入了活细菌的小鼠的器官活检中的肺炎球菌抗原可视化。从那时起，免疫组织化学已成为临床诊断和基础研究的支柱。


技术实现要素：

3.本文提供的方法包括：使生物样本与缀合至第一寡核苷酸的抗体或抗体片段接触；使所述第一寡核苷酸与第二寡核苷酸的第一结合区接触；使所述第二寡核苷酸的第二结合区与第三寡核苷酸接触，其中所述第三寡核苷酸包含检测组分；从而将所述生物样本连接地耦合到所述检测组分。在一些实施方案中，所述生物样本包含至少一种选自由以下组成的组中的组分：培养细胞、生物组织、生物流体、匀浆和未知生物样本。在一些实施方案中，所述生物样本包含选自由以下组成的组中的材料：人来源、小鼠来源、大鼠来源、牛来源、猪来源、绵羊来源、兔来源、猴来源、果蝇来源、青蛙来源、线虫来源、鱼类来源、仓鼠来源、豚鼠来源和土拨鼠来源。在一些实施方案中，所述生物样本包含选自由以下组成的组中的材料：动物来源、植物来源、细菌来源、真菌来源和原生生物来源。在一些实施方案中，所述生物样本包含选自由以下组成的组中的组分：病毒、病毒载体和朊病毒。在一些实施方案中，所述生物样本是新鲜的、冷冻的或固定的。在一些实施方案中，所述生物样本被固定在表面上。在一些实施方案中，所述表面是载玻片、板、孔、管、膜、薄膜或珠。在一些实施方案中，所述生物样本被固定在三维结构内。在一些实施方案中，所述三维结构为冷冻组织、石蜡块或冷冻液体。在一些实施方案中，所述抗体或抗体片段包含igg、igm、单克隆抗体、scfv、纳米抗体、fab或双抗体。在一些实施方案中，所述抗体或抗体片段对样本的元素具有特异性。在一些实施方案中，所述样本的所述元素是冷冻固定的样本、蛋白质、dna分子、rna分子或脂质。在一些实施方案中，所述第一寡核苷酸包含多个核糖核酸。在一些实施方案中，所述第一寡核苷酸包含多个脱氧核糖核酸。在一些实施方案中，所述第一寡核苷酸为至少5、至少10、至少15、至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少95或至少100个核苷酸长。在一些实施方案中，所述第一寡核苷酸的长度为10
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100个核苷酸。在一些实施方案中，所述第一寡核苷酸为不超过5、不超过10、不超过15、不超过20、不超过25、不超过30、不超过35、不超过40、不超过45、不超过50、不超过55、不超过60、不超过65、不超过70、不超过75、不超过80、不超过85、不超过90、不超过95或不超过100个核苷酸长。在一些实施方案中，所述第一寡核苷酸包含一个或多个合成核苷酸。在一些实施方案中，所述第一寡核苷酸是完全单链的。在一些实施方案中，所述第一寡核苷酸是部分双链
的。在一些实施方案中，所述第二寡核苷酸的所述第一结合区与所述第一寡核苷酸的至少一部分互补。在一些实施方案中，第二寡核苷酸的所述第一结合区为至少5、至少10、至少15、至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少95或至少100个核苷酸长。在一些实施方案中，第二寡核苷酸的所述第一结合区的长度为5
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100个核苷酸。在一些实施方案中，第二寡核苷酸的所述第一结合区为不超过5、不超过10、不超过15、不超过20、不超过25、不超过30、不超过35、不超过40、不超过45、不超过50、不超过55、不超过60、不超过65、不超过70、不超过75、不超过80、不超过85、不超过90、不超过95或不超过100个核苷酸长。在一些实施方案中，所述第二寡核苷酸的所述第一结合区包含一个或多个合成核苷酸。在一些实施方案中，所述第二寡核苷酸包含多个核糖核酸。在一些实施方案中，所述第二寡核苷酸包含多个脱氧核糖核酸。在一些实施方案中，所述第二寡核苷酸为至少5、至少10、至少15、至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少95或至少100个核苷酸长。在一些实施方案中，所述第二寡核苷酸的长度为10
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100个核苷酸。在一些实施方案中，所述第二寡核苷酸为不超过5、不超过10、不超过15、不超过20、不超过25、不超过30、不超过35、不超过40、不超过45、不超过50、不超过55、不超过60、不超过65、不超过70、不超过75、不超过80、不超过85、不超过90、不超过95或不超过100个核苷酸长。在一些实施方案中，所述第二寡核苷酸包含一个或多个合成核苷酸。在一些实施方案中，所述第二寡核苷酸是完全单链的。在一些实施方案中，所述第二寡核苷酸是部分双链的。在一些实施方案中，所述第二寡核苷酸的所述第二结合区为至少5、至少10、至少15、至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少95或至少100个核苷酸长。在一些实施方案中，所述第二寡核苷酸的所述第二结合区的长度为5
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100个核苷酸。在一些实施方案中，所述第二寡核苷酸的所述第二结合区为不超过5、不超过10、不超过15、不超过20、不超过25、不超过30、不超过35、不超过40、不超过45、不超过50、不超过55、不超过60、不超过65、不超过70、不超过75、不超过80、不超过85、不超过90、不超过95或不超过100个核苷酸长。在一些实施方案中，所述第二寡核苷酸的所述第二结合区包含一个或多个合成核苷酸。在一些实施方案中，所述第二寡核苷酸的所述第二结合区与所述第三寡核苷酸的至少一部分互补。在一些实施方案中，所述第三寡核苷酸包含多个核糖核酸。在一些实施方案中，所述第三寡核苷酸包含多个脱氧核糖核酸。在一些实施方案中，所述第三寡核苷酸为至少5、至少10、至少15、至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少95或至少100个核苷酸长。在一些实施方案中，所述第三寡核苷酸的长度为10
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100个核苷酸。在一些实施方案中，所述第三寡核苷酸为不超过5、不超过10、不超过15、不超过20、不超过25、不超过30、不超过35、不超过40、不超过45、不超过50、不超过
55、不超过60、不超过65、不超过70、不超过75、不超过80、不超过85、不超过90、不超过95或不超过100个核苷酸长。在一些实施方案中，所述第二寡核苷酸的所述第三结合区包含一个或多个合成核苷酸。在一些实施方案中，所述第三寡核苷酸是完全单链的。在一些实施方案中，所述第三寡核苷酸是部分双链的。在一些实施方案中，所述第三寡核苷酸与所述第二寡核苷酸的所述第二结合区部分互补。在一些实施方案中，所述第三寡核苷酸与所述第二寡核苷酸的所述第二结合区完全互补。在一些实施方案中，所述检测组分包括荧光团、放射性同位素或能够产生比色反应的化合物。在一些实施方案中，所述检测组分位于所述第三寡核苷酸的3'端。在一些实施方案中，所述检测组分位于所述第三寡核苷酸的5'端。在一些实施方案中，所述检测组分位于所述第三寡核苷酸的3'端和5'端之间。在一些实施方案中，所述检测组分被去除。一些实施方案进一步包括在使所述样本与所述抗体或抗体片段接触之前将所述生物样本固定在表面上的步骤。一些实施方案进一步包括在使所述第二寡核苷酸的所述第二结合区与所述第三寡核苷酸接触之后检测所述检测组分。在一些实施方案中，所述方法以逐步的方式进行。在一些实施方案中，同时进行一个或多个步骤。在一些实施方案中，在使所述第二寡核苷酸的所述第二结合区与所述第三寡核苷酸接触之后进行激光捕获显微切割。
4.本文还提供了试剂盒，其包含：与第一寡核苷酸缀合的抗体或抗体片段；包含第一结合区和第二结合区的第二寡核苷酸，其中所述第二寡核苷酸的第一结合区与所述第一寡核苷酸的至少一部分互补；和包含检测组分的第三寡核苷酸，其中所述第二寡核苷酸的所述第二结合区与所述第三寡核苷酸的至少一部分互补。在一些实施方案中，所述抗体或抗体片段包含igg、igm、单克隆抗体、scfv、纳米抗体、fab或双抗体。在一些实施方案中，非特异性结合抗体包含小于1％、小于2％、小于3％、小于4％、小于5％、小于10％、小于15％、小于20％、小于25％、小于30％、小于35％或小于40％的与样本结合的所述抗体。在一些实施方案中，所述第一寡核苷酸包含多个核糖核酸。在一些实施方案中，所述第一寡核苷酸包含多个脱氧核糖核酸。在一些实施方案中，所述第一寡核苷酸为至少5、至少10、至少15、至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少95或至少100个核苷酸长。在一些实施方案中，所述第一寡核苷酸的长度为10
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100个核苷酸。在一些实施方案中，所述第一寡核苷酸为不超过5、不超过10、不超过15、不超过20、不超过25、不超过30、不超过35、不超过40、不超过45、不超过50、不超过55、不超过60、不超过65、不超过70、不超过75、不超过80、不超过85、不超过90、不超过95或不超过100个核苷酸长。在一些实施方案中，所述第一寡核苷酸包含一个或多个合成核苷酸。在一些实施方案中，所述第一寡核苷酸是完全单链的。在一些实施方案中，所述第一寡核苷酸是部分双链的。在一些实施方案中，所述第二寡核苷酸的所述第一结合区与所述第一寡核苷酸的至少一部分互补。在一些实施方案中，第二寡核苷酸的所述第一结合区为至少5、至少10、至少15、至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少95或至少100个核苷酸长。在一些实施方案中，第二寡核苷酸的所述第一结合区的长度为5
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100个核苷酸。在一些实施方案中，
第二寡核苷酸的所述第一结合区为不超过5、不超过10、不超过15、不超过20、不超过25、不超过30、不超过35、不超过40、不超过45、不超过50、不超过55、不超过60、不超过65、不超过70、不超过75、不超过80、不超过85、不超过90、不超过95或不超过100个核苷酸长。在一些实施方案中，所述第二寡核苷酸的所述第一结合区包含一个或多个合成核苷酸。在一些实施方案中，所述第二寡核苷酸包含多个核糖核酸。在一些实施方案中，所述第二寡核苷酸包含多个脱氧核糖核酸。在一些实施方案中，所述第二寡核苷酸为至少5、至少10、至少15、至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少95或至少100个核苷酸长。在一些实施方案中，所述第二寡核苷酸的长度为10
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100个核苷酸。在一些实施方案中，所述第二寡核苷酸为不超过5、不超过10、不超过15、不超过20、不超过25、不超过30、不超过35、不超过40、不超过45、不超过50、不超过55、不超过60、不超过65、不超过70、不超过75、不超过80、不超过85、不超过90、不超过95或不超过100个核苷酸长。在一些实施方案中，所述第二寡核苷酸包含一个或多个合成核苷酸。在一些实施方案中，所述第二寡核苷酸是完全单链的。在一些实施方案中，所述第二寡核苷酸是部分双链的。在一些实施方案中，所述第二寡核苷酸的所述第二结合区为至少5、至少10、至少15、至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少95或至少100个核苷酸长。在一些实施方案中，所述第二寡核苷酸的所述第二结合区的长度为5
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100个核苷酸。在一些实施方案中，所述第二寡核苷酸的所述第二结合区为不超过5、不超过10、不超过15、不超过20、不超过25、不超过30、不超过35、不超过40、不超过45、不超过50、不超过55、不超过60、不超过65、不超过70、不超过75、不超过80、不超过85、不超过90、不超过95或不超过100个核苷酸长。在一些实施方案中，所述第二寡核苷酸的所述第二结合区包含一个或多个合成核苷酸。在一些实施方案中，所述第二寡核苷酸的所述第二结合区与所述第三寡核苷酸的至少一部分互补。在一些实施方案中，所述第三寡核苷酸包含多个核糖核酸。在一些实施方案中，所述第三寡核苷酸包含多个脱氧核糖核酸。在一些实施方案中，所述第三寡核苷酸为至少5、至少10、至少15、至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少95或至少100个核苷酸长。在一些实施方案中，所述第三寡核苷酸的长度为10
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100个核苷酸。在一些实施方案中，所述第三寡核苷酸为不超过5、不超过10、不超过15、不超过20、不超过25、不超过30、不超过35、不超过40、不超过45、不超过50、不超过55、不超过60、不超过65、不超过70、不超过75、不超过80、不超过85、不超过90、不超过95或不超过100个核苷酸长。在一些实施方案中，所述第二寡核苷酸的所述第三结合区包含一个或多个合成核苷酸。在一些实施方案中，所述第三寡核苷酸是完全单链的。在一些实施方案中，所述第三寡核苷酸是部分双链的。在一些实施方案中，所述第三寡核苷酸与所述第二寡核苷酸的所述第二结合区部分互补。在一些实施方案中，所述第三寡核苷酸与所述第二寡核苷酸的所述第二结合区完全互补。在一些实施方案中，所述检测组分包括荧光团、放射性同位素或能够产生比色反应的化
合物。在一些实施方案中，所述检测组分位于所述第三寡核苷酸的3'端。在一些实施方案中，所述检测组分位于所述第三寡核苷酸的5'端。在一些实施方案中，所述检测组分位于所述第三寡核苷酸的3'端和5'端之间。在一些实施方案中，所述检测组分可被去除。
