传感器的制作方法

1.本发明是关于涉及传感器阵列的方法以及传感器阵列用于对癌症进行诊断、分期或监测的用途。所述传感器阵列通过从蛋白质桶(barrel)中置换(displacement)报道染料(reporter dye)而起作用，并且可通过差分方法(differential method)进行分析，所述差分方法通常被称为“人工嗅觉(artificial olfaction)”或“人工鼻(artificial nose)”方法。


背景技术：

2.存在两种主要的使用生物分子或受生物启发的分子进行感测的方法。第一种是：“锁钥(lock
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and
‑
key)”方法，其中为每种目标分析物产生高度特异性的传感器分子，例如抗体。必须优化这些类型的传感器以对目标分析物具有高度选择性，并且因此需要进行每种分析物的昂贵的开发和优化过程。
3.第二种方法类似于嗅觉系统，并且使用较低特异性的受体的阵列。该概念是单个靶分子或混合物不同程度地结合这些受体中的数种和/或与之反应，从而在阵列中产生独特的特征。这避免了为每种分析物开发高度特异且通常昂贵的受体的需求。该第二种方法称为差分感测或阵列感测。
4.差分感测的第一种方法是设计染料分子的阵列并且分析物直接与染料分子结合或与染料分子发生化学反应的方法。you，zha和anslyn(2015)提供了这样的阵列及其应用的全面综述。但是，这样的阵列的设计是复杂的，因为通常必须设计定制的染料，并且这些染料必须(a)提供光信号，(b)结合多种分析物，以及(c)在结合之后改变光学特性。甚至一旦被发现，这些定制的染料可涉及复杂的合成和昂贵的材料，从而提高了最终阵列的成本。
5.差分感测的一种不同的方法是使用报道染料从受体的置换。这允许将多样性改造到受体中，而不是染料中，这使得能够使用低成本的常规染料作为报道染料。这样的阵列的综述也可见于you，zha和anslyn(2015)中。下面讨论具体的代表性实例。
6.通常使用的受体/染料组合是短肽、金属离子和报道染料的系综(ensemble)。金属离子与短肽和报道染料二者均结合，并且分析物将报道染料从金属离子置换。umali和anslyn(2010)描述了可用于不同分析物类别的这种系综的许多变化形式。例如，在一个阵列中，肽用胍基基团修饰以结合核苷酸磷酸，并且在另一阵列中，肽用硼酸基团修饰以结合糖肽和糖。在最近的工作中，这样的阵列用于表征酒(umali等，2015)和木材提取物(ghanem等，2017)的多酚组合物。然而，这些系综感测阵列需要仔细制备来自至少三种组分(报道染料、金属离子和至少一种肽)的系综。由于需要与金属离子结合的报道染料和可将报道染料从与金属离子的结合中置换的分析物，因此这样的阵列也对非极性疏水性分子缺乏灵敏度。
7.避免需要金属离子的一种方法使用血清白蛋白作为受体。来自不同来源动物的血清白蛋白已被用于提供多种受体，并且多种疏水性染料被用于在血清白蛋白结合位点内结合。这些阵列已用于区分萜烯(adams和anslyn，2009)、脂肪酸和油类(kubarych，2010)、甘
油酯(diehl等，2015)和在不同的塑性炸药中发现的增塑剂(ivy等，2012)。虽然可用，但基于血清白蛋白的阵列仅限于检测和区分疏水性分子，例如上文讨论的那些。
8.本发明寻求提供一种简单、低成本和稳健的受体和染料系统，其可形成用于在分析物之间进行检测和区分，并且特别是可用于癌症的诊断、分期或监测的阵列。因此，本发明试图克服现有技术的限制。


技术实现要素：

9.根据第一方面，本发明提供了对癌症进行诊断、分期或监测的方法，所述方法包括以下步骤：(a)提供包含至少两个传感器的传感器阵列，其中每个传感器包含含有布置为α
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螺旋桶的五个或更多个α螺旋的蛋白质桶和报道染料，其中所述蛋白质桶限定腔，所述报道染料可逆地与所述腔结合，并且其中在所述至少两个传感器中的蛋白质桶的结构不同；(b)使所述传感器阵列与从患者获得的样品接触；以及随后(c)将所述传感器阵列与预定标准进行比较。
10.本发明人已意识到包含蛋白质桶和报道染料的传感器阵列(如在他们未公开的国际专利申请号pct/gb2018/052521中所述)可有利地用于癌症的诊断、分期或监测。
11.目前具有大量检测和监测癌症的方法。这些方法中的大多数可被初步分类为以下三组之一：
12.(1)活检。一旦确定了“可疑”组织或生长，这通常涉及去除肿瘤的一小部分，这可涉及根据肿瘤的性质和位置对具有不同侵袭性程度的患者进行手术。一旦去除，在实验室中使用多种生物化学和成像技术对可疑细胞进行分析。大多数活检作为福尔马林固定石蜡包埋的(formalin
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fixed paraffin
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embedded，ffpe)组织进行处理，并且首先通过h&e(苏木精和伊红染色)评估形态。根据癌症类型，多种蛋白质的表达将通过免疫组织化学进行评估和/或特定染色可用于查看特定的结构或特征以帮助病理学家进行诊断。一些活检物包括乳腺、胃肠道间质瘤、神经病和肉瘤，也可进行荧光原位杂交(fluorescent in situ hybridisation，fish)以鉴定特定的易位或基因扩增。也可进行分子病理学，包括聚合酶链式反应(polymerasechain reaction，pcr)或测序(焦磷酸测序、sanger或下一代方法)，以确定其中靶向治疗可用的分子亚型，或者帮助诊断和管理疾病。因此，该信息可用于诊断癌症类型和阶段，并且可确定生长为恶性，或者替代地将其确定为良性。可有利地使用本发明代替现有技术以确定细胞是癌性的还是良性的，并且甚至确定癌症处于哪个阶段，如下文所说明的。
