一种被HIV和/或SIV感染的细胞的标志物及其应用的制作方法

一种被hiv和/或siv感染的细胞的标志物及其应用
技术领域
1.本发明涉及生物医药领域。具体涉及一种被hiv和/或siv感染的细胞中的标志物及其应用，更具体地说，本发明提供了将plk蛋白用于检测hiv和/或siv感染的细胞以及清除该细胞的用途，通过对hiv和/或siv感染的细胞进行处理以检测和清除该细胞的方法，以及提供了抑制hiv和/或siv感染的细胞内病毒释放的方法。


背景技术：

2.hiv感染已对全球生命健康构成重大威胁，目前的抗hiv疗法，只能有效控制病毒的积极复制，而不能彻底根治。hiv感染者在进行抗病毒治疗(highly active antiretroviral therapy, haart)后，血浆内的病毒载量迅速下降，直到最低检测限以下(<20拷贝/ml)。然而，一旦停止抗病毒治疗，体内的病毒会迅速反弹。因此，绝大多数艾滋病患者需要终身进行抗病毒治疗（极少数精英控制者除外）。停药后病毒将快速反弹、病情复发难以根治的主要原因是“hiv储存库细胞”的存在，这也是艾滋病难以实现彻底治愈的最根本原因。因此，需要寻找出有效且安全地针对这些被hiv感染的储存库细胞的检测方法和清除方法。
3.现有hiv储存库的检测方法基本都是在实验室条件下通过激活hiv储存库细胞，比如：采取通过添加类似植物凝集素（phytohemagglutinin，pha）等物质激活hiv储存库细胞，使其大量释放子代病毒，从而对释放的病毒量进行检测并估算hiv储存库细胞的大致存量。该检测方法的缺点在于，（1）其无法做到标准化和定量化。（2）hiv储存库细胞一旦被激活后，虽能够促发病毒释放，但已经缺失了hiv储存库的重要生理特性。因此其释放的病毒已不具有潜伏病毒的特征。
4.本领域内都在研究以理论上国际广泛认可的震动疗法（shock&kill）为基本治疗原则的方法。与现有的检测方法类似的，在shock&kill治疗原则中，也首先需要潜伏逆转剂（latent reversal agents，lras）激活/shock储存库细胞内的潜伏病毒，然后被杀伤性cd8 t细胞发现而被清除。然而，在治疗方法研究方面，目前遇到的关键问题在于：激活cd4 t储存库细胞中潜伏病毒的lras并不能特异性作用于储存库细胞，而导致机体稳态失衡或使人体免疫系统非特异性活化。因此，如果采取目前的策略进行shock&kill治疗，会使病人机体稳态失衡和免疫紊乱，甚至致命。因此，shock&kill疗法在基础实验上取得成功，却无法进入临床治疗。猴免疫缺陷病毒（simian immunodeficiency virus，siv），也称为非洲绿猴病毒，作为一种非洲灵长目的逆转录病毒，具有与hiv类似的特性。
5.综上所述，在被hiv和/或siv感染的细胞中寻找一种标志物，达到不激活hiv储存库细胞，不造成机体稳态失衡仍然能够促发其释放大量子代病毒，从而能够在安全的生理条件下检测到这些细胞，并在体内被自身免疫系统或者相关抗病毒药物所识别和清除，以及在被hiv和/或siv感染的细胞内直接抑制病毒释放都具有重要的临床意义。
6.polo样激酶（polo
‑
like kinase，plk）是细胞周期进程中的重要调控因子，家族成员主要包括plk1，plk2 ，plk3 ，plk4和plk5。其中，有研究指出plk3与细胞应激反应和基因
双链断裂修复有关。在细胞系中，plk3蛋白以微管依赖的方式与中心体结合，参与有丝分裂并定位于有丝分裂装置。激酶缺陷突变体的表达导致了微管动力学的改变和细胞凋亡引起的细胞形态异常。然而截止目前，尚无任何关于plk3蛋白在被hiv和/或siv感染的细胞中的具体功能机制等信息的报道。