5.本文还提供了组合物，其包含：与第一寡核苷酸缀合的抗体或抗体片段；其中所述第一寡核苷酸通过碱基对连接到第二寡核苷酸的第一结合区；其中所述第二寡核苷酸的第二结合区通过碱基对与第三寡核苷酸连接；并且其中所述第三寡核苷酸包含检测组分。在一些实施方案中，所述抗体或抗体片段包含igg、igm、单克隆抗体、scfv、纳米抗体、fab或双抗体。在一些实施方案中，非特异性结合抗体包含小于1％、小于2％、小于3％、小于4％、小于5％、小于10％、小于15％、小于20％、小于25％、小于30％、小于35％或小于40％的与样本结合的所述抗体。在一些实施方案中，所述第一寡核苷酸包含多个核糖核酸。在一些实施方案中，所述第一寡核苷酸包含多个脱氧核糖核酸。在一些实施方案中，所述第一寡核苷酸为至少5、至少10、至少15、至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少95或至少100个核苷酸长。在一些实施方案中，所述第一寡核苷酸的长度为10
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100个核苷酸。在一些实施方案中，所述第一寡核苷酸为不超过5、不超过10、不超过15、不超过20、不超过25、不超过30、不超过35、不超过40、不超过45、不超过50、不超过55、不超过60、不超过65、不超过70、不超过75、不超过80、不超过85、不超过90、不超过95或不超过100个核苷酸长。在一些实施方案中，所述第一寡核苷酸包含一个或多个合成核苷酸。在一些实施方案中，所述第一寡核苷酸是完全单链的。在一些实施方案中，所述第一寡核苷酸是部分双链的。在一些实施方案中，所述第二寡核苷酸的所述第一结合区与所述第一寡核苷酸的至少一部分互补。在一些实施方案中，第二寡核苷酸的所述第一结合区为至少5、至少10、至少15、至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少95或至少100个核苷酸长。在一些实施方案中，第二寡核苷酸的所述第一结合区的长度为5
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90或60
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100个核苷酸。在一些实施方案中，第二寡核苷酸的所述第一结合区为不超过5、不超过10、不超过15、不超过20、不超过25、不超过30、不超过35、不超过40、不超过45、不超过50、不超过55、不超过60、不超过65、不超过70、不超过75、不超过80、不超过85、不超过90、不超过95或不超过100个核苷酸长。在一些实施方案中，所述第二寡核苷酸的所述第一结合区包含一个或多个合成核苷酸。在一些实施方案中，所述第二寡核苷酸包含多个核糖核酸。在一些实施方案中，所述第二寡核苷酸包含多个脱氧核糖核酸。在一些实施方案中，所述第二寡核苷酸为至少5、至少10、至少15、至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少95或至少100个核苷酸长。在一些实施方案中，所述第二寡核苷酸的长度为10
‑
30、10
‑
50、10
‑
70、10
‑
100、20
‑
50、20
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70、20
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100、30
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50、30
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70、30
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100、40
‑
70、40
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100、50
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70、50
‑
100、60
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70、60
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80、60
‑
90或60
‑
100个核苷酸。在一些实施方案中，所述第二寡核苷酸为不超过5、不超过10、不超过15、不超过20、不超过25、不超过30、不超过35、不超过40、不超过45、不超过50、不超过55、不超过60、不超过65、不超过70、不超过75、不超过80、不超过85、不超过90、不超过95或不超过100个核苷酸
长。在一些实施方案中，所述第二寡核苷酸包含一个或多个合成核苷酸。在一些实施方案中，所述第二寡核苷酸是完全单链的。在一些实施方案中，所述第二寡核苷酸是部分双链的。在一些实施方案中，所述第二寡核苷酸的所述第二结合区为至少5、至少10、至少15、至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少95或至少100个核苷酸长。在一些实施方案中，所述第二寡核苷酸的所述第二结合区的长度为5
‑
10、10
‑
30、10
‑
50、10
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70、10
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100、20
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50、20
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70、20
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100、30
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50、30
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70、30
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100、40
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70、40
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70、50
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100、60
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70、60
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80、60
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90或60
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100个核苷酸。在一些实施方案中，所述第二寡核苷酸的所述第二结合区为不超过5、不超过10、不超过15、不超过20、不超过25、不超过30、不超过35、不超过40、不超过45、不超过50、不超过55、不超过60、不超过65、不超过70、不超过75、不超过80、不超过85、不超过90、不超过95或不超过100个核苷酸长。在一些实施方案中，所述第二寡核苷酸的所述第二结合区包含一个或多个合成核苷酸。根据权利要求1所述的方法，其中所述第二寡核苷酸的所述第二结合区与所述第三寡核苷酸的至少一部分互补。在一些实施方案中，所述第三寡核苷酸包含多个核糖核酸。在一些实施方案中，所述第三寡核苷酸包含多个脱氧核糖核酸。在一些实施方案中，所述第三寡核苷酸为至少5、至少10、至少15、至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少95或至少100个核苷酸长。在一些实施方案中，所述第三寡核苷酸的长度为10
‑
30、10
‑
50、10
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70、10
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100、20
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50、20
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70、20
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100、30
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50、30
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70、30
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100、40
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70、40
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70、50
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100、60
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70、60
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80、60
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90或60
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100个核苷酸。在一些实施方案中，所述第三寡核苷酸为不超过5、不超过10、不超过15、不超过20、不超过25、不超过30、不超过35、不超过40、不超过45、不超过50、不超过55、不超过60、不超过65、不超过70、不超过75、不超过80、不超过85、不超过90、不超过95或不超过100个核苷酸长。在一些实施方案中，所述第二寡核苷酸的所述第三结合区包含一个或多个合成核苷酸。在一些实施方案中，所述第三寡核苷酸是完全单链的。在一些实施方案中，所述第三寡核苷酸是部分双链的。在一些实施方案中，所述第三寡核苷酸与所述第二寡核苷酸的所述第二结合区部分互补。在一些实施方案中，所述第三寡核苷酸与所述第二寡核苷酸的所述第二结合区完全互补。在一些实施方案中，所述检测组分包括荧光团、放射性同位素或能够产生比色反应的化合物。在一些实施方案中，所述检测组分位于所述第三寡核苷酸的3'端。在一些实施方案中，所述检测组分位于所述第三寡核苷酸的5'端。在一些实施方案中，所述检测组分位于所述第三寡核苷酸的3'端和5'端之间。在一些实施方案中，所述检测组分被去除。援引并入
6.本说明书中提到的所有出版物、专利和专利申请都通过引用并入本文，其程度就好像每个单独的出版物、专利或专利申请被明确地并单独地指示通过引用并入一样。
附图说明
7.本发明的新颖特征在所附权利要求书中特别地阐述。通过参考以下对其中利用了本发明原理的说明性实施方案加以阐述的详细描述将获得对本发明的特征和优点的更好理解，并且在附图中：
8.图1示出了代表本文组合物的一些实施方案的示意图。1代表抗体或抗体片段。2代表第一寡核苷酸。3代表第二寡核苷酸。4代表第三寡核苷酸。5代表检测组分。
9.图2示出了本文描述的组合物可能如何出现的实例。变化可以包括但不限于：非结合区、突出端、环或额外的寡核苷酸。a代表其中第二寡核苷酸连接第一寡核苷酸和经标记的第三寡核苷酸的实例；b代表其中第三寡核苷酸与第二寡核苷酸完全互补的实例；c代表其中第一结合区包含与第一寡核苷酸不互补的部分的实例；d代表其中第一寡核苷酸可以具有二级结构的实例；e代表其中第一结合区没有延伸到第二寡核苷酸的边缘的实例；f代表其中与第二结合区结合的第三寡核苷酸的区段包含与第二结合区不互补的部分的实例；g代表其中第三寡核苷酸可以具有二级结构的实例；h代表其中第一结合区与第一寡核苷酸的末端不互补的实例；i代表其中第二寡核苷酸是环状的实例；j代表其中与第二结合区结合的第三寡核苷酸的区段包含与第二结合区不互补的区段并具有二级结构的实例；k代表其中第二结合区不延伸至第二寡核苷酸末端的实例；l代表其中第三寡核苷酸具有二级结构的实例；m代表其中第一结合区和第二结合区都不延伸到第二寡核苷酸的任一边缘的实例；n代表其中第二寡核苷酸可以是部分双链寡核苷酸的实例；o代表其中第三寡核苷酸可以是部分双链的实例；p代表其中第二寡核苷酸作为部分双链寡核苷酸可以包含三个部分互补的寡核苷酸的实例；q代表其中第二结合区被与第三寡核苷酸不互补的区域中断，而与第二结合区互补的第三寡核苷酸的区段被与第二寡核苷酸不互补的区域中断的实例。
10.图3示出了在检测组分是荧光团的情况下通过(i)单光子激发、(ii)双光子激发和(iii)三光子激发激活检测组分。
11.图4示出了检测组分的可能配置，其可包括位于第三寡核苷酸的任一端((i)和(ii))、在第三寡核苷酸的中间(iii)的检测组分，在第三寡核苷酸上的多个检测组分(iv)和fret检测系统((v)和(vi))。
具体实施方式