13.(2)扫描。当试图确定给定患者是否具有有必要进一步研究的癌样生长时，存在可用于医学行业的多种不同的扫描技术。这些包括ct扫描、核医学扫描、超声、mri、pet和x射线。这些扫描为观察患者内生长的给定肿瘤的位置、尺寸和分布提供了机会。
14.(3)血液(或其他体液)测试。这些是可用的并且通常用作前面提及的测试的前奏的最简单、侵入性最小和最便宜的测试，其提供了对可能存在的肿瘤的位置和尺寸的更具体的确定。简言之，这些测试观察了从患者收集并针对已知与体内癌症存在相关的标志物进行测定的样品(血液、尿或粪便等)。这可采取以下形式：抗体检测(例如前列腺癌的psa的升高，或卵巢癌的ca125的升高)、全血细胞计数(complete blood count)、全细胞检测以及对已知从肿瘤“渗漏(leak)”并进入血流的循环dna片段进行测序。
15.已知细胞(包括肿瘤细胞)可将多种物质分泌到血流中(liotta等，2003)。这些细胞分泌的因子统称为分泌组(secretome)(tjalsma等，2000)，其组成包括从蛋白质和脂质到代谢物和胞外囊泡的多种生物活性分子。分泌组的组分是细胞行为和生理学的基础，在细胞增殖、代谢、迁移和侵袭所需的过程中发挥关键作用。这些过程还被充分描述为癌症的标志(hanahan和weinberg，2000；hanahan和weinberg，2011)，并且因此改变的癌细胞分泌组由此可在疾病进展中发挥重要作用。利用这一事实，已评估了癌细胞和非癌细胞的分泌组，特别是在蛋白质组水平上，来试图帮助发现不仅可推断癌症的存在或不存在，还试图告知癌症类型的生物标志物。(collection of relevant reviews surmised by donadelli.，2018.)。然而，应注意的是，肿瘤微环境中的其他细胞，包括癌症相关的成纤维细胞和免疫细胞，也可分泌可以影响疾病进展的因子。它们分泌的物质的谱被称为它们的“分泌组”。本发明人已意识到，根据本发明的传感器阵列可有利地用于在健康志愿者与癌症患者中检查循环的小生物分子的分类，并且可在本发明中使用差分来诊断癌症。
16.还已发现，根据肿瘤是原发性癌症还是继发性/转移性癌症，肿瘤细胞的分泌组是不同的。值得注意的是，即使当肿瘤细胞是同源的，即来自相同的原始肿瘤，情况也是如此。本发明人出人意料地发现，本发明中的传感器阵列可用于区分原发性与继发性癌细胞的分泌组，并且因此可用于对癌症进行分期。更详细地讲，来自发明人之一的最近的工作表明，在肿瘤抑制蛋白p53中功能突变增加的肿瘤细胞在其分泌组中具有可影响转移过程的可扩散促侵袭因子(novo等，2018)，并且他们目前正在对来自原发性和转移性癌细胞系的限定的分泌组室(compartment)进行表征。然而，为支持该申请而产生的数据已表明，本发明能够区分由原发性癌细胞系与转移性癌细胞系调节的培养基(图17)。
17.本发明人还意识到本发明的传感器通过生成个体的整个生物流体(血液、尿等)的“指纹”而不是集中于特定流体/样品中的单一生物标志物来提供他们健康的快照(snapshot)的潜力。对于给定患者，该指纹可随时间(例如，在具有gp的年度检查时)追踪，并且在指纹的首个迹象发生变化并朝向可表明存在癌症的迹象移动时，患者转介至专门的治疗和扫描。以这种方式，本发明的方法可用于监测癌症的发作。通过随时间测试来自患有癌症的相同患者的样品，该方法还可用于监测癌症从原发性到继发性的进展，或癌症的缓解，以及特定治疗方案的有效性。
18.本发明为目前使用的那些提供了许多优点。它具有比目前用于对癌症进行诊断、分期和监测的技术明显更便宜的潜力。它还可以是侵入性较小的，因为可在第一情况下对体液进行采样。也可测试来自活检的样品。如上所述，与许多传统方法形成对比，本发明的传感器阵列可使用差分方法来分析复杂的混合物，而不是测试一种特定生物标志物的存在或不存在，从而允许采取全面得多的方法。本发明可用于在一般群体中提供简单且稳健的癌症首次通过测试(first pass test)，具有挽救无数生命的潜力。
19.传感器
20.报道染料是这样的染料：在不存在任何分析物的情况下与腔的结合和当这种结合被破坏时之间提供不同的光信号。破坏包括报道染料从腔被逐出(eject)或报道染料在腔内的构型改变。在不存在分析物的情况下，报道染料与腔结合并产生第一光信号。在存在分析物的情况下，报道染料完全从腔被置换或以不同的构型保留在腔内，以使得报道染料的信号被改变。
21.在本发明中，被检测的“分析物”存在于从患者获得的样品中。
22.任何单个传感器通常均包含多个蛋白质桶。导致报道染料从腔被逐出的分析物通常不会导致染料从传感器内的所有蛋白质桶被逐出。这样的分析物将通过与染料的直接竞争或通过别构效应来改变报道染料的解离常数，以使得相对于报道染料的不结合，报道染料的结合的平衡位置移位。
23.通过在不同的传感器中使用具有不同结构的蛋白质桶，分析物将不同程度地与不同的蛋白质桶结构相互作用，从而不同程度地影响传感器的光学特性，并在整个传感器阵列上生成特异于该分析物的光信号模式。
24.在基于置换的差分感测中使用α