技术实现要素：

7.为了解决上述问题，本发明提供了一种被hiv和/或siv感染的细胞中的标志物及其应用。借助该标志物（即plk蛋白），通过对被hiv和/或siv感染的细胞进行处理而使这类细胞释放子代病毒，以检测和清除该细胞的方法，以及提供了一种可以直接抑制被hiv和/或siv感染的细胞释放子代病毒的方法。
8.为了实现上述目的，本发明提供了如下技术方案。
9.本发明提供了一种被hiv和/或siv感染的细胞中的标志物，其特征在于，所述标志物为plk蛋白。
10.进一步地，所述标志物plk蛋白为plk3蛋白。
11.更进一步地，所述标志物plk3蛋白为plk3
‑
201蛋白，所述plk3
‑
201蛋白的氨基酸序列如seq id no.1所示。
12.本发明还提供了一种能够抑制plk蛋白活性的物质在制备用于检测和清除被hiv和/或siv感染的细胞的用途，其特征在于，所述能够抑制plk蛋白活性的物质含有如下i
‑
iv中至少一种物质：i、小分子化合物；ii、plk蛋白抑制剂，包括如下：wortmannin、volasertib、bi2536、gw843682x、tak960、poloxin、lfm
‑
a13、seb13 hydrochloride、tc
‑
s 7005、tak
‑
960 dihydrochloride、seb13和tak
‑
960 hydrochloride；iii、plk蛋白的特异性抗体或其抗原结合片段；iv、作为plk蛋白靶向抑制剂的sirna或者shrna。
13.进一步地，所述抑制plk蛋白活性为抑制plk3蛋白活性。
14.本发明还提供了一种检测被hiv和/或siv感染细胞的方法，其特征在于，所述方法是通过抑制被感染的细胞中plk蛋白活性使该细胞开始大量释放可被检测的子代病毒达到检测的目的。
15.本发明还提供了一种清除被hiv和/或siv感染的细胞的方法，其特征在于，所述方法是通过抑制被hiv和/或siv感染的细胞中plk蛋白活性使被hiv和/或siv感染的细胞开始大量释放子代病毒，进而能够被人体免疫系统特异性识别或者被相关抗病毒药物所识别，以达到清除被hiv和/或siv感染的细胞的目的。
16.进一步地，所述的检测和清除被hiv和/或siv感染的细胞的方法，其特征在于，所述被hiv和/或siv感染的细胞包括：被hiv和/或siv感染的细胞、被hiv和/或siv感染的外周血细胞、cd4 t细胞、自然杀伤细胞、巨噬细胞、树突状细胞和神经胶质细胞。
17.进一步地，所述的检测和清除被hiv和/或siv感染的细胞的方法，其特征在于，所述方法中抑制plk蛋白活性为抑制plk3蛋白活性。
18.本发明还提供了一种在被hiv和/或siv感染的细胞内直接抑制病毒释放的方法，
蛋白翻译的作用，对于hiv
‑
1有特异性的抑制性。
51.人类plk蛋白具体有五种，plk1蛋白、plk2蛋白、plk3蛋白、plk4蛋白以及plk5蛋白。检测所有五种人类plk蛋白和灵长类plk3蛋白的抗hiv
‑
1活性。相对于阴性对照组，不同表达量的人类plk3将hiv
‑
1的侵染性降低至阴性对照组的1/11和1/115。而人类plk1蛋白、plk2蛋白、plk4蛋白和plk5蛋白没有显示出抗hiv
‑
1活性。黑猩猩（chimpanzee）plk3蛋白和猕猴（macaca）plk3蛋白也能够降低hiv
‑
1的侵染性，只不过降低幅度与人类plk3蛋白相比稍稍不同。这说明灵长类的plk3家族蛋白都可能具有抗hiv
‑
1活性。具体试验步骤如下：293t细胞分别用3
×
flag标记的人类plk1、plk2、plk3、plk4和plk5蛋白表达载体, 3
×
flag标记的黑猩猩plk3蛋白表达载体和3
×
flag标记的猕猴plk3蛋白载体转染，包括阴性对照组在内均用pnl4.3处理。在转染后48小时，上清液用于感染tzm
‑
bl报告细胞，以得到病毒的感染水平。每次测量数据均已减去背景rlu（图7，8）。
52.实施例3。
53.plk3蛋白对于hiv
‑
1具有抑制性，该抑制性体现在对cxcr4嗜性和ccr5嗜性包膜蛋白包裹的hiv均具有抑制作用，而不影响gag的转录。
54.人类plk3蛋白表现出了非常强的阻止hiv
‑
1侵染的能力，并且不会影响gag转录。具体试验步骤如下：用3
×
flag标记的plk3蛋白表达载体转染293t细胞，包括阴性对照组在内用pnl4.3
∆
e
‑
gfp以及分别表达vsv
‑
g、pdol
‑
gp160、psf162
‑
gp160、pad8
‑
gp160或者p89.6
‑
gp160的载体处理。在转染48小时后，上清液用于感染tzm
‑
bl报告细胞，以得到病毒的感染水平，每次测量数据均已减去背景rlu（图9）。提取的所有rna都进行qpcr以量化的gag转录物，以磷酸甘油醛脱氢酶进行归一化（图10）。
55.实施例4。
56.plk3蛋白对于hiv
‑
1、hiv
‑
2和siv具有抑制性，该抑制性体现在对野生型ccr5嗜性病毒（ad8和bal）、双嗜性病毒（89.6）、hiv
‑2rod
和siv
agm
均具有抑制作用。
57.人类plk3的表达也展现出了对于hiv
‑1ad8
、hiv
‑1bal
、hiv
‑189.6
、hiv
‑2rod
和siv
agm
侵染的限制能力。具体试验步骤如下：用3
×
flag标记的plk3蛋白表达载体转染293t细胞，包括阴性对照组在内均用病毒载体pad8（图11）、p89.6（图12）、pbal（图13）、phiv
‑2rod
（图14）和psiv
agm
（图15）处理。在转染48小时后，上清液用于感染tzm
‑
bl报告细胞，以得到病毒的感染水平，每次测量数据均已减去背景rlu。
58.实施例5。
59.plk3需要其激酶活性以实现其对于hiv
‑
1的抑制作用。plk3激酶抑制剂或激酶结构域缺失突变能够抑制plk3对于hiv
‑
1的抑制作用。
60.人类plk3是polo样激酶。使用plk3激酶抑制剂gw843682x处理，虽然plk3的表达水平没有变化，但是其抗病毒能力受到抑制。使用gw843682x或plk3激酶结构域突变载体分别处理并观察结果。gw843682x或plk3激酶结构域突变能够抑制人类plk3的抗hiv
‑
1病毒能力。具体试验步骤如下：用3
×
flag标记的plk3蛋白表达载体，转染24小时后，包括阴性对照组在内均用nl4.3.luc（vsv
‑
g）进行处理。同时使用gw843682x处理细胞。在转染48小时后收集细胞进行流式细胞术检测（图16）。用3
×
flag标记的plk3激酶结构域缺失突变蛋白表达载体，转染24小时后，包括阴性对照组在内均用nl4.3.luc（vsv
‑
g）进行处理。在转染48小时后收集细胞进行流式细胞术检测（图17）。