12.本文描述了用于鉴定生物样本的元素的方法、试剂盒和组合物。简而言之，可以使生物样本和与第一寡核苷酸缀合的抗体或抗体片段接触，使得抗体或抗体片段的至少一部分与生物样本的元素接触。抗体或抗体片段可以与可具有第一结合区的第一寡核苷酸缀合。然后第一寡核苷酸可以接触第二寡核苷酸。在一些情况下，第一寡核苷酸的第一结合区可以接触第二寡核苷酸的第一结合区。然后，第二寡核苷酸的第二结合区可以接触第三寡核苷酸，其中第三寡核苷酸可以包含检测组分。因此，生物样本的元素可以通过抗体或抗体片段和多个寡核苷酸连接到检测组分。然后可以检测检测组分以定性或定量确定生物样本的元素的存在。样本
13.样本可以是生物样本。样本可以是新鲜的、冷冻的或固定的(例如化学固定的)。样本可以来自动物、植物、细菌、真菌或原生生物来源。在一些情况下，样本可以是人、小鼠、大鼠、牛、猪、绵羊、猴、兔、果蝇、青蛙、线虫或土拨鼠的样本。样本可以包括细胞(例如，分离的细胞、永生化细胞、原代细胞、培养细胞或组织或生物体的细胞)、生物组织、生物流体、匀浆，或者它可以是未知样本。在一些情况下，样本可以包含病原体。病原体可以是经培养的或未培养的。病原体可以是样本的感染物。在一些情况下，病原体可以是供从其中收集样本
的生物体的细胞、体液、组织、器官或微生物组的感染物。在一些情况下，样本可包含病原体，其为酵母细胞、细菌细胞、病毒、病毒载体或朊病毒。
14.样本可以是组织切片。在一些情况下，组织切片可以指已经从受试者获得的、任选地固定、切片和安装在平坦表面例如显微镜载玻片上的一块组织。
15.样本可以是平面样本。在一些情况下，样本可以固定在表面上。在一些情况下，表面可以是载玻片、板、孔、管、膜、薄膜或珠。在一些情况下，样本可以接触载玻片。接触载玻片的样本可以附着在载玻片上，使得样本被有效地固定。这可以例如通过固定或通过冷冻样本来实现。同样，可以使用相同或相似的附着技术将样本固定在另一种类型的表面上。
16.在一些情况下，样本可以是福尔马林固定的石蜡包埋(ffpe)组织切片。ffpe可以指一块组织，例如从受试者获得的活检组织，其固定在例如福尔马林或甲醛中(例如，3％
‑
5％福尔马林或在磷酸盐缓冲盐水中的甲醛)或布因溶液，包埋在蜡中，切成薄片，然后安装在显微镜载玻片上。
17.样本可以是非平面样本。非平面样本可以是基本上不平坦的样本，例如，(例如，淋巴结、脑、肝脏等的)整个或部分器官支架，已经通过折射率匹配技术(例如清晰脂质交换丙烯酰胺杂交精细成像相容性组织水凝胶(clarity))使其变得透明。参见例如roberts等人,j vis exp.2016；(112):54025。可使用诸如苄醇/苯甲酸苄酯(babb)或苄基醚的清洁剂使试样透明。
18.样本可以使用醛、醇、氧化剂、汞剂、苦味酸盐或hope固定剂固定。在一些情况下，样本可以使用丙酮、甲醛、福尔马林、多聚甲醛、乙醇或甲醇固定。或者，可以使用热固定来固定样本。固定可以通过浸泡或灌注来实现。
19.在一些情况下，生物样本可以被冷冻。在一些情况下，生物样本可以在低于0℃、低于
‑
10℃、低于
‑
20℃、低于
‑
30℃、低于
‑
40℃、低于
‑
50℃、低于
‑
60℃、低于
‑
70℃或低于
‑
80℃下冷冻。
20.在一些情况下，生物样本可以三维形式固定。所述三维形式可以是冷冻块、石蜡块或冷冻液体。例如，生物样本可以是处于最佳切割温度(oct)化合物中的冷冻动物组织块。这种组织块可以被冷冻或固定。在一些情况下，可以切割组织块以显露表面，该表面可以是与抗体或抗体片段接触的表面。有时，块可以被切片，使得块的连续表面可以通过抗体或抗体片段接触。在这种情况下，可以获得作为三维或近似三维数据的数据。感兴趣的生物特征
21.样本可以包括感兴趣的生物特征。感兴趣的生物特征可以包括可以使用本文描述的方法测量的样本的任何部分。在一些情况下，感兴趣的生物特征可以包括可以通过与捕获剂结合被指示的样本的一部分。感兴趣的生物特征可以是控制特征例如用于归一化的管家特征(例如，肌动蛋白)，可以识别细胞的一部分的特征(例如，与细胞核、核膜、内质网、线粒体、细胞膜或细胞的其他部分相关的蛋白质)，可以识别细胞类型的特征(例如，细胞表面标志物或在特定细胞类型中表达的蛋白质，例如免疫细胞或癌细胞)，或感兴趣的另外特征。在一些情况下，感兴趣的生物特征可以是疾病的标志物，例如癌症、糖尿病、心脏病、肺病、自身免疫病、炎性疾病或另外类型的疾病。在一些情况下，感兴趣的生物特征可以是损伤的标志物或在创伤愈合过程中存在的标志物。在一些情况下，感兴趣的生物特征可以是可以指示健康细胞的标志物。在一些情况下，感兴趣的生物特征可以是用于诊断、药物发
现、研究、鉴定或优化目的的感兴趣的特征。在一些情况下，感兴趣的生物特征可以是抗原。在一些情况下，感兴趣的生物特征可以包括细胞壁、细胞核、细胞质、膜、角蛋白、肌纤维、胶原蛋白、骨、蛋白质、核酸(例如，mrna或基因组dna等)、脂肪等。感兴趣的生物特征也可以通过免疫组织学方法来指示，例如，使用与寡核苷酸连接的捕获剂。
22.样本可以包含可以使用本文的方法检测的许多感兴趣的生物特征。在一些情况下，本文方法的多路复用特征(例如，允许去除标记同时保持样本上的捕获剂完整，从而允许在单个样本上数次或多次迭代该方法)可用于检测许多感兴趣的生物特征。在一些情况下，可以检测至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少15、至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少95或至少100种感兴趣的生物特征。在一些情况下，可以检测约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约15、约20、约25、约30、约35、约40、约45、约50、约55、约60、约65、约70、约75、约80、约85、约90、约95或约100种感兴趣的生物特征。在一些情况下，使用本方法可以在样本中检测到比通过使用其他方法更多的生物特征，其他方法例如非多路复用方法、其中必须从样本中剥离捕获剂的方法、不包括向样本固定或交联捕获剂的方法、无扩增的方法或使用不同于rca的扩增方法的方法。
23.感兴趣的生物特征可以包括标志物。标志物可以是细胞内的分子，例如蛋白质，其可以告知细胞的类型、疾病状态、致病性、衰老性或其他特性。在一些情况下，标志物可以告知细胞类型，例如淋巴细胞、t细胞、b细胞、嗜中性粒细胞、巨噬细胞、生殖细胞、干细胞、神经细胞、癌细胞、健康细胞、老化细胞、感染细胞或属于特定器官的细胞(例如，心肌细胞、塞尔托利氏细胞、肝细胞、真皮细胞、甲状腺细胞、肺细胞、肠细胞，扁桃体细胞、肌肉细胞、骨细胞、诸如视杆细胞或视锥细胞的视网膜细胞，或另外器官的细胞)。在一些情况下，标志物可用于识别病原体。
24.标志物可以是疾病标志物。疾病标志物可以是可以改变形状、活性、数量、位置或它是否存在于具有给定疾病状态的细胞中的标志物(例如，蛋白质)。例如，疾病标志物可以包括癌症标志物(例如，乳腺癌标志物、胰腺癌标志物、淋巴瘤标志物、头颈癌标志物、胃癌标志物、睾丸癌标志物、白血病标志物、肝细胞癌标志物、肺癌标志物、黑色素瘤标志物、卵巢癌标志物、甲状腺癌标志物或另外类型的癌症的标志物)、传染病标志物(例如，由病原体引起的疾病的标志物，例如病原体上的标志物或被病原体感染的细胞或组织的标志物)，或遗传疾病标志物。
25.标志物可以是诊断标志物。诊断标志物可以是例如体内特定的生化物质，其具有特定的分子特征，使其可用于检测疾病、测量疾病的进展或治疗效果，或用于测量感兴趣的过程。
26.标志物可以是低级标志物，例如低级表面标志物。捕获剂
27.捕获剂可以是可以与样本结合的分子。在一些情况下，捕获剂可以结合样本的感兴趣的生物特征。在一些情况下，捕获剂可以与样本中生物特征上的互补位点特异性结合。简而言之，感兴趣的生物特征可以是可以使用捕获剂使用本文所述的方法检测的样本的特征。在一些情况下，感兴趣的生物特征可以被捕获剂结合。
28.捕获剂可以是能够结合生物特征的分子。在一些情况下，捕获剂可包含蛋白质、
肽、适体或寡核苷酸。在一些情况下，捕获剂可包含抗体或其抗原结合片段。在一些情况下，抗体或其抗原结合片段可包括分离的抗体或其抗原结合片段、纯化的抗体或其抗原结合片段、重组抗体或其抗原结合片段、修饰的抗体或其抗原结合片段、或合成抗体或其抗原结合片段。应当理解，本文所述的抗体可以如本领域已知的进行修饰。
29.作为抗体或其抗原结合片段的捕获剂可包含可变区。在一些情况下，可变区可包含抗体或其抗原结合片段的一部分，其可接触或特异性结合样本以与感兴趣的生物特征结合。可变区可以指抗体轻链可变区、抗体重链可变区或抗体轻链可变区和抗体轻链可变区的组合。在一些情况下，结合感兴趣的不同生物特征的捕获剂可包含氨基酸序列、蛋白质修饰、三维结构或其组合不同的可变区。
30.包含抗体或其抗原结合片段的捕获剂可包含抗体，或抗体片段可包含igg、igm、多克隆抗体、单克隆抗体、scfv、纳米抗体、fab或双抗体。在一些情况下，抗体或其抗原结合片段可以是小鼠、大鼠、兔、人、骆驼科动物或山羊来源的。在一些情况下，可以针对人、小鼠、大鼠、牛、猪、绵羊、猴、兔、果蝇、青蛙、线虫或土拨鼠抗原产生抗体或其抗原结合片段。在一些情况下，可以针对动物、植物、细菌、真菌或原生生物抗原产生抗体或其抗原结合片段。在一些情况下，可以针对病毒、病毒载体或朊病毒产生抗体或其抗原结合片段。
31.在一些情况下，该方法可以包括用多种捕获剂标记样本。该步骤包括使样本(例如，安装在平坦表面(如显微镜载玻片)上的ffpe切片)与所有捕获剂(在捕获剂可以结合到样本中感兴趣的生物特征的条件下全体地(en masse))接触。将抗体和适体结合到样本中的位点的方法是众所周知的。
32.捕获剂可以在缓冲液中。在一些情况下，可以将捕获剂应用于缓冲液中的样本。包含捕获剂的缓冲液可包含可允许捕获剂被配置或折叠成其中捕获剂可与感兴趣的生物特征结合的状态的特性。在一些情况下，包含捕获剂的缓冲液可包含可促进捕获剂与感兴趣的生物特征结合的特性。在一些情况下，包含捕获剂的缓冲液可包含对捕获剂无破坏性、对寡核苷酸无破坏性、对样本无破坏性或对感兴趣的生物特征无破坏性的特性。
33.捕获剂可以对感兴趣的生物特征具有特异性。在一些情况下，捕获剂可能仅对一种感兴趣的生物特征具有特异性。在一些情况下，捕获剂可对一感兴趣的生物特征具有特异性，该特异性可以大于该捕获剂对不同的感兴趣的生物特征的特异性。在一些情况下，捕获剂可对一种感兴趣的生物特征具有特异性，该特异性比该捕获剂对其他感兴趣的生物特征的特异性大得多使得该捕获剂可以用于可靠地检测第一感兴趣的生物特征。
34.捕获剂可以对样本的元素具有亲和力。在一些情况下，亲和力可以指抗体可与元素结合的速度或强度如何。亲和力有时可以用解离常数(kd)来描述。捕获剂可具有不超过10
‑4m、不超过10
‑5m、不超过10
‑6m、不超过10
‑7m、不超过10
‑8m、不超过10
‑9m、不超过10
‑
10
m、不超过10
‑
11
m、不超过10
‑
12
m、不超过10
‑
13
m或不超过10
‑
14
m的kd。在一些情况下，捕获剂可以具有约10
‑4m、约10
‑5m、约10
‑6m、约10
‑7m、约10
‑8m、约10
‑9m、约10
‑
10
m、约10
‑
11
m、约10
‑
12
m、约10
‑
13
m或约10
‑
14
m的kd。
35.捕获剂可以在感兴趣的生物特征上的结合位点处结合感兴趣的生物特征。例如，这样的结合位点可以是表位。在一些情况下，表位可以是感兴趣的生物特征的一部分。在这种情况下，感兴趣的生物特征可以包括抗原。在一些情况下，表位可以结合作为抗体或其抗原结合片段的捕获剂。在这种情况下，抗体或其抗原结合片段的可变区可以在其表位结合
感兴趣的生物特征。
36.在一些情况下，可以将捕获剂以过量应用于样本。
37.在一些情况下，在捕获剂与样本接触后，可以将其温育一段时间。在一些情况下，捕获剂可以在样本上温育至少30秒、至少1分钟、至少2分钟、至少3分钟、至少4分钟、至少5分钟、至少5分钟、至少10分钟、至少15分钟、至少20分钟、至少25分钟、至少30分钟、至少35分钟、至少40分钟、至少45分钟、至少50分钟、至少55分钟、至少60分钟、至少1.5小时、至少2小时、至少2.5小时、至少3小时、至少4小时、至少5小时或至少6小时。在一些情况下，捕获剂可以在样本上温育不超过30秒、不超过1分钟、不超过2分钟、不超过3分钟、不超过4分钟、不超过5分钟、不超过10分钟、不超过15分钟、不超过20分钟、不超过25分钟、不超过30分钟、不超过35分钟、不超过40分钟、不超过45分钟、不超过50分钟、不超过55分钟、不超过60分钟、不超过1.5小时，不超过2小时，不超过2.5小时，不超过3小时，不超过3.5小时，不超过4小时、不超过4.5小时、不超过5小时、不超过5.5小时或不超过6小时。在一些情况下，捕获剂可以在样本上温育30秒至6小时、30秒至3小时、30秒至60分钟、30秒至45分钟、30秒至30分钟、30秒至15分钟、30秒至5分钟、30秒至1分钟、1分钟至6小时、1分钟至3小时、1分钟至60分钟、1分钟至45分钟、1分钟至30分钟、1分钟至15分钟、1分钟至5分钟、5分钟至6小时、5分钟至3小时、5分钟至60分钟、5分钟至45分钟、5分钟至30分钟、5分钟至15分钟、15分钟至6小时、15分钟至3小时、15分钟至60分钟、15分钟至45分钟、15分钟至30分钟、30分钟至6小时，30分钟至3小时、30分钟至60分钟、30分钟至45分钟、45分钟至6小时、45分钟至3小时、45分钟至60分钟、60分钟至6小时、或60分钟至3小时。