‑
螺旋蛋白质桶提供了优于现有技术的许多优点。例如，与现有技术形成对比，蛋白质桶不限于在癌症诊断、分期和监测的情况下检测特定分析物类别，并且提供成功地区分广谱靶标分子和混合物(包含疏水性和非疏水性分析物二者)的能力。
25.这样的一个原因是蛋白质桶的结构在腔表面上提供了非常大的表面积。结合的报道染料被腔表面在所有侧包围，这意味着报道染料的化学环境直接由腔表面的大量氨基酸侧链决定。更详细地讲，对于α
‑
螺旋桶，通常每个螺旋有形成腔表面的至多8个氨基酸侧链，即具有5个螺旋的α
‑
螺旋桶有40个氨基酸侧链，具有6个螺旋的α
‑
螺旋桶有48个氨基酸侧链，等等。在刚性蛋白质桶上有利地提供这种大的表面积，其中腔表面上的任何或理论上所有氨基酸侧链可被修饰以最终提供具有不同化学环境的大量多种不同蛋白质桶。在一个实施方案中，多至50％的氨基酸侧链被修饰，例如在七聚体的腔表面中每条链4个，因此总共28个。
26.即使在每个残基处可能限制20个核糖体、标准氨基酸或蛋白原性(proteinogenic)氨基酸，这也已经提供了化学环境的大量多样性。因此，可从数百万个可能的选项中选择传感器阵列中使用的不同桶，从而允许使用具有非常多样的特性的蛋白质桶。尝试使用蛋白质(例如血清白蛋白)来获得这样的多样性将最有可能导致三级结构的破坏，从而导致沉淀的蛋白质完全失去结合能力。
27.令人惊讶的是，蛋白质桶传感器不限于可在蛋白质桶腔内结合的分析物。因此，与蛋白质桶的外部相互作用的分析物可以以类似于自然界中发现的受体结合位点的别构调节的方式来改变蛋白质桶腔内的环境。这种改变可改变报道染料的结合常数，驱逐一部分或所有的报道染料，或者这种改变可改变腔以使得报道染料保持结合但具有不同的光学特性。不管潜在的原因，这种作用为传感器阵列提供了用于比仅可在腔内结合的分析物更广谱的分析物的能力。再次在刚性蛋白质桶上提供大的外表面积，其中外表面上的任何或所有氨基酸侧链可被修饰以提供化学环境的大量多样性。
28.此外，对于每个传感器，观察到的信号不是简单的二元信号，例如“荧光”或“非荧光”。相反，在全信号和无信号之间存在连续性。由于可能的蛋白质桶的这样的巨大化学空间，并且由于该化学空间内的每个特定蛋白质桶提供了连续的响应，因此本发明的传感器测定使得能够进入先前难以到达的分析空间。这样的总体效果是具有无与伦比的在广谱分析物之间进行区分的能力的传感器阵列。
29.我们已经注意到，非常稳定的三级结构的显著优点是该结构可容易地适应点突变，特别是那些侧链在腔内内部地指向或外部地指向主体溶剂(bulk solvent)的残基。这
意味着可在不损害蛋白质桶折叠的情况下，可行地访问上述大量化学空间。蛋白质桶三级结构的这种稳定性另外地意味着对结构进行计算建模并使用合理的设计概念来创建具有期望多样性的阵列是非常简单的。
30.蛋白质桶的稳定且良好限定的三级结构的另一个优点是重复测定间的高再现性。蛋白质桶的稳定性意味着它们在长时间内保持稳定从而提供传感器阵列的长货架期和/或重复使用，并且意味着它们响应于同一分析物产生相同的可靠信号。此外，桶可进行冷冻干燥，这允许更好、更安全和更长的储存。然后仅通过添加水性缓冲液来重构桶。
31.还可通过建立的肽合成技术或通过合成基因的重组表达以非常低的成本产生蛋白质桶。这种低成本使得能够大量生产和/或一次性使用传感器阵列。
32.因此，传感器阵列可被部署在一系列应用中。例如，传感器阵列可用于识别复杂混合物中的特定化合物以区分复杂混合物或区分非常相似的分子，包括对映体和对映体混合物。本文中讨论的具体实例涵盖多种小分子和生物分子(例如蛋白质)二者的检测。在本发明的方法中，传感器阵列与从患者获得的样品一起使用，如下文所讨论的。
33.传感器阵列的报道染料提供光学特征，从而允许开发灵敏但低成本的一次性芯片，所述芯片可使用便携式手持设备或智能手机进行读取和处理。从长远来看，设备的便携性将有助于“在线(in line)”、“在现场(in field)”或“在床边(at bedside)”分析；换句话说，将分析视为问题而不是将问题带到实验室。特别地，这种技术允许强大但便宜的传感器设备，所述设备可用于促进有关患者癌症的快速且价廉的信息。
34.蛋白质桶包含布置为α
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螺旋桶的五个或更多个α螺旋。α
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螺旋桶通常是水溶性的，具有疏水性腔。天然的和从头设计的α
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螺旋桶二者均是已知的，参见malashkevich等，1996；koronakis等，2000；zaccai等，2011；fletcher，2012；meusch等，2014；sun等，2014；thomson等，2014；collie，2015；lombardo等，2016和rhys等，2018。一些发明人的出版物(thomas等，2018)公开了结合dph但不在传感器阵列中的单个α
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螺旋桶。α
‑
螺旋桶包含卷曲螺旋寡聚体，其中主要特征是腔的存在。虽然具有少于五个α螺旋的卷曲螺旋寡聚体是已知的，但五个α螺旋似乎是限定腔所需的最小数目。已经报道了具有五个、六个、七个、八个、十个和十二个α螺旋的α
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螺旋桶。
35.可非常精确地控制α
‑
螺旋桶的尺寸。控制组成型α螺旋的长度可控制α
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螺旋桶的长度。改变构成α
‑
螺旋桶的α螺旋的数目可控制腔的直径。
36.α
‑
螺旋桶具有非常稳定的三级/四级(3d)结构。此外，α螺旋包含极可预测的七肽(heptad)重复序列。这允许对形成和稳定α
‑
螺旋桶3d结构的氨基酸残基以及α
‑
螺旋桶的腔表面和外表面上的氨基酸残基进行精确建模(如例如在thomson等，2014中所报道的)。α
‑
螺旋桶的稳定性还允许传感器阵列进行干燥和重构、在非水性溶剂中洗涤和/或在固体支持物上固定。
37.α
‑
螺旋桶可通过合成获得。α
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螺旋桶可包含相同的α螺旋，其中每个α螺旋均包含相同但分开的氨基酸链。这意味着仅需要合成单个α螺旋，在此之后，α
‑
螺旋桶将自组装。这简化了合成α
‑
螺旋桶并降低了其成本。
38.α螺旋通常包含具有重复单元的序列，所述重复单元具有序列abcdefg，其中a和d位置的50％或更多是疏水性氨基酸，并且其中b、c、e、f和g位置的50％或更多是极性氨基酸。
39.α
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螺旋七肽重复单元的性质通常意味着a和d位置形成限定腔的腔表面，即α
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螺旋桶的内表面。
40.α
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螺旋桶的一个重要特征是3d结构的刚性性质允许同时改变多个氨基酸残基。α
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螺旋桶的腔通常是疏水性的。但是，对于任何另外的氨基酸，面向腔的多至50％的氨基酸侧链可被改变。甚至可使用极具极性或带电荷的官能团。由于α
‑
螺旋桶的刚性性质，可设计桶以使得极性官能团可非常精确地定位在另外的疏水性腔中而不引起α
‑
螺旋桶的展开。
41.在疏水性腔的情况下，报道染料通常应为疏水性的。但是，在腔中的极性残基的情况下，可容纳更广泛多种的染料。对于在腔内结合的分析物，可容纳相似的多种分析物。然而，如上所述，分析物也可与α
‑
螺旋桶的外表面相互作用。
42.在一些具体实施方案中，重复单元可选自由以下组成的列表：
43.lqkiefi，lkaiafe，lkeiafs，ikeiafs，lkeiafa，fkeiafa，ikeiafa，ikevafa，
44.vkevafa，vkeiafa，mkeiafa，lkqiefi，lkevafa，vkelafa，ikelsfa，
45.ikelafs，lkelafs，fkeiafa，lkqiefi和lkelafa；
46.其中f在重复单元之间可以不同。在任何给定的α螺旋中或在α
‑
螺旋桶中，至多40％，优选至多25％，更优选至多10％的氨基酸残基可不同于重复单元。
47.在a和d位置形成疏水性核的七肽重复单元中，f位置通常表示侧链直接指向主体溶剂的氨基酸。因此，在f位置处的氨基酸在重复单元之间可以不同。
48.每个α螺旋可包含至少三个重复单元。三个重复单元提供足够长的腔以结合广泛的报道染料。
49.整个蛋白质桶可包含核糖体、标准或蛋白原性氨基酸对映体。或者，蛋白质桶可包含非天然氨基酸。完全的对映体蛋白质桶可形成检测对映体分析物的基础。也可并入人工氨基酸。人工氨基酸可包含已被另外官能化的天然氨基酸。在一个具体实施方案中，天然氨基酸可以是已通过翻译后修饰例如通过磷酸化或糖基化而另外官能化的。
50.非天然氨基酸可以是已通过化学连接蛋白质底物而被修饰的氨基酸。具体地，蛋白质底物可包含酶底物、受体底物和/或抗体底物。蛋白质底物可简单地用于蛋白质结合位点以结合。蛋白质底物也可以是酶可修饰的反应位点。例如，蛋白质底物可以是激酶的磷酸化底物。因此，报道染料信号可在结合之后受到激酶或磷酸化的影响。
51.蛋白质桶可包含单个并且连续的氨基酸骨架。因此，蛋白质不会由单独的蛋白质亚基自组装。因此，不需要考虑由蛋白质亚基(即四级结构)自组装的方式。因此，单个并且连续的氨基酸骨架可另外地限制蛋白质二级结构的元件在折叠中的位置。
52.在α
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螺旋桶的情况下，例如，每个螺旋可具有不同的结构，或者桶的仅一个螺旋可包含带电荷的残基。对于单独的α螺旋亚基，将需要考虑可形成的螺旋桶的不同排列。在单个并且连续的氨基酸骨架的情况下，可通过仔细设计单个并且连续的氨基酸骨架来很大程度地去除这种构型，所述单个并且连续的氨基酸骨架折叠成α螺旋(即二级结构)，所述α螺旋进而折叠成α螺旋桶(即三级/四级结构)。
53.总体而言，可实现相对于对蛋白质桶结构进行特定改变的显著控制。
54.蛋白质桶可在溶液中，但是在本发明的一个实施方案中，蛋白质桶固定在基底上。这实现了这样的传感器阵列：其中分析物溶液可流过传感器或其中传感器可被洗涤并且再次使用。此外，固定化提供了这样的传感器阵列：其中传感器之间没有物理障碍，从而为阵