38.在一些情况下，在样本与捕获剂接触后，可以允许捕获剂在给定温度下在样本上温育。可将捕获剂在约4℃、约5℃、约6℃、约7℃、约8℃、约9℃、约10℃、约11℃、约12℃、约13℃、约14℃、约15℃、约16℃、约17℃、约18℃、约19℃、约20℃、约21℃、约22℃、约23℃、约24℃、约25℃、约26℃、约27℃、约28℃、约29℃、约30℃、约35℃、约40℃、约45℃、约50℃或约55℃下在样本上温育。在一些情况下，可将捕获剂在至少4℃、至少5℃、至少6℃、至少7℃、至少8℃、至少9℃、至少10℃、至少11℃、至少12℃、至少13℃、至少14℃、至少15℃、至少15℃、至少16℃、至少17℃、至少18℃、至少19℃、至少20℃、至少21℃、至少22℃、至少23℃、至少24℃、至少25℃、至少26℃、至少27℃、至少28℃、至少29℃、至少30℃、至少35℃、至少40℃、至少45℃、至少50℃或至少55℃的温度下温育。在一些情况下，可将捕获剂在不超过4℃、不超过5℃、不超过6℃、不超过7℃、不超过8℃、不超过9℃、不超过10℃、不超过11℃、不超过12℃、不超过13℃、不超过14℃、不超过15℃、不超过16℃、不超过17℃、不超过18℃、不超过19℃、不超过20℃、不超过21℃、不超过22℃、不超过23℃、不超过24℃、不超过25℃、不超过26℃、不超过27℃、不超过28℃、不超过29℃、不超过30℃、不超过35℃、不超过40℃、不超过45℃、不超过50℃、或不超过55℃的温度下温育。在一些情况下，可将捕获剂在4℃至55℃、4℃至50℃、4℃至45℃、4℃至40℃、4℃至35℃、4℃至30℃、4℃至25℃、4℃至20℃、4℃至15℃、4℃至10℃、10℃至55℃、10℃至50℃、10℃至45℃、10℃至40℃、10℃至35℃、10℃至30℃、10℃至25℃、10℃至20℃、10℃至15℃、15℃至55℃、15℃至50℃、15℃至45℃、15℃至40℃、15℃至35℃、15℃至30℃、15℃至25℃、15℃至20℃、20℃至55℃、20℃至50℃、20℃至45℃、20℃至40℃、20℃至35℃、20℃至30℃、20℃至25℃、25℃至55℃、25℃至50℃、25℃至45℃、25℃至40℃、25℃至35℃、25℃至30℃、30℃至55℃、30℃至50℃、30℃至45℃、30℃
至40℃、30℃至35℃、35℃至55℃、35℃至50℃、35℃至45℃、35℃至40℃、40℃至55℃、40℃至50℃、40℃至45℃、45℃至55℃、45℃至50℃、或50℃至55℃的温度下温育。
39.在一些情况下，在样本与捕获剂接触后，可以洗掉过量的捕获剂。在一些情况下，可以使用洗涤缓冲液进行洗涤步骤。洗涤缓冲液可以是能够洗掉过量捕获剂而不显著影响样本、结合的捕获剂或与捕获剂结合的寡核苷酸的任何缓冲液。在一些情况下，洗涤缓冲液可包含pbs、pbs
‑
t、tbs、tbs
‑
t水、盐水或克雷布氏缓冲液。
40.在一些情况下，洗涤缓冲液可包含封闭组分。在洗涤缓冲液中发现的封闭组分可以是蛋白质封闭组分或核酸封闭组分。例如，洗涤缓冲液可包含bsa(牛血清白蛋白)作为蛋白质封闭组分。作为另一个实例，洗涤缓冲液可以包含剪切的鲑鱼
‑
dna作为核酸封闭组分。在一些情况下，洗涤缓冲液可包含多于一种封闭组分。在一些情况下，洗涤缓冲液可包含1、2、3、4、5或更多种封闭组分。一些洗涤缓冲液可以包含蛋白质封闭组分和核酸封闭组分的组合。封闭组分可包括任何可接受的封闭组分，包括本文所述的任何封闭组分或封闭剂。
41.可以在一次或多次洗涤中洗掉过量的捕获剂。在一些情况下，可以进行约1、约2、约3、约4、约5或约6次洗涤。在一些情况下，可以进行至少1次、至少2次、至少3次、至少4次、至少5次或至少6次洗涤。在一些情况下，可以进行不超过1次、不超过2次、不超过3次、不超过4次、不超过5次或不超过6次洗涤。在一些情况下，可以进行1至6、1至5、1至4、1至3、1至2、2至6、2至5、2至4、2至3、3至6、3至5、3至4、4至6、4至5或5至6次洗涤。
42.每次洗涤可持续约10秒、约15秒、约30秒、约1分钟、约2分钟、约3分钟、约4分钟、约5分钟、约10分钟或约15分钟。每次洗涤可以持续至少10秒、至少15秒、至少30秒、至少1分钟、至少2分钟、至少3分钟、至少4分钟、至少5分钟、至少10分钟、或至少15分钟。在一些情况下，洗涤可持续少于10秒。每次洗涤可持续最多10秒、最多15秒、最多30秒、最多1分钟、最多2分钟、最多3分钟、最多4分钟、最多5分钟、最多10分钟、或最多15分钟。在一些情况下，洗涤可持续大于15分钟。每次洗涤可为10秒至15分钟、10秒至10分钟、10秒至5分钟、10秒至1分钟、10秒至30秒、30秒至15分钟、30秒至10分钟、30秒至5分钟、30秒至1分钟、1分钟至15分钟、1分钟至10分钟、1分钟至5分钟、5分钟至15分钟、5分钟至10分钟、或10分钟至15分钟。
43.洗涤可在约4℃、约5℃、约6℃、约7℃、约8℃、约9℃、约10℃、约11℃、约12℃、约13℃、约14℃、约15℃、约16℃、约17℃、约18℃、约19℃、约20℃、约21℃、约22℃、约23℃、约24℃、约25℃、约26℃、约27℃、约28℃、约29℃、约30℃、约35℃、约40℃、约45℃、约50℃或约55℃的温度下。在一些情况下，洗涤可在至少4℃、至少5℃、至少6℃、至少7℃、至少8℃、至少9℃、至少10℃、至少11℃、至少12℃、至少13℃、至少14℃、至少15℃、至少15℃、至少16℃、至少17℃、至少18℃、至少19℃、至少20℃、至少21℃、至少22℃、至少23℃、至少24℃、至少25℃、至少26℃、至少27℃、至少28℃、至少29℃、至少30℃、至少35℃、至少40℃、至少45℃、至少50℃或至少55℃的温度下。在一些情况下，洗涤可在不超过4℃、不超过5℃、不超过6℃、不超过7℃、不超过8℃、不超过9℃、不超过10℃、不超过11℃、不超过12℃、不超过13℃、不超过14℃、不超过15℃、不超过16℃、不超过17℃、不超过18℃、不超过19℃、不超过20℃、不超过21℃、不超过22℃、不超过23℃、不超过24℃、不超过25℃、不超过26℃、不超过27℃、不超过28℃、不超过29℃、不超过30℃、不超过35℃、不超过40℃、不超过45℃、不超过50℃、或不超过55℃的温度下。在一些情况下，洗涤可在4℃至55℃、4℃至50℃、4℃至45℃、4℃至40℃、4℃至35℃、4℃至30℃、4℃至25℃、4℃至20℃、4℃至15℃、4℃至10℃、10℃至55
℃、10℃至50℃、10℃至45℃、10℃至40℃、10℃至35℃、10℃至30℃、10℃至25℃、10℃至20℃、10℃至15℃、15℃至55℃、15℃至50℃、15℃至45℃、15℃至40℃、15℃至35℃、15℃至30℃、15℃至25℃、15℃至20℃、20℃至55℃、20℃至50℃、20℃至45℃、20℃至40℃、20℃至35℃、20℃至30℃、20℃至25℃、25℃至55℃、25℃至50℃、25℃至45℃、25℃至40℃、25℃至35℃、25℃至30℃、30℃至55℃、30℃至50℃、30℃至45℃、30℃至40℃、30℃至35℃、35℃至55℃、35℃至50℃、35℃至45℃、35℃至40℃、40℃至55℃、40℃至50℃、40℃至45℃、45℃至55℃、45℃至50℃、或50℃至55℃的温度下。
44.在一些情况下，在接触生物样本时，抗体或抗体片段可以与生物样本的元素结合。抗体或抗体片段可以可逆地或不可逆地与生物样本的元素结合。抗体或抗体片段如何与生物样本的元素结合的实例可包括离子键或非离子键。
45.抗体或抗体片段可包含igg、igm、多克隆抗体、单克隆抗体、scfv、纳米抗体、fab或双抗体。在一些情况下，抗体或抗体片段可以是小鼠、大鼠、兔、人、骆驼科动物或山羊来源的。在一些情况下，可以针对人、小鼠、大鼠、牛、猪、绵羊、猴、兔、果蝇、青蛙、线虫或土拨鼠抗原产生抗体或抗体片段。在一些情况下，可以针对动物、植物、细菌、真菌或原生生物抗原产生抗体或抗体片段。在一些情况下，可以针对病毒、病毒载体或朊病毒产生抗体或抗体片段。
46.抗体或抗体片段可以对样本的元素具有灵敏度。在一些情况下，样本的元素可以包括蛋白质、dna分子、rna分子或脂质。在一些情况下，灵敏度可以指被抗体或抗体片段正确阳性鉴定的元素的分数。抗体或抗体片段可具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或至少99％的灵敏度。
47.抗体或抗体片段可以对样本的元素具有特异性。在一些情况下，样本的元素可以包括蛋白质、dna分子、rna分子或脂质。在一些情况下，特异性可以指抗体或抗体片段与给定元素结合的偏好超过其他元素。抗体或抗体片段可具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或至少99％的特异性。
48.抗体或抗体片段可以对样本的元素具有亲和力。在一些情况下，亲和力可以指抗体可与元素结合的速度或强度如何。亲和力有时可以用解离常数(kd)来描述。抗体或抗体片段可具有不超过10
‑4m、不超过10
‑5m、不超过10
‑6m、不超过10
‑7m、不超过10
‑8m、不超过10
‑9m、不超过10
‑
10
m、不超过10
‑
11
m、不超过10
‑
12
m、不超过10
‑
13
m或不超过10
‑
14
m的亲和力。
49.抗体或抗体片段可以与至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的生物样本的元素结合。在一些情况下，与生物样本接触后结合的抗体的至少50％、60％、70％、80％或90％可以与生物样本的元素结合。在一些情况下，非特异性结合抗体包含小于1％、小于2％、小于3％、小于4％、小于5％、小于10％、小于15％、小于20％、小于25％、小于30％、小于35％或小于40％的与样本结合的所述抗体。在一些情况下，未与样本结合的抗体可以在最多1、2、3、4、5、10、20、30、40、50或60分钟温育后被洗掉。在一些情况下，未与样本结合的抗体可在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12小时内的温育后被洗掉。在一些情况下，未与样本结合的抗体可以在0.5、1、2、3、4或5天内长的温育后被洗掉。固定和交联
50.捕获剂可以固定到样本。在一些情况下，只有与感兴趣的生物特征结合的捕获剂才能固定到样本。在一些情况下，与感兴趣的生物特征结合的所有捕获剂可固定到样本。在
一些情况下，可以在过量(例如，未结合的)捕获剂被洗掉后进行将捕获剂固定到样本。
51.在一些实施方案中，捕获剂可以交联或固定到样本，从而防止捕获剂在后续步骤中解离。在一些情况下，交联可以防止捕获剂在rca反应期间或在灭活或去除一种或多种标记期间解离。因此，捕获剂与样本的固定或交联可以允许在样本上进行rca反应(而不是在溶液中)，并且可以通过允许进行读取的多次迭代来允许多路复用的测定，因为可以在不干扰捕获剂的情况下去除或灭活标记。该交联步骤可以使用任何胺
‑
胺交联剂(例如甲醛、二琥珀酰亚胺基月桂酸酯(disuccinimiyllutarate)或另一种类似作用的试剂)来完成，但如果需要，可以使用多种其他化学物质将捕获剂交联至样本。寡核苷酸
52.寡核苷酸可以是一种分子，该分子可以是核苷酸链。本文的方法、试剂盒和组合物可包含三种寡核苷酸。在一些情况下，第一寡核苷酸可以接触第二寡核苷酸，而第二寡核苷酸可以接触第三寡核苷酸。本文所述的寡核苷酸可包含核糖核酸。本文所述的寡核苷酸可包含脱氧核糖核酸。在一些情况下，寡核苷酸可以是任何序列，包括用户指定的序列。可以设计序列的一部分，例如用户指定的序列，使得它可以与另一寡核苷酸互补。在一些情况下，三个寡核苷酸可以被用户设计为使得第一寡核苷酸的一部分可以与第二寡核苷酸的第一部分互补，并且第二寡核苷酸的第二部分可以与第三寡核苷酸的一部分互补。
53.有时，寡核苷酸可包含核酸碱基g、a、t、c、u或其组合，或能够与互补核苷酸可靠地碱基配对的碱基。7
‑
脱氮
‑
腺嘌呤、7
‑
脱氮
‑
鸟嘌呤、腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶、2
‑
脱氮
‑2‑
硫代
‑
鸟苷、2
‑
硫代
‑7‑
脱氮
‑
鸟苷、2
‑
硫代
‑
腺嘌呤、2
‑
硫代
‑7‑
脱氮
‑
腺嘌呤、异鸟嘌呤、7
‑
脱氮
‑
鸟嘌呤、5,6
‑
二氢尿苷、5,6
‑
二氢胸腺嘧啶、黄嘌呤、7
‑
脱氮
‑
黄嘌呤、次黄嘌呤、7
‑
脱氮
‑
黄嘌呤、2,6
‑
二氨基
‑7‑
脱氮嘌呤、5
‑
甲基
‑
胞嘧啶、5
‑
丙炔基
‑
尿苷、5
‑
丙炔基
‑
胞苷、2
‑
硫代
‑
胸腺嘧啶或2
‑
硫代
‑
尿苷是此类碱基的实例，但许多其他碱基是已知的。例如，寡核苷酸可以是lna、pna、una或吗啉代寡聚体。本文使用的寡核苷酸可包含天然或非天然核苷酸或键。
54.在本文中，捕获剂如抗体或抗体片段可以与第一寡核苷酸缀合，使得抗体或抗体片段的至少一部分与生物样本的元素接触。然后第一寡核苷酸可以接触第二寡核苷酸的第一结合区。然后，第二寡核苷酸的第二结合区可以接触第三寡核苷酸，其中第三寡核苷酸可以包含检测组分。
55.在一些情况下，可以使用捕获剂上的任何合适的化学部分将寡核苷酸直接缀合或结合至捕获剂。在一些情况下，寡核苷酸可以例如通过连接酶促地连接至捕获剂。在一些情况下，寡核苷酸可以通过如下间接连接到捕获剂：例如通过非共价相互作用如生物素/链霉亲和素相互作用或其等同作用，通过适体或二抗，或通过蛋白质
‑
蛋白质相互作用，例如亮氨酸
‑
拉链标签相互作用等。
56.在一些情况下，可以使用点击化学或类似方法将寡核苷酸与捕获剂结合。点击化学可以指一类生物相容性小分子反应，其可允许分子的连接，例如寡核苷酸和捕获剂。点击反应可以是一锅反应，并且在一些情况下不受水的干扰。点击反应可以产生最少的副产品、无害的副产品或没有副产品。点击反应可以由大的热力学力驱动。在一些情况下，点击反应可以被快速和/或不可逆地驱动到高产率的单一反应产物(例如，与捕获剂缀合的寡核苷酸)，并且可以具有高反应特异性。点击反应可以包括但不限于[3 2]环加成、硫醇
‑
烯反应、
diels
‑
alder反应、逆电子需求diels
‑
alder反应、[4 1]环加成、亲核取代、脲的羰基化学样形成、或碳碳双键的加成反应(例如，二羟基化)。
[0057]
在一些情况下，第一寡核苷酸可包含多个核糖核酸(rna)。在一些情况下，第一寡核苷酸可包含多个脱氧核糖核酸(dna)。在选定的情况下，第一寡核苷酸可包含一个或多个合成核苷酸。合成核苷酸的实例可包括rna类似物或dna类似物。一些合成核苷酸可包含人工核酸，其可包含肽核酸、吗啉代和锁核酸、二醇核酸或苏糖核酸。
[0058]
第一寡核苷酸可以具有适合于应用的给定长度。在一些情况下，可以选择较长的寡核苷酸。在一些情况下，可选择较短的寡核苷酸。在一些情况下，在选择寡核苷酸长度时可以评估利弊，其中利弊可以包括解链温度、二级结构、三级结构、亲和力、特异性、选择性、成本或可能的条形码的数量。
[0059]
在一些情况下，第一寡核苷酸可为至少5、至少10、至少15、至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少95或至少100个核苷酸长。
[0060]
在一些情况下，第一寡核苷酸的长度可为10
‑
30、10
‑
50、10
‑
70、10