列微芯片提供了基础。这样的阵列微芯片所需的蛋白质桶的量极小，可少于一微克，例如0.01至1微克。
55.报道染料也可固定在基底上或蛋白质桶上，只要报道染料仍然能够可逆地进入蛋白质桶腔即可。这样的固定提供了不能被洗掉或干扰相邻传感器的报道染料和蛋白质桶，并且提供了可重复使用的传感器阵列或可用于在线感测的传感器阵列。
56.蛋白质桶也可位于水凝胶或三维多孔支架上或之中。这有助于使桶用于感测可溶解在水凝胶中并且变得易于接触桶的气态分析物。
57.蛋白质桶和报道染料可处于干燥状态。换句话说，蛋白质桶和报道染料的复合体已被干燥。因此，传感器阵列处于干燥状态。干燥状态适合储存，但通常在进行分析之前应再水化。如果分析物是水性的，则可通过分析物以简单的方式实现再水化。因为蛋白质桶高度稳定，因此可使用干燥状态。
58.在一个优选实施方案中，当与腔结合时，报道染料提供光信号。由此，我们意指当报道染料与腔结合时，存在可测量的光信号。通常，这将意味着当报道染料处于游离溶液中时没有光信号。这具有优于相反的方案的优点，在相反的方案中，报道染料在游离溶液中提供信号，但当与腔结合时不提供信号，但是相反的方案也是可能的。
59.在添加任何分析物之前，与蛋白质桶结合的报道染料的静止状态是可测量正信号的状态。这提供了在开始测定之前检测每个传感器中的报道染料和蛋白质桶是否完整的快速方法。另外，假设在某些情况下，报道染料可不响应于分析物而离开腔。相反，可响应于腔构型的变化，报道染料在腔内采用不同的构型，这种构型的变化也导致光学特性的变化。如果报道染料在结合时淬灭，则这样的变化将不可观察。此外，这可通过在结合报道染料之后在腔的任一端附加封闭基团而允许将报道染料封装在腔内。这样的复合体将通过响应于靶分析物而改变腔内报道染料的构型来操作。以这种方式封装报道染料实现了稳健的传感器，其可重复使用或用于例如在线传感器等的应用中，因为报道染料不会被洗掉。
60.报道染料可以是根据式i的化合物
[0061][0062]
其中，n为3或更大，优选地n为3、4或5，更优选地n为3；并且r1和r2独立地选自芳基或杂芳基，优选芳基，更优选苯基。优选地，报道染料是1，6
‑
二苯基
‑
1，3，5
‑
己三烯。诸如这些的报道染料是长的，薄的和疏水性的，这意味着它们非常适合于在蛋白质桶腔内结合。此外，诸如这些的报道染料在游离溶液中不提供光信号。然而，在与蛋白质桶腔结合时，未缀合的链弯曲并且可响应于紫外线而提供荧光信号。
[0063]
传感器阵列可包含至少10个传感器，优选至少50个传感器，更优选至少100个传感器，再更优选至少300个传感器，其中蛋白质桶在所述至少10、50、100或300个传感器的每一个中分别是不同的。预计将需要约16个传感器以检测最商业相关的小分子和大分子分析物，每个传感器具有不同的蛋白质桶。当然，平板读取器通常设置为读取96
‑
、384
‑
和1536
‑
孔板，尽管对照和复制将通常降低任何板中独特传感器的数目。
[0064]
传感器阵列可包含至少一个另外的传感器，其中报道染料在至少一个另外的传感器中是不同的。改变报道染料是实现整个阵列信号变化的另一种方法。通过使用具有与式i的理化特性不同的理化特性的报道染料，进一步提高了区分不同分析物的能力。可使用的典型的报道染料包括所有的萘染料，例如6
‑
丙酰基
‑2‑
二甲基氨基萘(prodan)。
[0065]
传感器阵列可被并入至微阵列芯片中。如上所述，可使用蛋白质桶和报道染料来制造微阵列芯片。这可以是低成本的、一次性的或可重复使用的微阵列，具有强大的识别广泛多种分析物的能力。可通过智能手机读取微阵列，从而使广大群体可使用这种传感器技术。
[0066]
方法
[0067]
在本发明的方法中，传感器阵列与从患者获得的样品接触。样品将通常为液体形式，并且将包含生物物质。
[0068]
例如，直接从患者获得的样品可以是任何合适的体液或物质，包括例如全血、血浆、血清、脑脊液、唾液、精液、痰、尿或粪便。这些样品将包含来自体内细胞(可以是癌性或非癌性的)的分泌组，并且因此可用于分析该分泌组。体液可直接用于本发明的传感器阵列中，或者可通过过滤或离心进行处理以去除可能存在的任何颗粒物质。可使用使从身体获得的样品更适合于在传感器阵列中的分析的任何其他处理，例如稀释。
[0069]
在另一个实施方案中，从患者获得样品并随后间接使用，从某种意义上讲，从患者收集细胞或其他生物物质并用于获得液体样品。生物物质可从来自患者的任何来源，包括细胞刮擦物、活检组织或骨髓获得。生物物质通常来自活检的肿瘤或组织，所述肿瘤或组织可能是癌性的或者可能不是癌性的。样品通常是其中培养了从患者获得的细胞的液体，也称为上清液或“条件培养基”。
[0070]
患者优选为哺乳动物，特别是灵长类。在一个实施方案中，患者是人。
[0071]
在样品与传感器阵列接触之后，然后将传感器阵列与预定标准进行比较。这将取决于该方法是否用于如下的对癌症的诊断、分期或监测。与预定标准的比较可包括使用计算模式识别，例如使用机器学习、其他或相关人工智能方法实现的那些。本领域技术人员可容易地使用可获得的技术来开发用于分析来自传感器阵列的光学指纹的方法。
[0072]
更详细地讲，如下所述，本发明通过利用这样的事实起作用：健康细胞的分泌组不同于癌细胞。此外，由不同癌细胞产生的分泌组也不同，例如在不同类型的癌症之间，以及在原发性与继发性癌细胞之间。样品将包含从患者的身体获得的细胞的分泌组。传感器阵列可检测到这些分泌组之间的这些差异，即使当作为复杂混合物的一部分存在时也是如此。每个分泌组在测定中产生不同的光信号，从而产生独特的指纹。在本发明中，形成分泌组的一部分的分子是传感器阵列的“分析物”，以及样品中的其余生物流体。