‑
100、20
‑
50、20
‑
70、20
‑
100、30
‑
50、30
‑
70、30
‑
100、40
‑
70、40
‑
100、50
‑
70、50
‑
100、60
‑
70、60
‑
80、60
‑
90或60
‑
100个核苷酸。
[0061]
在一些情况下，第一寡核苷酸可以不超过5、不超过10、不超过15、不超过20、不超过25、不超过30、不超过35、不超过40、不超过45、不超过50、不超过55、不超过60、不超过65、不超过70、不超过75、不超过80、不超过85、不超过90、不超过95或不超过100个核苷酸长。
[0062]
在一些情况下，第一寡核苷酸可以是完全单链的。在一些情况下，第一寡核苷酸可以是部分双链的。在一些情况下，部分双链区可以位于核苷酸的3'端、核苷酸的5'端或核苷酸的5'端和3'端之间。在一些情况下，可以有多于一个的双链区。一些第一寡核苷酸可具有二级结构、三级结构。一些第一寡核苷酸可具有二级结构，使得单链的折叠和/或其与自身的互补性可以产生一个或多个包含单链的双链区。
[0063]
第二寡核苷酸可以在第二寡核苷酸的第一结合区接触第一寡核苷酸。这种相互作用可以通过碱基配对发生。
[0064]
第二寡核苷酸的第一结合区可以与所述第一寡核苷酸的至少一部分互补。在一些情况下，第一结合区可以与第一寡核苷酸的3'端互补。在一些情况下，第一结合区可以与第一寡核苷酸的5'端互补。在一些情况下，第一结合区可以与第一寡核苷酸的3'端和5'端之间的区域互补。在一些情况下，第一结合区可以与整个寡核苷酸互补。在一些情况下，第一结合区可以与第一寡核苷酸的小于100％互补。
[0065]
在一些情况下，此类第一结合区可以能够与第一寡核苷酸杂交。在一些情况下，此类第一结合区可以与所述第一寡核苷酸的至少一部分互补。在一些情况下，此类第一结合区可以是至少5、至少10、至少15、至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少95或至少100个核苷酸长。在一些情况下，此类第一结合区的长度可以在5
‑
10、10
‑
30、10
‑
50、10
‑
70、10
‑
100、20
‑
50、20
‑
70、20
‑
100、30
‑
50、30
‑
70、30
‑
100、40
‑
70、40
‑
100、50
‑
70、50
‑
100、60
‑
70、60
‑
80、60
‑
90或60
‑
100个核苷酸。在一些情况下，此类第一结合区可以不超过5、不超过10、不超过15、不超过20、不超过25、不超过30、不超过35、不超过40、不超过45、不超过50、不超过55、不超
过60、不超过65、不超过70、不超过75、不超过80、不超过85、不超过90、不超过95或不超过100个核苷酸长。在一些情况下，此类第一结合区可包含一个或多个合成核苷酸。
[0066]
在一些情况下，第二寡核苷酸可为至少5、至少10、至少15、至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少95或至少100个核苷酸长。
[0067]
在一些情况下，第二寡核苷酸的长度可为10
‑
30、10
‑
50、10
‑
70、10
‑
100、20
‑
50、20
‑
70、20
‑
100、30
‑
50、30
‑
70、30
‑
100、40
‑
70、40
‑
100、50
‑
70、50
‑
100、60
‑
70、60
‑
80、60
‑
90或60
‑
100个核苷酸。
[0068]
在一些情况下，第二寡核苷酸可以不超过5、不超过10、不超过15、不超过20、不超过25、不超过30、不超过35、不超过40、不超过45、不超过50、不超过55、不超过60、不超过65、不超过70、不超过75、不超过80、不超过85、不超过90、不超过95或不超过100个核苷酸长。
[0069]
在一些情况下，第二寡核苷酸可以是完全单链的。在一些情况下，第一寡核苷酸可以是部分双链的。在一些情况下，部分双链区可以位于核苷酸的3'端、核苷酸的5'端或核苷酸的5'端和3'端之间。在一些情况下，可以有多于一个的双链区。一些第二寡核苷酸可具有二级结构或三级结构。一些第二寡核苷酸可具有二级结构，使得单链的折叠和/或其与自身的互补性可以产生一个或多个包含单链的双链区。在一些情况下，第二寡核苷酸可以包含多于一个的寡核苷酸。在一些情况下，可以形成寡核苷酸链，将第一寡核苷酸与第三寡核苷酸连接。
[0070]
第三寡核苷酸可以在第二寡核苷酸的第二结合区接触第二寡核苷酸。这种相互作用可以通过碱基配对发生。
[0071]
第二寡核苷酸的第二结合区可以与所述第三寡核苷酸的至少一部分互补。在一些情况下，第二结合区可以与第三寡核苷酸的3'端互补。在一些情况下，第二结合区可以与第三寡核苷酸的5'端互补。在一些情况下，第二结合区可以与第三寡核苷酸的3'端和5'端之间的区域互补。在一些情况下，第二结合区可以与整个第三寡核苷酸互补。在一些情况下，第二结合区可以与第三寡核苷酸的小于100％互补。
[0072]
在一些情况下，此类第二结合区可以能够与第一寡核苷酸杂交。在一些情况下，此类第二结合区可以与所述第一寡核苷酸的至少一部分互补。在一些情况下，此类第二结合区可以是至少5、至少10、至少15、至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少95或至少100个核苷酸长。在一些情况下，此类第二结合区的长度可以在5
‑
10、10
‑
30、10
‑
50、10
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70、10
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100、20
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50、20
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70、20
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50、30
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70、30
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100、40
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70、40
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70、50
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90或60
‑
100个核苷酸。在一些情况下，此类第二结合区可以不超过5、不超过10、不超过15、不超过20、不超过25、不超过30、不超过35、不超过40、不超过45、不超过50、不超过55、不超过60、不超过65、不超过70、不超过75、不超过80、不超过85、不超过90、不超过95或不超过100个核苷酸长。在一些情况下，此类第二结合区可包含一个或多个合成核苷酸。
[0073]
在一些情况下，第三寡核苷酸可为至少5、至少10、至少15、至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少95或至少100个核苷酸长。
[0074]
在一些情况下，第三寡核苷酸的长度可为10
‑
30、10
‑
50、10
‑
70、10
‑
100、20
‑
50、20
‑
70、20
‑
100、30
‑
50、30
‑
70、30
‑
100、40
‑
70、40
‑
100、50
‑
70、50
‑
100、60
‑
70、60
‑
80、60
‑
90或60
‑
100个核苷酸。
[0075]
在一些情况下，第三寡核苷酸可以不超过5、不超过10、不超过15、不超过20、不超过25、不超过30、不超过35、不超过40、不超过45、不超过50、不超过55、不超过60、不超过65、不超过70、不超过75、不超过80、不超过85、不超过90、不超过95或不超过100个核苷酸长。
[0076]
在一些情况下，第三寡核苷酸可以是完全单链的。在一些情况下，第三寡核苷酸可以是部分双链的。在一些情况下，部分双链区可以位于核苷酸的3'端、核苷酸的5'端或核苷酸的5'端和3'端之间。在一些情况下，可能有多于一个的双链区。一些第三寡核苷酸可以具有二级结构。一些第三寡核苷酸可具有二级结构，使得单链的折叠和/或其与自身的互补性可以产生一个或多个包含单链的双链区。在一些情况下，第二寡核苷酸可以包含多于一个的寡核苷酸。在一些情况下，可以形成寡核苷酸链，将第一寡核苷酸与第三寡核苷酸连接。检测组分
[0077]
如本文所述，检测组分可附于最后的寡核苷酸。检测组分的实例可以包括例如标记。检测组分可以是荧光团、放射性同位素、能够进行比色反应的分子或磁性颗粒。
[0078]
在一些实施方案中，检测到的信号可以通过荧光共振能量转移(fret)产生，而在其他实施方案中，检测可以通过拉曼光谱、红外检测或磁/电气检测进行。在一些实施方案中，检测步骤可涉及二级核酸扩增步骤，包括但不限于杂交链反应、分支dna(bdna)扩增等。
[0079]
在一些情况下，可以去除检测组分。去除可以通过洗涤、通过切割、通过酶促反应、通过降解、通过化学改变或通过其他方式来完成。
[0080]
可用于主题方法的合适的可区分荧光标记对包括cy
‑
3和cy
‑
5(amersham inc.,piscataway,nj)、quasar 570和quasar 670(biosearch technology,novato ca)、alexafluor555和alexafluor647(molecular probes,eugene,or)、bodipy v
‑
1002和bodipy v1005(molecular probes,eugene,or)、popo
‑
3和toto
‑
3(molecular probes,eugene,or)以及popr03和topr03(molecular probes,eugene,or)。其他合适的可区分可检测标记可在kricka等人，(ann clin biochem.39:114
‑
29,2002)、ried等人，(proc.natl.acad.sci.1992:89:1388
‑
1392)和tanke等人，(eur.j.hum.genet.1999 7:2
‑
11)等中获悉。在一些实施方案中，可以使用三种或四种可区分的染料。感兴趣的特定荧光染料包括：呫吨染料，例如荧光素和罗丹明染料，例如异硫氰酸荧光素(fitc)、6
‑
羧基荧光素(通常称为缩写fam和f)、6
‑
羧基
‑
2',4',7',4,7
‑
六氯荧光素(hex)、6
‑
羧基
‑
4',5
’‑
二氯
‑
2',7'
‑
二甲基荧光素(joe或j)、n,n,n',n'
‑
四甲基
‑6‑
羧基罗丹明(tamra或t)、6
‑
羧基
‑
x
‑
罗丹明(rox或r)、5
‑
羧基罗丹明
‑
6g(r6g5或g5)、6
‑
羧基罗丹明
‑
6g(r6g6或g6)和罗丹明110；花青染料，例如cy3、cy5和cy7染料；香豆素，例如伞形酮；苯甲酰亚胺染料，例如赫斯特33258；菲啶染料，例如德克萨斯红；乙锭染料；吖啶染料；咔唑染料；吩噁嗪染料；卟啉染料；聚甲炔染料，例如bodipy染料和喹啉染料。主题应用中常用的感兴趣的特定荧光团包括：芘、香豆素、二乙基氨基香豆素、fam、荧光素氯三嗪基、荧光素、rl 10、伊红、joe、r6g、四甲基罗丹明、tamra、丽丝胺、萘基荧光素、德克萨斯红、cy3和cy5等。在一些实施方案中，在每个探针子集内，可选择荧光团以使得它们彼此可区分，即，可独立检测，意味着即使当标记被混合时标记也可以被独立检测和测量。换句话说，对于每个标记所存在的标记的量(例如，荧光量)是可单独确定的，即使当标记共同定位(例如，在同一管中或在切片的同一区域
中)时。
[0081]
标记可以是例如，前荧光团(pro
‑
fluorophore)、二级可激活荧光团、荧光蛋白、可见染色剂、多色条形码、质量标签(例如，同位素或具有限定大小的聚合物)、用于无标记检测的结构标签、无线电敏感标签(由thz相机激活)、放射性标签或仅在特定频率下吸收光的吸收标签。在一些实施方案中，寡核苷酸可递送递送荧光团的酶或可存在信号的酶促放大。在一些情况下，标记的可检测信号在一些情况下可以通过荧光共振能量转移(fret)、拉曼光谱、红外检测或磁/电气检测产生。
[0082]
在一些情况下，检测组分可以是辣根过氧化物酶(hrp)。hrp可以是一种可以在辣根的根中找到的酶。hrp可以是金属酶。在一些情况下，hrp可以多种亚型之一存在。有时，亚型可以是c型。
[0083]
如果检测组分为hrp，则可以通过检测hrp的酶活性来完成检测。在一些情况下，这可以通过将hrp暴露于底物来实现，该底物可以是能够被氧化的有机底物。在一些情况下，底物可以被hrp氧化，并且有时可以检测到氧化的底物。在一些实施方案中，对可以是有机底物的底物的氧化可以通过过氧化氢进行，其中hrp可以催化通过过氧化氢进行的底物的氧化。在一些情况下，检测可以是目视的或分光光度法的，或者使用照相机进行，或者通过其他检测手段进行。
[0084]
在一些情况下，模拟天然hrp的材料可以作为检测组分。例如，可以使用hrp样人工酶。例如，模拟hrp的材料可以是氧化铁纳米颗粒或含氯化血红素的复合物。
[0085]
检测组分可以位于最后一个寡核苷酸上的任何位置。在一些情况下，检测组分可以位于最后一个寡核苷酸的3'端。在一些情况下，检测组分可以位于最后一个寡核苷酸的4'端。在一些情况下，检测组分可以位于最后一个寡核苷酸的3'和4'端之间。
[0086]
在一些情况下，其中最后一个寡核苷酸包含作为荧光团的检测组分，最后一个寡核苷酸可另外包含猝灭剂。在一些情况下，最后一个寡核苷酸在未结合时可具有二级结构，其中二级结构可使猝灭剂靠近荧光团。猝灭剂靠近荧光团可以阻止来自荧光团的信号的检测。在与第二寡核苷酸进行碱基配对后，最后一个寡核苷酸可以经历构象变化，其可以在空间上将猝灭剂与荧光团分开，其可以允许检测源自荧光团的荧光信号。接头
[0087]
在本文的组合物中，不同的分子可以通过一个或多个接头连接。例如，捕获剂可以通过接头附接到寡核苷酸。
[0088]
接头可以包含直接键或诸如氧或硫的原子，单元，例如nr1、c(o)、c(o)nh、so、so2、so2nh，或原子链，例如取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的烯基、取代或未取代的炔基、芳基烷基、芳基烯基、芳基炔基、杂芳基烷基、杂芳基烯基、杂芳基炔基、杂环基烷基、杂环基烯基、杂环基炔基、芳基、杂芳基、杂环基、环烷基、环烯基、烷基芳烷基、烷基芳基烯基、烷基芳基炔基、烯基芳基烷基、烯基芳基烯基、烯基芳基炔基、炔基芳基烷基、炔基芳基烯基、炔基芳基炔基、烷基杂芳基烷基、烷基杂芳基烯基、烷基杂芳基炔基、烯基杂芳基烷基、烯基杂芳基烯基、烯基杂芳基炔基、炔基杂芳基烷基、炔基杂芳基烯基、炔基杂芳基炔基、烷基杂环基烷基、烷基杂环烯基、烷基杂环基炔基、烯基杂环基烷基、烯基杂环基烯基、烯基杂环基炔基、炔基杂环基烷基、炔基杂环基烯基、炔基杂环基炔基、烷基芳基、烯基芳基、炔基芳基、烷基杂芳基、烯基杂芳基、炔基杂芳基、其中一个或多个亚甲基可以被o、s、s(o)、so2、
n(r1)2、c(o)、可切割的连接基团、取代的或未取代的芳基、取代的或未取代的杂芳基、取代的或未取代的杂环中断或终止；其中r1是氢、酰基、脂族或取代的脂族。
[0089]
在一些情况下，接头可以是核酸接头。“核酸接头”可以是将化合物的两个部分(例如亲和分子)连接到标记部分的核酸。核酸接头可以是单链的、完全双链的或部分双链的。核酸接头可以是任何长度。例如，核酸接头的长度可为1个核苷酸至约100个核苷酸。当核酸接头是双链时，接头可包含约6至约100个连续碱基对的双链区。然而，双链体区可以被双链体的一条或两条链中的一个或多个单链区中断。此外，双链核酸接头可在双链区的一端或两端包含单链突出端。此外，核酸接头可包含一种或多种本文所述的核酸修饰。核酸接头可以通过非核酸接头附接到化合物。
[0090]
在一些情况下，接头可以是“非核酸接头”，其可以是不是核酸接头的任何接头。
[0091]
接头可以共价或非共价地连接分子。因此，在一些实施方案中，捕获剂和寡核苷酸可以使用非核酸接头共价连接在一起。例如，捕获剂和寡核苷酸可以通过选自键、琥珀酰亚胺基
‑4‑
(n
‑
马来酰亚胺基甲基)环己烷
‑1‑
羧酸酯(smcc)接头、磺基
‑
smcc接头、琥珀酰亚胺基
‑6‑
肼基
‑
烟酰胺(s
‑
hynic)接头、n
‑
琥珀酰亚胺基
‑4‑
甲酰基苯甲酰胺(s
‑
4fb)接头、双芳基腙键(来自s
‑
hynic/s
‑
4fb反应)、零长度肽键(直接在亲和分子和核酸上的
‑
cooh和
‑
nh2之间)、间隔基上的两个肽键(来自两个
‑
nh2基团的交联)、三唑键(来自“点击”反应)、磷酸二酯键、硫代磷酸酯键(phsophothioate)及其任何组合的接头共价连接在一起。在另一个实例中，探针和标签可以通过选自键、琥珀酰亚胺基
‑4‑
(n
‑
马来酰亚胺基甲基)环己烷
‑1‑
羧酸酯(smcc)接头、磺基
‑
smcc接头、琥珀酰亚胺基
‑6‑
肼基
‑
烟酰胺(s
‑
hynic)接头、n
‑
琥珀酰亚胺基
‑4‑
甲酰基苯甲酰胺(s
‑
4fb)接头、双芳基腙键(来自s
‑
hynic/s
‑
4fb反应)、零长度肽键(直接在亲和分子和核酸上的
‑
cooh和
‑
nh2之间)、间隔基上的两个肽键(来自两个
‑
nh2基团的交联)、三唑键(来自“点击”反应)、磷酸二酯键、硫代磷酸酯键及其任何组合的接头共价连接在一起。实验条件和方法
[0092]
实验工作流程的样本概要可以包括使生物样本与缀合至第一寡核苷酸的抗体或抗体片段接触；使所述第一寡核苷酸与第二寡核苷酸的第一结合区接触；使所述第二寡核苷酸的第二结合区与第三寡核苷酸接触，其中所述第三寡核苷酸包含检测组分；从而将所述生物样本连接地耦合到所述检测组分。实验工作流程可以是连续的，或者在一些情况下可以组合步骤。
[0093]
可以在本文所述方法之前或作为本文所述方法的一部分获得或制备生物样本。生物样本的非限制性实例可包括组织、细胞或器官。
[0094]
在一些情况下，可以在应用捕获剂之前将蛋白质封闭剂应用到样本。
[0095]
可以在样本上温育捕获剂(或多种捕获剂)。捕获剂可以连接到寡核苷酸，使得每个捕获剂连接到不同的寡核苷酸，如本文所述。在一些情况下，一次可以使一种捕获剂与样本同时温育。在一些情况下，可以将2、3、4、5、6、7、8种或更多种捕获剂与样本同时温育。在一些情况下，所有捕获剂可以与样本同时温育。
[0096]
可将捕获剂温育约1分钟、约2分钟、约5分钟、约10分钟、约20分钟、约30分钟、约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时，或约6小时。在一些情况下，可将捕获剂温育至少1分钟、至少2分钟、至少5分钟、至少10分钟、至少20分钟、至少30分钟、至少1小时、至少2
小时、至少3小时、至少4小时、至少5小时或至少6小时。在一些情况下，可将捕获剂温育不超过1分钟、不超过2分钟、不超过5分钟、不超过10分钟、不超过20分钟、不超过30分钟、不超过1小时，不超过2小时，不超过3小时，不超过4小时，不超过5小时，或不超过6小时。在一些情况下，可将捕获剂可温育1分钟至6小时、1分钟至5小时、1分钟至4小时、1分钟至3小时、1分钟至2小时、1分钟至1小时、1分钟至30分钟、1分钟至20分钟、1分钟至10分钟、1分钟至5分钟、1分钟至2分钟、2分钟至6小时、2分钟至5小时、2分钟至4小时、2分钟至3小时、2分钟至2小时、2分钟至1小时、2分钟至30分钟、2分钟至20分钟、2分钟至10分钟、2分钟至5分钟、5分钟至6小时、5分钟至5小时、5分钟至4小时、5分钟至3小时、5分钟至2小时、5分钟至1小时、5分钟至30分钟、5分钟至20分钟、5分钟至10分钟、10分钟至6小时、10分钟至5小时、10分钟至4小时、10分钟至3小时、10分钟至2小时、10分钟至1小时、10分钟至30分钟、10分钟至20分钟、20分钟至6小时、20分钟至5小时、20分钟至4小时、20分钟至3小时、20分钟至2小时、20分钟至1小时、20分钟至30分钟、30分钟至6小时、30分钟至5小时、30分钟至4小时、30分钟至3小时、30分钟至2小时、30分钟至1小时、1小时至6小时、1小时至5小时、1小时至4小时、1小时至3小时、1小时至2小时、2小时至6小时、2小时至5小时、2小时至4小时、2小时至3小时、3小时至6小时、3小时至5小时、3小时至4小时、4小时至6小时、4小时至5小时、或5小时至6小时。
[0097]
在与捕获剂温育之后，可以洗涤样本以去除过量的捕获剂。洗涤可以包括向样本施加缓冲液一段时间，然后去除缓冲液。在一些情况下，洗涤可包括温和搅拌，例如通过旋转、摇动、摆动或振动样本进行。洗涤可包括向样本施加至少50μl、至少100μl、至少500μl、至少1ml、至少5ml、至少10ml、至少20ml、至少30ml、至少40ml，或至少50ml的缓冲液。洗涤可包括向样本施加不超过50μl、不超过100μl、不超过500μl、不超过1ml、不超过5ml、不超过10ml、不超过20ml、不超过30ml、不超过40ml或不超过50ml的缓冲液。在一些情况下，洗涤可以包括向样本施加50μl至50ml、50μl至40ml、50μl至30ml、50μl至20ml、50μl至10ml、50μl至5ml、50μl至1ml、50μl至500μl、50μl至100μl、100μl至50ml、100μl至40ml、100μl至30ml、100μl至20ml、100μl至10ml、100μl至5ml、100μl至1ml、100μl至500μl、500μl至50ml、500μl至40ml、500μl至30ml、500μl至20ml、500μl至10ml、500μl至5ml、500μl至1ml、1ml至50ml、1ml至40ml、1ml至30ml、1ml至20ml、1ml至10ml、1ml至5ml、5ml至50ml、5ml至40ml、5ml至30ml、5ml至20ml、5ml至10ml、10ml至50ml、10ml至40ml、10ml至30ml、10ml至20ml、20ml至50ml、20ml至40ml、20ml至30ml、30ml至50ml、30ml至40ml、或40ml至50ml的缓冲液。洗涤缓冲液可以是任何可接受的缓冲液。在一些情况下，洗涤缓冲液可以是例如捕获剂所在的相同缓冲液，或另一种缓冲液，例如pbs、pbs
‑
t、tbs或tbs
‑
t。洗涤步骤可持续至少10秒、至少30秒、至少1分钟、至少2分钟、至少3分钟、至少4分钟、至少5分钟、至少10分钟或至少15分钟。洗涤步骤可持续最多10秒、最多30秒、最多1分钟、最多2分钟、最多3分钟、最多4分钟、最多5分钟、最多10分钟、或最多15分钟。洗涤步骤可持续10秒至15分钟、10秒至10分钟、10秒至5分钟、10秒至30秒、30秒至15分钟、30秒至10分钟、30秒至5分钟、30秒至1分钟、1分钟至15分钟、1分钟至10分钟、1分钟至5分钟、5分钟至15分钟、5分钟至10分钟、或1分钟至15分钟。洗涤步骤可进行1、2、3、4、5或更多次。
[0098]
捕获剂可以与样本交联。这种交联可以防止捕获剂在后续步骤期间解离。这种交联步骤可以使用任何胺
‑
胺交联剂(例如，甲醛、多聚甲醛、二琥珀酰亚胺基月桂酸酯、n
‑
羟基琥珀酰亚胺(nhs)或类似作用的另一种试剂)完成，但如果需要，可以使用多种其他化学
物质来将捕获剂交联到样本。
[0099]
在一些情况下，可以将核酸封闭剂应用于样本。在该步骤中可以使用任何可接受的核酸封闭剂，例如鲑鱼精子dna或另外可商购的产品。
[0100]
在一些情况下，核酸封闭剂可在约4℃、约10℃、约15℃、约20℃、约25℃、约30℃、约35℃、约40℃或约45℃下温育。在一些情况下，核酸封闭剂可在至少4℃、至少10℃、至少15℃、至少20℃、至少25℃、至少30℃、至少35℃、至少40℃或至少45℃下温育。在一些情况下，核酸封闭剂可在不超过4℃、不超过10℃、不超过15℃、不超过20℃、不超过25℃、不超过30℃、不超过35℃、不超过40℃、或不超过45℃下温育。在一些情况下，核酸封闭剂可在4℃至45℃、4℃至40℃、4℃至35℃、4℃至30℃、4℃至25℃、4℃至20℃、4℃至15℃、4℃至10℃、10℃至45℃、10℃至40℃、10℃至35℃、10℃至30℃、10℃至25℃、10℃至20℃、10℃至15℃、15℃至45℃、15℃至40℃、15℃至35℃、15℃至30℃、15℃至25℃、15℃至20℃、20℃至45℃、20℃至40℃、20℃至35℃、20℃至30℃、20℃至25℃、25℃至45℃、25℃至40℃、25℃至35℃、25℃至30℃、30℃至45℃、30℃至40℃、30℃至35℃、35℃至45℃、35℃至40℃、或40℃至45℃下温育。
[0101]
在一些情况下，封闭步骤可持续约10分钟、约20分钟、约30分钟、约40分钟、约50分钟或约60分钟。在一些情况下，封闭步骤可以持续至少10分钟、至少20分钟、至少30分钟、至少40分钟、至少50分钟或至少60分钟。在一些情况下，封闭步骤可持续不超过10分钟、不超过20分钟、不超过30分钟、不超过40分钟、不超过50分钟或不超过60分钟。在一些情况下，封闭步骤可持续10分钟至60分钟、10分钟至50分钟、10分钟至40分钟、10分钟至30分钟、10分钟至20分钟、20分钟至60分钟、20分钟至50分钟、20分钟至40分钟、20分钟至30分钟、30分钟至60分钟、30分钟至50分钟、30分钟至40分钟、40分钟至60分钟、40分钟至50分钟、或50分钟至60分钟。
[0102]
与第一寡核苷酸缀合的抗体或抗体片段可以在第一缓冲液中。
[0103]
可以在样本上温育第二寡核苷酸，使得第二寡核苷酸有机会与第一寡核苷酸杂交。
[0104]
在一些情况下，第二寡核苷酸可在约4℃、约10℃、约15℃、约20℃、约25℃、约30℃、约35℃、约40℃或约45℃下温育。在一些情况下，第二寡核苷酸可在至少4℃、至少10℃、至少15℃、至少20℃、至少25℃、至少30℃、至少35℃、至少40℃或至少45℃下温育。在一些情况下，第二寡核苷酸可在不超过4℃、不超过10℃、不超过15℃、不超过20℃、不超过25℃、不超过30℃、不超过35℃、不超过40℃、或不超过45℃下温育。在一些情况下，第二寡核苷酸可在4℃至45℃、4℃至40℃、4℃至35℃、4℃至30℃、4℃至25℃、4℃至20℃、4℃至15℃、4℃至10℃、10℃至45℃、10℃至40℃、10℃至35℃、10℃至30℃、10℃至25℃、10℃至20℃、10℃至15℃、15℃至45℃、15℃至40℃、15℃至35℃、15℃至30℃、15℃至25℃、15℃至20℃、20℃至45℃、20℃至40℃、20℃至35℃、20℃至30℃、20℃至25℃、25℃至45℃、25℃至40℃、25℃至35℃、25℃至30℃、30℃至45℃、30℃至40℃、30℃至35℃、35℃至45℃、35℃至40℃、或40℃至45℃下温育。
[0105]
在一些情况下，第二寡核苷酸可在样本上温育约10分钟、约20分钟、约30分钟、约40分钟、约50分钟或约60分钟。在一些情况下，第二寡核苷酸可在样本上温育至少10分钟、至少20分钟、至少30分钟、至少40分钟、至少50分钟或至少60分钟。在一些情况下，第二寡核
苷酸可在样本上温育不超过10分钟、不超过20分钟、不超过30分钟、不超过40分钟、不超过50分钟或不超过60分钟。在一些情况下，第二寡核苷酸可在样本上温育10分钟至60分钟、10分钟至50分钟、10分钟至40分钟、10分钟至30分钟、10分钟至20分钟、20分钟至60分钟、20分钟至50分钟、20分钟至40分钟、20分钟至30分钟、30分钟至60分钟、30分钟至50分钟、30分钟至40分钟、40分钟至60分钟、40分钟至50分钟、或50分钟至60分钟。
[0106]
第二寡核苷酸可以在第二缓冲液中。在一些情况下，第二缓冲液可包含pbs、pbs
‑
t、tbs、tbs
‑
t水、盐水或克雷布氏缓冲液。
[0107]
可以在样本上温育第三寡核苷酸，使得第三寡核苷酸有机会与第二寡核苷酸杂交。
[0108]