[0073]
设想使用本发明的传感器阵列可检测所有类型的癌症。使用从患有癌症的患者以及健康志愿者收集的样品，可收集一组标准品。使用标准的基于计算机的机器学习技术，技术人员将能够发展区分从患有或不患有癌症的患者收集的样品的能力。技术人员还将能够区分从患有不同种类的癌症和/或不同阶段的癌症的患者收集的样品。技术人员还将能够区分患有原发性或继发性肿瘤的患者。
[0074]
所讨论的癌症可包括：实体癌肿瘤，包括但不限于乳腺癌、胰腺腺癌、结直肠癌、肾
癌、子宫内膜癌、卵巢癌、甲状腺癌和非小细胞肺癌、黑素瘤、前列腺癌、肉瘤、胃癌和葡萄膜黑素瘤；以及液体肿瘤，包括但不限于白血病(特别是髓性白血病)和淋巴瘤。本发明特别地可用于诊断乳腺癌，特别是作为原发性癌症的乳腺癌，和转移性乳腺癌，特别是转移性癌在肺中的情况。
[0075]
设想对于给定患者，将直接或间接获得(或提供)样品。将使用传感器阵列测定样品。这将产生对于该给定样品具有特异性的荧光指纹。计算机辅助机器学习、模式识别或相关的ai或其他技术可用于确定由患者样品产生的指纹是否与由从患有癌症的患者或健康志愿者收集的标准样品产生的指纹最相似。将提供评分来衡量患者指纹与健康或癌性标准品中观察到的指纹的相似性。
[0076]
本发明还可用于确定给定患者中可能存在的癌症的性质和类型，因为已经发现多种癌症类型产生不同的分泌组。
[0077]
对于被确定为患有癌症的患者，可使用计算机辅助机器学习、模式识别、相关的ai或其他技术来分析由患者样品产生的指纹，并将其针对一组标准品(从已知患有特定类型的癌症的患者获得)进行比较以确定指纹最能指示哪种类型的癌症。
[0078]
此外，对于被确定为患有癌症的患者，可使用计算机辅助机器学习、模式识别、相关的ai或其他技术来分析由患者样品产生的指纹，并将其针对由患有原发性肿瘤或继发性肿瘤的患者产生的一组标准指纹进行比较。患者指纹与这两个类别中的任一个的相似性将表明肿瘤是原发性还是继发性来源的。
[0079]
本发明还可用于监测癌症。例如，以确定患者是否响应于旨在从患者身体降低和/或消除癌症的治疗。在该应用中，将在其治疗过程中收集样品。传感器阵列将用于随时间生成一组指纹。每个指纹都将使用计算机辅助机器学习和模式识别技术进行检查。在每一步骤中都将确定指纹与健康或癌性标准品的相似性。患者指纹与由健康志愿者生成的指纹之间的相似性提高将表明治疗是有效的。
[0080]
本发明还可用作常规检查和常规健康监测的一部分。作为可能由gp进行的定期检查的一部分，将收集样品并使用传感器阵列分析。将随时间收集使用特定样品类型(例如血液、血清或尿等)、针对特定患者生成的指纹。这将建立对患者具有特异性的基线指纹。每个指纹都将使用计算机辅助机器学习、模式识别、相关的ai或其他技术进行检查，以监测指纹的任何变化，并检查对于由已知患有癌症的患者生成的指纹的相似性的任何提高。
[0081]
作为本发明的一部分，将从患有多种癌症类型(包括来源于身体不同组织或区域，以及原发性或继发性来源的癌症类型)的患者获得样品。也将从健康志愿者获得样品。这些样品将使用传感器阵列进行分析。这将为每个样品生成指纹。这些指纹将用于训练机器学习、相关算法或其他算法。指纹将组合成一组，以针对给定的预测应用训练特定算法。例如，对于给定患者是否患有癌症的简单预测，将从患有癌症的患者获得的所有指纹组合成单个组。同样地，将来自健康志愿者的所有指纹组合成单个组。然后使用这两个组来训练算法。这两个组的指纹有效地用作针对将进行比较的给定患者的指纹的标准(类似于数据库)。机器学习、相关的ai和算法可用于将给定患者的指纹分类为与癌性或非癌性标准最相似。
[0082]
对于其他预测和分类应用，将根据情况将指纹合并到用于训练机器学习算法的组中。例如，用于原发性与转移性肿瘤负荷分类，或按照癌症类型。
[0083]
在本发明的一些实施方案中，使用本发明的方法被诊断为患有癌症的患者随后可
针对癌症进行治疗，例如通过化学治疗、放射治疗、免疫治疗和/或手术。
[0084]
附图简述
[0085]
图1是示出了以卷曲螺旋布置的两个α螺旋的abcdefg七肽重复单元的示意图；
[0086]
图2是示出了在卷曲螺旋的α
‑
螺旋桶中的五个或更多个α螺旋的abcdefg七肽重复单元的示意图；
[0087]
图3是示出了六螺旋桶的abcdefg七肽重复单元的示意图；
[0088]
图4示出了卷曲螺旋折叠的x射线晶体结构的俯视图和侧视图，所述卷曲螺旋折叠包含3、4、5、6和7个α螺旋，分别对应于pdp id 4dzm、4dzl、3r4a、4pn8、4pn9和4pna；
[0089]
图5a示出了包含cc
‑
hex2的α
‑
螺旋桶的x射线晶体结构的局部剖视图，cc
‑
hex2具有在α
‑
螺旋桶腔中结合的法尼醇；
[0090]
图5b示出了图5a的x射线晶体结构的俯视图；
[0091]
图6示出了不同α
‑
螺旋桶的传感器阵列；
[0092]
图7是示出了传感器阵列如何运行的示意图，其中蛋白质桶添加至阵列，dph报道染料结合，并且不同的分析物产生不同的置换模式或指纹；
[0093]
图8示出了针对图6中描述的α
‑
螺旋桶阵列的七种不同分析物的置换模式；
[0094]
图9示出了胆固醇的复制置换模式；
[0095]
图10示出了使用计算方法来分析置换模式的过程；
[0096]
图11是示出了用训练如何改善计算模式识别的图；
[0097]
图12示出了通过选定的茶样品产生的dph置换指纹，表明可成功地分析复杂的混合物；
[0098]
图13在顶部示出了葡萄糖、半乳糖和甘露糖的dph置换指纹，并且在底部示出了差向异构体的结构，并且证明了本发明可用于区分差向异构体；
[0099]
图14是使用蛋白原性(左)和非蛋白原性(中间)肽阵列在1μm的最终浓度下对于胆固醇(右)的dph置换指纹的比较；
[0100]
图15示出了使用包含一个全d
‑
氨基酸肽(d
‑
(avkeva))的肽桶阵列的n
‑
乙酰基
‑
l
‑
天冬氨酸(图a)和ng，ng
‑
二甲基精氨酸(图b)的dph置换指纹，其在每个指纹中由在左侧从底部开始的第2个方框表示。
[0101]
图16示出了针对所有10个条件培养基样品生成的指纹。这包括从如所示的“非癌性”、“原发性肿瘤”和“转移性肿瘤”来源的细胞收集的培养基。每种指纹条件培养基如下标记。a：nmumg；b：hc11；c：eph4；d：yej；e：113；f：724；g：yej
‑
m1；h：yej
‑
m2；i：113
‑
m1；j：113
‑
m2。
[0102]
图17示出了针对组合的“非癌性”(图a)、“原发性肿瘤”(b)和转移性肿瘤(c)来源的条件培养基生成的指纹；
[0103]
图18是健康、非癌细胞和肿瘤来源细胞的2向(2
‑
way)预测的混淆矩阵；
[0104]
图19是健康、非癌细胞以及来源于原发性肿瘤和转移性肿瘤的细胞的3向(3
‑
way)预测的混淆矩阵；以及
[0105]
图20是来源于原发性肿瘤和转移性肿瘤的细胞的2向预测的混淆矩阵。
[0106]
发明详述
[0107]
本发明的第一方面涉及提供传感器阵列，其包含至少两个传感器。传感器阵列可
提供在例如多孔板中。在这种情况下，不同的传感器将位于不同的孔中。
[0108]
传感器阵列包含至少两个传感器。两个传感器是限定阵列所需的最小传感器数目。阵列中可包含更大数目的传感器。例如，阵列可包含至少10个传感器，优选至少50个传感器，更优选至少100个传感器，再更优选至少300个传感器。蛋白质桶在所述至少2、10、50、100或300个传感器的每一个中分别是不同的。
[0109]
要求保护的传感器中的蛋白质桶结构不同的要求不排除传感器阵列可包含另外的传感器，所述另外的传感器仅仅是复制传感器、对照或使用相同蛋白质桶但具有不同报道染料的传感器。的确，使用复制传感器是提高数据质量的常用策略。换句话说，传感器阵列包含具有不同蛋白质桶的许多不同传感器，但是在传感器阵列中通常存在具有相同蛋白质桶的另外的传感器。这些另外的传感器通常是数据质量的复制、对照或使用不同报道染料的传感器。但是，在传感器阵列内，至少必须存在要求保护的数目的传感器，在所述传感器中蛋白质桶的结构不同。
[0110]
每个传感器均包含蛋白质桶。蛋白质桶是限定腔的蛋白质。因此，蛋白质桶具有腔表面和外表面。腔是蛋白质内的管状腔。管状腔通常是细长的，即长而窄的。通常，腔在两端均是开放的，以允许腔内的分子置换。然而，在某些实施方案中，腔可在一端或两端被封闭以将特定分子捕获在腔内。
[0111]
在不同传感器中的蛋白质桶的结构不同。由此，我们意指存在可区分蛋白质桶的至少一个差异。该差异可包括氨基酸中或者已衍生化或官能化的氨基酸中的点突变。该差异还可包括蛋白质桶长度或宽度的变化。该差异还可包括蛋白质桶类型的变化。
[0112]
由于通过使用蛋白质骨架中有限数目的差异产生非常不同的化学环境的可能性，在本发明的某些实施方案中，不同的蛋白质桶可具有相似的蛋白质骨架。例如，不同的蛋白质桶可以全部是相同的类型。在一个实施方案中，不同的蛋白质桶可以全部是α
‑
螺旋桶。在另一个实施方案中，不同的蛋白质桶可以在50％序列同一性，70％序列同一性或90％序列同一性以内。
[0113]
α
‑
螺旋桶是包含五个或更多个α螺旋的蛋白质桶。α螺旋以其中其彼此基本上对齐并列的模式布置，以形成管样形状。这被称为卷曲螺旋折叠(也称为卷曲螺旋结构或组件)，并且先前已经被很好地表征。一些代表性的实例包括malashkevich等，1996；koronakis等，2000；zaccai等，2011；fletcher等，2012；meusch等，2014；sun等，2014；thomson等，2014；collie等，2015；和lombardo等，2016。包含不同α螺旋数目的卷曲螺旋折叠的一些实例可见于图1至4。
[0114]
如可见于图4，卷曲螺旋折叠可出现3至4个α螺旋。然而，直至α螺旋的数目达到5时形成腔。具有5个或更多个α螺旋的卷曲螺旋会形成腔，并且因此构成α
‑
螺旋桶。
[0115]
thomson 2014年报道，五个α
‑
螺旋桶的腔直径为约六个α
‑
螺旋桶的腔直径为约或约以及七个α
‑
螺旋桶的腔直径为约如通过x射线晶体学测量的。在某些实施方案中，蛋白质桶的腔直径大于约更优选大于约在某些实施方案中，蛋白质桶的腔直径小于约更优选小于约
[0116]
卷曲螺旋折叠(例如在α
‑
螺旋桶中)的一个常见结构特征是每个α螺旋可独立地包含具有带有序列abcdefg的重复单元的序列，其中a和d位置的50％或更多是疏水性氨基酸，
并且其中b、c、e、f和g位置的50％或更多是极性氨基酸。特别地，在e和g位置处具有疏水性氨基酸可促进α螺旋桶形成，如可见于图2和3。在一个实例中，所有b、c和f位置均可以是极性氨基酸，而所有e和/或所有g位置均是疏水性氨基酸。
[0117]
在另一些实施方案中，a和d位置的60％或更多，75％或更多，或者90％或更多是疏水性氨基酸。在另一些实施方案中，b、c、e、f和g位置的60％或更多，75％或更多，或者80％或更多是极性氨基酸。
[0118]