在一些情况下，第三寡核苷酸可在约4℃、约10℃、约15℃、约20℃、约25℃、约30℃、约35℃、约40℃或约45℃下温育。在一些情况下，第三寡核苷酸可在至少4℃、至少10℃、至少15℃、至少20℃、至少25℃、至少30℃、至少35℃、至少40℃或至少45℃下温育。在一些情况下，第三寡核苷酸可在不超过4℃、不超过10℃、不超过15℃、不超过20℃、不超过25℃、不超过30℃、不超过35℃、不超过40℃、或不超过45℃下温育。在一些情况下，第三寡核苷酸可在4℃至45℃、4℃至40℃、4℃至35℃、4℃至30℃、4℃至25℃、4℃至20℃、4℃至15℃、4℃至10℃、10℃至45℃、10℃至40℃、10℃至35℃、10℃至30℃、10℃至25℃、10℃至20℃、10℃至15℃、15℃至45℃、15℃至40℃、15℃至35℃、15℃至30℃、15℃至25℃、15℃至20℃、20℃至45℃、20℃至40℃、20℃至35℃、20℃至30℃、20℃至25℃、25℃至45℃、25℃至40℃、25℃至35℃、25℃至30℃、30℃至45℃、30℃至40℃、30℃至35℃、35℃至45℃、35℃至40℃、或40℃至45℃下温育。
[0109]
在一些情况下，第三寡核苷酸可在样本上温育约10分钟、约20分钟、约30分钟、约40分钟、约50分钟或约60分钟。在一些情况下，第三寡核苷酸可在样本上温育可温育至少10分钟、至少20分钟、至少30分钟、至少40分钟、至少50分钟或至少60分钟。在一些情况下，第三寡核苷酸可在样本上温育不超过10分钟、不超过20分钟、不超过30分钟、不超过40分钟、不超过50分钟或不超过60分钟。在一些情况下，第三寡核苷酸可在样本上温育10分钟至60分钟、10分钟至50分钟、10分钟至40分钟、10分钟至30分钟、10分钟至20分钟、20分钟至60分钟、20分钟至50分钟、20分钟至40分钟、20分钟至30分钟、30分钟至60分钟、30分钟至50分钟、30分钟至40分钟、40分钟至60分钟、40分钟至50分钟、或50分钟至60分钟。
[0110]
第三寡核苷酸可以在第三缓冲液中。在一些情况下，第三缓冲液可包含pbs、pbs
‑
t、tbs、tbs
‑
t水、盐水或克雷布氏缓冲液。
[0111]
在一些情况下，第一缓冲液可以与第二缓冲液相同或基本相同。在一些情况下，第二缓冲液可以与第三缓冲液相同或基本相同。在一些情况下，第一缓冲液可以与第三缓冲液相同或基本相同。
[0112]
在一些情况下，与第一寡核苷酸缀合的抗体可以与第二寡核苷酸在相同的缓冲液中，该缓冲液可以是第一替代缓冲液。在一些情况下，第一替代缓冲液可包含pbs、pbs
‑
t、tbs、tbs
‑
t水、盐水或克雷布氏缓冲液。
[0113]
在一些情况下，第二寡核苷酸可以与第三寡核苷酸在相同的缓冲液中，该缓冲液可以是第二替代缓冲液。在一些情况下，第二替代缓冲液可包含pbs、pbs
‑
t、tbs、tbs
‑
t水、盐水或克雷布氏缓冲液。
[0114]
在一些情况下，与第一寡核苷酸缀合的抗体、第二寡核苷酸和第三寡核苷酸可以在相同的缓冲液中，该缓冲液可以是共同的缓冲液。在一些情况下，共同的缓冲液可包含pbs、pbs
‑
t、tbs、tbs
‑
t水、盐水或克雷布氏缓冲液。
[0115]
非限制性示例性方案可以如下进行。可以将一定体积的在第一缓冲液中的与第一寡核苷酸缀合的抗体或抗体片段层化到先前制备的样本上。在温育时间过后，在一些情况下可以洗掉体积。在一些情况下，用于洗涤的缓冲液可包括pbs、pbs
‑
t、tbs、tbs
‑
t水、盐水或克雷布氏缓冲液。在一些情况下，用于洗涤的缓冲液可以是与第一缓冲液相同的缓冲液，但可以不包括与第一寡核苷酸缀合的抗体或抗体片段。
[0116]
类似于上述方案的方案中的任何步骤的温育时间可最多10、20、30、40、50或60分钟。类似于上述方案的方案中的任何步骤的温育时间可为至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24小时。类似于上述方案的方案中的任何步骤的温育可以持续约一个工作日、约一夜、约一个周末、约一周或约一个月。
[0117]
对于一些应用，可以使用多于一种的抗体或抗体片段。在这种情况下，可以使用不同的抗体或抗体片段。在一些情况下，可以使用至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30或更多种不同的抗体或抗体片段。抗体或抗体片段的序列差异可最多为5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％。在一些情况下，抗体或抗体片段的差异可为1％至10％、1％至20％、1％至30％、1％至40％、5％至10％、5％和20％、5％至30％、5％至40％、10％至20％、10％至30％或30％至40％。
[0118]
在一些情况下，每个不同的抗体或抗体片段可以与独特的第一寡核苷酸缀合。每个第一寡核苷酸可以与其他第一寡核苷酸有至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100或更多个碱基对不同。在一些情况下，第一寡核苷酸可以与其他第一寡核苷酸有至少1％、5％、10％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％不同。每个第一寡核苷酸可具有可以与其他第一寡核苷酸中的相同的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100或更多个碱基对。具有与其他第一寡核苷酸相同的碱基对的第一寡核苷酸可以具有与1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、90、100或更多其他第一寡核苷酸相同的碱基对。读取
[0119]
可以读取样本以确定一种或多种捕获剂的结合模式。在一些情况下，可以读取样本以确定每个捕获剂的结合模式。这种结合模式可以指示寡核苷酸和缀合的捕获剂的空间信息，这又可以指示感兴趣的生物特征的空间信息。
[0120]
确定这种结合模式的方法可以包括读取样本以获得图像，从该图像中可以确定在先前步骤中杂交的每个捕获剂子集的结合模式(即，结合不同生物特征的不同捕获剂的结合模式)。该步骤可以使用任何方便的读取方法来完成，并且在一些实施方案中，例如，可以使用为每个荧光团配备适当滤波器的荧光显微镜或通过使用双带通滤波器或三带通滤波器组来分别读取不同探针的杂交以观察多个荧光团(参见，例如，美国专利号5,776,688)。
[0121]
在一些情况下，与标记相关联的每个感兴趣的生物特征，同时与标记相关联的另一个感兴趣的生物特征，可以在同一迭代期间读取。在同一迭代期间读取的标记可以不同。
如果两个标记在使用读取介质检测时可以相互区分，则可以认为两个标记是不同的。例如，如果使用显微镜成像(例如通过激发波长、发射波长、强度或其他一些特性)时，两个荧光分子的信号可以相互区分，则可以认为它们是不同的。
[0122]
每个读取都可以产生样本的图像，显示捕获剂子集的结合模式。在一些实施方案中，该方法还可以包括分析、比较或叠加图像中的至少两个。在一些实施方案中，该方法还可包括叠加所有图像以产生显示所有捕获剂与样本结合的模式的图像。所使用的图像分析模块可以转换来自每个荧光团的信号以产生多个假彩色图像。图像分析模块可以叠加多个假彩色图像(例如，在每个像素处叠加假彩色)以获得多路复用的假彩色图像。多个图像(例如，未加权的或加权的)可以被转换成单个假彩色，例如，以表示由特定捕获剂的结合表征的感兴趣的生物特征。基于用户的手动输入，可以将假彩色分配给特定的捕获剂或捕获剂的组合。在某些方面，图像可以包括仅和与感兴趣的特征(例如在核隔室中)相关联的标记的强度相关的假彩色。图像分析模块还可以被配置为调整(例如，归一化)信号强度或假彩色的强度和/或对比度，以进行卷积操作(例如，强度或假彩色的模糊或锐化)，或进行任何其他合适的操作来增强图像。图像分析模块可以进行任何上述操作以对齐从连续图像获得的像素和/或模糊或平滑从连续图像获得的跨像素的强度或假彩色。
[0123]
在一些实施方案中，样本的图像可以在z方向上在不同焦平面处拍摄。这些光学切片可用于重建样本的三维图像。尽管其他方法是已知的，但可以使用共聚焦显微镜拍摄光学切片。图像分析方法可以在计算机上实现。在某些实施方案中，通用计算机可被配置为用于本文公开的方法和程序的功能布置。这种计算机的硬件架构为本领域技术人员所熟知，并且可以包括硬件组件，其包括一个或多个处理器(cpu)、随机存取存储器(ram)、只读存储器(rom)、内部或外部数据存储介质(例如，硬盘驱动器)。计算机系统还可以包括一个或多个图形板，用于处理图形信息并将图形信息输出到显示装置。上述组件可以通过计算机内部的总线适当地互连。计算机还可包括用于与诸如监视器、键盘、鼠标、网络等通用外部组件通信的合适接口。在一些实施方案中，计算机能够进行并行处理或者可以是被配置用于并行或分布式计算以增加本方法和程序的处理能力的网络的一部分。在一些实施方案中，从存储介质中读出的程序代码可以被写入设置在计算机中插入的扩展板中的存储器或连接到计算机的扩展单元中，并且设置在扩展板中的cpu等或者扩展单元实际上可以根据程序代码的指令进行部分或全部操作，从而完成下述功能。在其他实施方案中，该方法可以使用云计算系统来进行。在这些实施方案中，可以将数据文件和程序导出到运行程序并将输出返回给用户的云计算机。灭活和去除
[0124]
标记可以被灭活或去除。灭活或去除可以允许方法的多路复用，使得与没有灭活或去除步骤的情况相比，可以检测更多的感兴趣的生物特征。
[0125]
在读取样本之后，该方法可以包括灭活或去除与寡核苷酸相关联(即，杂交)的标记，留下多个捕获剂及其仍与样本结合相关联的寡核苷酸。可以通过多种方法去除或灭活与样本相关的标记，包括但不限于变性(在这种情况下，标记和与其整体结合的寡核苷酸可以被释放并且可以被洗掉)，通过切割探针中的连接(在这种情况下，标记和寡核苷酸的一部分可以被释放并且可以被洗掉)，通过切割标记所结合的寡核苷酸(第三寡核苷酸)和它所杂交的寡核苷酸(第二寡核苷酸)两者以释放可以被洗掉的片段，或者通过切割寡核苷酸
和标记之间的连接(在这种情况下标记可以被释放并且可以被洗掉)，通过切割寡核苷酸例如通过使用限制酶(在这种情况下寡核苷酸和标记可以被洗掉)，或通过使标记本身失活(例如，通过破坏标记中的键，从而阻止标记产生信号，或通过向标记引入猝灭剂以防止信号的检测)。在可接受的去除方法中，例如所提供的方法中，与其他抗体(例如，与尚未检测的与感兴趣的生物特征结合的抗体)连接的未杂交寡核苷酸可以保持完整并自由地与用于下一个循环的经标记的探针组杂交。在一些实施方案中，荧光可通过基于光的漂白、基于过氧化物的漂白或通过可切割接头对连接至核苷酸的荧光团的切割(例如，使用tcep作为切割试剂)而灭活。
[0126]
在一些实施方案中，去除步骤是通过变性从样本中去除杂交探针来完成的，留下其他捕获剂及其仍与样本结合的相关联的寡核苷酸。在其他实施方案中，去除步骤不是通过变性完成的，留下其他捕获剂(即，未与探针杂交的捕获剂)及其仍与样本结合的相关联的寡核苷酸。在这些实施方案中，可以通过切割捕获剂
‑
三种寡核苷酸
‑
与样本相关联的标记复合物，或将寡核苷酸与标记连接的接头中的至少一个键来去除标记，从而从寡核苷酸上释放标记。这种切割可以通过酶促、化学法或经由曝光进行。或者，可以通过光漂白或通过化学改变标记来灭活标记。
[0127]
如果不通过经变性从样本中去除杂交核苷酸来进行去除步骤，则可以使用多种基于化学的、酶催化的或光诱导的切割方法。例如，在一些实施方案中，寡核苷酸可以包含化学可切割或光可切割的键，使得它们可以通过暴露于化学物质或光而被片段化。在一些实施方案中，双链体(因为它们是双链的)可以例如被限制酶或双链dna特异性核酸内切酶(片段酶)切割。在一些实施方案中，寡核苷酸可包含尿嘧啶残基(其可由用户(user)切割)，或可包含有含有错配的发夹，其可使用错配特异性核酸内切酶切割。在这些实施方案中的一些中，在切割后，含有标记的寡核苷酸片段的tm可能不够高以保持与寡核苷酸碱基配对，因此，该片段可以从寡核苷酸解离。在一些实施方案中，寡核苷酸和标记可以通过光可切割或化学可切割的接头连接。对该接头的切割可以从样本中释放标记。在其他实施方案中，寡核苷酸可以是rna，并且可以使用rnase降解寡核苷酸。在一些实施方案中，可以使用酶促可切割的键。例如，酯可以被酯酶切割并且聚糖可以被麦芽糖糊精酶(glycase)切割。或者，可以通过修改标记来使标记本身灭活。在一个实例中，染料可以被光漂白，但其他方法是已知的。
[0128]
在一些实施方案中，在读取样本之后，该方法可以包括通过变性从样本中去除杂交的第三寡核苷酸(即，通过使经标记的探针从寡核苷酸解退火并将它们洗掉)，留下捕获剂及其仍与样本结合的相关联的寡核苷酸。可以使用任何合适的化学变性剂，例如甲酰胺、dmso、尿素或离液剂(例如，氯化胍等)，使用立足点释放策略(参见，例如，kennedy
‑
darling,chembiochem.2014 15:2353
–
2356)，或使用热、碱、拓扑异构酶或单链结合剂(例如ssbp)来完成该步骤。该步骤也可以通过具有更大亲和力的寡核苷酸(例如pna)的杂交来实现。在一些情况下，可通过将样本在70％至90％甲酰胺(例如，75％至85％甲酰胺)中温育至少1分钟(例如，1至5分钟)的时间段，然后洗涤而去除探针。如果需要，可以重复该变性步骤，使得去除所有杂交的探针。很明显，该步骤不是酶促实施的，即不使用核酸酶例如dnase或限制酶，并且不会导致对例如在任何探针或寡核苷酸中的任何共价键的切割，或去除样本中的任何捕获剂。在该步骤中，探针/寡核苷酸双链体的链被彼此分离(即变性)，且此时
在溶液中游离的分离的探针被洗掉，留下完整的捕获剂及其相关的寡核苷酸在适当的位置。
[0129]
如果使用可切割的键(例如，在寡核苷酸中或将寡核苷酸连接到标记)，则可切割的接头能够使用刺激(例如，光或在其环境中的变化)被选择性切割而不会使附接到抗体的寡核苷酸中的键断裂。在一些实施方案中，可切割的键可以是二硫键，其可以使用还原剂(例如，β
‑
巯基乙醇或另一种合适的还原剂)容易地断裂。可以使用的合适的可切割键包括但不限于以下：碱可切割位点，例如酯，特别是琥珀酸酯(可被例如氨或三甲胺切割)，季铵盐(可被例如，二异丙胺)和氨基甲酸酯(可被氢氧化钠水溶液切割)；酸可切割位点，例如苄醇衍生物(可使用三氟乙酸切割)、替考拉宁糖苷配基(可被三氟乙酸然后被碱切割)、缩醛和硫代缩醛(也可被三氟乙酸切割)、硫醚(例如可被hf或甲酚切割)和磺酰基(可被三氟甲磺酸、三氟乙酸、硫代苯甲醚等切割)；亲核试剂可切割位点，例如邻苯二甲酰胺(可被取代肼切割)、酯(例如可被三氯化铝切割)；和weinreb酰胺(可被氢化铝锂切割)；和其他类型的化学可切割位点，包括硫代磷酸酯(可被银或汞离子切割)和二异丙基二烷氧基甲硅烷基(可被氟离子切割)。其他可切割键对本领域技术人员来说是显而易见的或在相关文献和文章中有所描述(例如，brown(1997)contemporary organic synthesis 4(3)；216
‑
237)。在一些实施方案中，可切割的键可以被酶切割。
[0130]
在特定的实施方案中，可使用光可切割(“pc”)接头(例如，uv可切割的接头)。适合使用的光可切割接头可以包括基于邻硝基苄基的接头、苯甲酰甲基接头、烷氧基安息香接头、铬芳烃复合接头、npssmpact接头和新戊酰二醇接头，如guillier等人(chem rev.2000jun 14；100(6):2091
‑
158)所描述的。可以在主题方法中使用的示例性连接基团可以在guillier等人，同上和olejnik等人(methods in enzymology 1998 291:135
‑
154)中描述，并在u.s.p.n.6,027,890；olejnik等人(proc.natl.acad sci,92:7590
‑
94)；ogata等人(anal.chem.2002 74:4702
‑
4708)；bai等人(nucl.acids res.2004 32:535
‑
541)；zhao等人(anal.chem.2002 74:4259
‑
4268)；和sanford等人(chem mater.1998 10:1510
‑
20)中进一步描述，并且可从ambergen(boston,ma；nhs
‑
pc
‑
lc
‑
biotin)、link technologies(bellshill,scotland)、fisher scientific(pittsburgh,pa)和calbiochem
‑
novabiochem corp.(la jolla,ca)购买。迭代法
[0131]
本文的方法可以包括对步骤进行重复。在一些情况下，这可以包括重复该方法的步骤。与无需重复步骤即可实现相比，这可以允许检测更多的感兴趣的生物特征。
[0132]
在去除或灭活标记后，可以使样本与包含附加标记(多种)的一组不同的经标记的寡核苷酸(即第三寡核苷酸(多种)或第二寡核苷酸(多种)和第三寡核苷酸(多种)的组)杂交并且可以重新读取样本以产生显示与每个最近杂交的寡核苷酸(多种)相关的捕获剂的结合模式的图像。以此方式，在读取样本的不同迭代中，可以检测不同的感兴趣的生物特征。在读取样本后，可以例如通过变性、灭活或另一种方法(如上所述)从样本中去除标记(多个)，并且可以用另一组不同的可区分的经区分标记的寡核苷酸(其可以杂交至与另一个不同的捕获剂子集相关的寡核苷酸)重复杂交和读取步骤。换句话说，该方法可以包括用经标记的寡核苷酸的不同子集多次重复杂交、标记去除或灭活和读取步骤，其中每个子集中的探针可被可区分地标记并且每次重复之后可以接着例如通过变性或另一种方法去除
标记(除了最后的重复)，以产生样本的多个图像，其中每个图像对应于经标记的寡核苷酸的子集。可以重复杂交/读取/标记去除或灭活步骤，直到分析期望的感兴趣的生物特征。
[0133]
可以选择使用的核苷酸序列，以最大限度地减少背景染色(来自非特异性吸附还是通过与内源基因组序列(rna或dna)结合)。同样，杂交和洗涤缓冲液可以被设计成将来自非特异性吸附或通过与内源基因组序列(rna或dna)结合或通过与其他报告序列结合的背景染色最小化。
[0134]
除了上述标记方法之外，可以在进行上述方法之前或之后使用细胞学染色剂对样本进行染色。在这些实施方案中，染色剂可以是例如鬼笔环肽、钆双胺、吖啶橙、俾斯麦棕、巴明(barmine)、考马斯蓝、bresyl紫、brystal紫、dapi、苏木精、伊红、溴化乙锭、酸性品红、苏木素、赫斯特染色剂、碘、孔雀石绿、甲基绿、亚甲基蓝、中性红、尼罗蓝、尼罗红、四氧化锇(正式名称：四氧化锇(osmium tetraoxide))、罗丹明、番红、磷钨酸、四氧化锇、四氧化钌、钼酸铵、碘化镉、碳酰肼、三氯化铁、六胺、三氯化铟、硝酸镧、醋酸铅、柠檬酸铅、硝酸铅(ii)、高碘酸、磷钼酸、铁氰化钾、亚铁氰化钾、钌红、硝酸银、蛋白银、氯金酸钠、硝酸铊、硫代氨基脲、乙酸铀酰、硝酸铀酰、硫酸氧钒或其任何衍生物。染色剂可以对任何感兴趣的特征具有特异性，例如一种蛋白质或一类蛋白质、磷脂、dna(例如，dsdna、ssdna)、rna、细胞器(例如，细胞膜、线粒体、内质网、高尔基体、核被膜或其他细胞器)，或细胞的隔室(例如，细胞溶质、核部分或其他隔室)。染色剂可以增强细胞内或细胞外结构的对比度或成像。在一些实施方案中，样本可以用苏木精和伊红(h&e)染色。试剂盒
[0135]
本文还提供了可包含用于实施上述方法的试剂的试剂盒。在一些实施方案中，试剂盒可包含与第一寡核苷酸缀合的抗体或抗体片段，包含第一结合区和第二结合区的第二寡核苷酸，其中所述第二寡核苷酸的第一结合区可以与所述第一寡核苷酸的至少一部分互补；和包含检测组分的第三寡核苷酸，其中所述第二寡核苷酸的所述第二结合区可以与所述第三寡核苷酸的至少一部分互补。在一些实施方案中，检测组分可预先附接到第三寡核苷酸，而在其他实施方案中，检测组分可在稍后时间附接到第三寡核苷酸。
[0136]
试剂盒可以包含对结合了经标记的探针的样本进行成像的说明。在一些情况下，这样的试剂盒可以包含允许多路复用成像方案的说明书和/或试剂。例如，试剂盒可包含用于对标记进行化学去除、灭活、淬灭、切割或去杂交的说明书和/或试剂。
[0137]
在上述组件中，试剂盒还可以包括用于使用试剂盒的组件来实践主题方法的说明书。用于实践主题方法的说明书通常记录在合适的记录介质上。例如，说明书可以印刷在基材上，例如纸或塑料等。因此，说明书可以作为包装插页存在于试剂盒中，存在于试剂盒或其组件的容器的标记中(即，与包装或子包装相关联)等。在其他实施方案中，说明书作为电子存储数据文件存在于合适的计算机可读存储介质(例如，cd
‑
rom、磁盘等)上。在其他实施方案中，试剂盒中不存在实际说明书，但提供了从远程来源(例如通过互联网)获取说明书的方法。该实施方案的实例是包括可以查看说明书和/或可以从其下载说明书的web网址的试剂盒。与说明书一样，用于获得说明书的这种方法记录在合适的基材上。
[0138]
除了上述组件之外，试剂盒还可以包括使用试剂盒的组件来实践主题方法的说明书，即用于样本分析的说明书。用于实践主题方法的说明书通常记录在合适的记录介质上。例如，说明书可以印刷在基材上，例如纸或塑料等。因此，说明可以作为包装插页存在于试
剂盒中，存在于试剂盒或其组件的容器的标记中(即，与包装或子包装相关联)等。在其他实施方案中，说明书作为电子存储数据文件存在于合适的计算机可读存储介质(例如，cd
‑
rom、磁盘等)上。在其他实施方案中，试剂盒中不存在实际说明书，但提供了用于从远程来源(例如通过互联网)获取说明书的方法。该实施方案的实例可以是包括可以查看说明书和/或可以从其下载说明书的web网址的试剂盒。与说明书一样，用于获得说明书的这种方法记录在合适的基材上。实施例实施例1：固定在载玻片上的组织中的元素检测
[0139]
在一些实施方案中，可以将生物样本，例如组织切片或多个培养细胞，固定在载玻片上。一旦在载玻片上，就可以使样本与抗体或抗体片段接触，该抗体或抗体片段可以与第一寡核苷酸缀合。寡核苷酸可以在一定体积的合适缓冲液中，该缓冲液能够保持抗体或抗体片段、寡核苷酸、生物样本的完整性以及抗体或抗体片段、寡核苷酸和生物样本之间的任何相互作用。在一些情况下，可以在足以允许抗体或抗体片段与样本之间结合的温育期之后用合适的洗涤缓冲液洗掉过量的抗体或抗体片段。此后，可使第一寡核苷酸与第二寡核苷酸接触，使得第二寡核苷酸的第一结合区可与第一寡核苷酸配对。第二寡核苷酸可以在一定体积的合适的缓冲液中，该缓冲液能够保持所有存在元素的完整性。在一些情况下，可以在足以允许第一寡核苷酸和第二寡核苷酸之间结合的温育期之后用合适的洗涤缓冲液洗掉过量的第二寡核苷酸。此后，可以使第二寡核苷酸与包含检测组分的第三寡核苷酸接触。第三寡核苷酸可以与第二寡核苷酸的第二结合区配对。第三寡核苷酸可以在一定体积的合适的缓冲液中，该缓冲液能够保持所有存在元素的完整性。可以在足以允许第二寡核苷酸和第三寡核苷酸之间结合的温育期之后用合适的洗涤缓冲液洗掉过量的第三寡核苷酸。以此方式，可以使生物样本的元素连接至抗体或抗体片段、连接至第一寡核苷酸、连接至第二寡核苷酸、连接至第三寡核苷酸、连接至检测元素。因此，可以进行检测元素的检测以检测生物样本的元素。实施例2：更长链
[0140]
在一些情况下，除了第二寡核苷酸之外，方法可以类似于实施例1中的方法。在这样的方法中，可以在第二寡核苷酸之后且第三寡核苷酸之前将另外的1、2、3、4、5个或更多个寡核苷酸与样本一起温育，形成可以构成第二寡核苷酸的寡核苷酸链。在一些情况下，这可以预先进行，使得第二寡核苷酸在接触第一寡核苷酸之前可以包含多个寡核苷酸作为寡核苷酸链。实施例3：3
‑
维元素检测
[0141]
在一些实施方案中，样本可以是3维样本，例如冷冻的组织块。在这样的实施方案中，可以实现元素的3维检测。这可以通过多种方法来实现，这些方法可以包括本文所述的两种类型的方法。
[0142]
在第一种类型的方法中，可以用显微镜用薄片切片机将组织块从顶部到底部切片。在切下第一切片之后，方法包括使样本块表面的生物样本与缀合至第一寡核苷酸的抗体片段直接接触，然后使第一寡核苷酸与第二寡核苷酸的第一结合区接触，然后使第二寡核苷酸的第二结合区与第三寡核苷酸接触，其中第三寡核苷酸包含检测组分，从而将生物样本连接地耦合到检测组分。在一些情况下，检测组分可以例如使用相机被检测到。在检测
之后，可以对新切片进行切片，并且可以重复该方法。在样本的至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少100％中进行这些步骤时，可以认为该方法完成。在完成该方法后，可以将每个切片的数据以产生3
‑
维数据集的方式进行组合，该3
‑
维数据集可以在三个维度上指示样本中检测的元素的位置。
[0143]
在第二种类型的方法中，可以用显微镜用薄片切片机将组织块从顶部到底部切片，使得可以将切片转移到载玻片。然后可以对载玻片上的切片进行如下方法：该方法包括使生物样本与缀合至第一寡核苷酸的抗体片段接触，随后使第一寡核苷酸与第二寡核苷酸的第一结合区接触，然后使第二寡核苷酸的第二结合区与第三寡核苷酸接触，其中第三寡核苷酸包含检测组分，从而将生物样本连接地耦合到检测组分。在一些情况下，检测组分可以例如使用相机被检测到。检测后，可以对包含来自同一组织块的切片的其他载玻片重复该方法。在样本的至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少100％中进行这些步骤时，可以认为该方法完成。在该方法完成后，可以将每个载玻片的数据以产生3
‑
维数据集的方式进行组合，该3
‑
维数据集可以在三个维度上指示样本中检测的元素的位置。
[0144]
在任一类型的方法和其他类似类型的方法中，切片可为1μm、约2μm、约3μm、约4μm、约5μm、约6μm、约7μm、约8μm、约9μm、约10μm、约11μm、约12μm、约13μm、约14μm、约15μm、约16μm、约17μm、约18μm、约19μm、约20μm、约25μm、约30μm、约35μm、约40μm、约45μm、约50μm、约55μm、约60μm、约65μm、约70μm、约75μm、约80μm、约85μm、约90μm、约95μm、约100μm、约110μm、约120μm、约130μm、约140μm、约150μm、约160μm、约170μm、约180μm、约190μm、约200μm、约150μm、约300μm、约350μm、约400μm、约450μm、约500μm、约600μm、约700μm、约800μm、约900μm或约1000μm厚。在一些情况下，可以跳过切片，因为可以去除某些切片而不进行该方法。如果切片不与感兴趣区域相交，由于时间限制，如果较低的分辨率是可以接受的，或者出于其他原因，则可以进行跳过切片。如果切片被跳过，在一些情况下，可以跳过至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个或至少20个切片。在一些情况下，可以在整个样本中均匀地跳过切片。在一些情况下，样本的某些部分可以比其他部分具有更多的跳过切片。在一些情况下，可以不跳过切片。在一些情况下，是否跳过切片的决定可以在分析前一个切片之后做出。实施例4：元素检测，然后进行激光捕获显微切割
[0145]
在一些情况下，可以执行本文的方法，使得可以结合该方法执行激光捕获显微切割(lcm)。在这种情况下，可以在为lcm设计的特殊载玻片上进行这些方法。在一些情况下，可以使用lcm捕获没有信号的样本区域。在一些情况下，可以使用lcm捕获具有信号的样本区域。在一些情况下，可以使用lcm捕获具有高于阈值的信号的样本区域。在一些情况下，可以使用lcm捕获具有低于阈值的信号的样本区域。在一些情况下，可以使用lcm捕获具有高于第一阈值且低于第二阈值的信号的样本区域。
[0146]
可以进一步分析使用lcm捕获的组织。在一些情况下，该进一步分析可包括色谱分析，例如hplc、gcms、lcms或其他色谱方法、蛋白质印迹、基因分型、pcr分析或其他分析技
术。实施例5：使用hrp的元素检测
[0147]
在一些情况下，可以使用hrp作为检测组分来进行本文的方法。在这种情况下，该方法可以如本文所述进行。在到达检测步骤后，可以使hrp暴露于有机底物和过氧化氢。在一些情况下，底物可以是鲁米诺。如果底物是鲁米诺，则可以检测到发光。如果底物是abts、opd、amplexred、高香草酸、tmb、aec、dab，则检测可以是比色法。
[0148]
尽管已经在本文中示出和描述了本发明的优选实施方案，但是对于本领域技术人员而言显而易见的是，这些实施方案仅作为实例提供。在不脱离本发明的情况下，本领域技术人员现在将想到许多变化、改变和替换。应该理解的是，本文描述的本发明的实施方案的各种替代方案可以用于实施本发明。意图是，以下权利要求限定本发明的范围，并且由此涵盖这些权利要求范围内的方法和结构及其等同方案。