在一些具体的实例中，具有序列abcdefg的重复单元可选自由以下组成的列表：
[0119]
lqkiefi，lkaiafe，lkeiafs，ikeiafs，lkeiafa，fkeiafa，ikeiafa，ikevafa，vkevafa，vkeiafa，mkeiafa，lkqiefi，lkevafa，vkelafa，ikelsfa，ikelafs，lkelafs，fkeiafa，lkqiefi和lkelafa；
[0120]
其中f在重复单元之间可以不同。尽管这些重复单元代表α螺旋的基本构建单元，但是当然可存在点突变，以使得并非每个单元都是相同的重复。在任何给定的α螺旋中或在α
‑
螺旋桶中，多至40％，优选25％，更优选10％的氨基酸残基可不同于重复单元。从图2和图3可以看出，位置f指向本体溶剂，并且在α螺旋彼此的组装中发挥很小的作用。因此，在位置f的氨基酸残基较不重要，并且在重复单元之间可以不同。因此，位置f通常是极性氨基酸，以帮助α
‑
螺旋桶的水溶性。然而，位置f也是用于进一步官能化的良好候选物。
[0121]
每个α螺旋可包含至少三个重复单元。基于上述重复单元的全长序列的一些实例包括以下。
[0122]
[0123][0124]
[0125]
cc
‑
pent、cc
‑
hex2、cc
‑
hept和aikeia点突变体，其中b(或cc
‑
pent中的c)位置是k或r，并且f位置是qkwq或kkwk，并且突变在第3、7、10、14、17、21、24、28位置处：
[0126]
cc
‑
pent
‑
突变体：ac
‑
gciefilqciefilqciefilqciefilqg
‑
nh2[0127]
cc
‑
hex2
‑
突变体：ac
‑
geiafslbeiafslbeiafslbeiafslbg
‑
nh2[0128]
cchept
‑
突变体：ac
‑
geiafalbeiafalbeiafalbeiafalbg
‑
nh2[0129]
aikeia
‑
突变体：ac
‑
geiafaibeiafaibeiafaibeiafaibg
‑
nh2。
[0130]
上文列出的每个α螺旋未与完全形成的α
‑
螺旋桶内的任何其他α螺旋共价连接。相反，α螺旋自组装。由上文列出的肽形成的α
‑
螺旋桶包含相同的α螺旋。然而，在不同的实施方案中，在α
‑
螺旋桶内的α螺旋可以是不相同的。对于未共价链接的不相同的α螺旋，应注意可自组装的α
‑
螺旋桶的不同排列。或者，α
‑
螺旋桶可包含单个并且连续的氨基酸骨架。这提供了对组装形成α
‑
螺旋桶的α螺旋的高得多水平的控制。
[0131]
蛋白质桶可包含非天然氨基酸。其可以是天然氨基酸、已被进一步官能化的天然氨基酸或者任何其他氨基酸的对映体。蛋白质桶的刚性结构通常允许在不损害蛋白质桶的折叠的情况下的许多氨基酸的替换。
[0132]
例如，下表示出了如何通过替换3种蛋白原性肽将3种非蛋白原性肽并入至15种桶和dph对照的阵列中。
[0133][0134]
可以看出，在标准蛋白原性阵列中的肽在左侧示出，而在右侧的非蛋白原性阵列则并入具有非天然氨基酸的3种肽序列。nle＝正亮氨酸，dl＝脱氢亮氨酸。
[0135]
cchept
‑
l28nle：ac
‑
geiaqalkeiakalkeiawalkeiaqanlekg
‑
nh2
[0136]
cchept
‑
dl；ac
‑
geiaqadlkeiakadlkeiawadlkeiaqadlkg
‑
nh2
[0137]
cchex
‑
l24nle：ac
‑
gelkaiaqelkaiakelkaiawenlekaiaqg
‑
nh2
[0138]
在一个实施方案中，非天然氨基酸是已经通过化学连接蛋白质底物而被修饰的氨基酸。这样的化学连接方法是公知的。蛋白质底物通常将与蛋白质桶外表面上的残基连接。在使用α
‑
螺旋桶的情况下，在α螺旋上的七肽重复的位置f将是接头的锚的合适候选物。蛋白质底物可包含酶底物、受体底物和/或抗体底物。通过提供蛋白质底物，靶蛋白可与蛋白质桶结合和/或化学修饰蛋白质底物。蛋白质的结合或蛋白质底物的化学修饰均可改变蛋白质桶腔的构型，并且继而破坏报道染料的结合。
[0139]
传感器阵列的每个传感器包含报道染料。染料是可提供光信号的分子。光信号通常在紫外线和/或可见光谱中。由此，我们意指可在电磁光谱的紫外线
‑
可见区提供信号的分子。光信号可以是吸收或发光信号。优选地，光信号是荧光。
[0140]
在传感器阵列中，报道染料可逆地与腔结合。由此，我们意指报道染料完全地或基
本上结合在蛋白质桶腔内。所述结合是可逆的，意指报道染料可从腔自由解开(unbind)，或在腔内自由发生结合变化。该可逆结合通常由非共价相互作用介导。可逆结合的一个特别优选形式是由疏水性腔内的疏水性报道染料结合所介导的。还可使用不稳定共价结合，例如，通过可易于被亲核替换切割的亚胺。
[0141]
为了使有资格作为报道染料，分子在与腔结合与在该结合被破坏时之间应提供不同的信号。破坏包括报道染料从腔中逐出或报道染料在腔内的构型变化。当分析物进入腔并置换报道染料时，换言之，通过竞争性结合，可发生逐出。当分析物与蛋白质桶的外部结合以使得腔的构型改变至报道染料可不再与腔结合的程度时也可发生逐出。或者，在该情况下，腔的构型改变导致报道染料的构型改变。
[0142]
例如，当腔两端开放时，报道染料可从腔自由离开。在一个替代实施方案中，报道染料被封装在腔内。在该实施方案中，传感器依赖于改变腔构型的分析物，以使得报道分子构型改变并表现出不同的信号。
[0143]
在一个优选实施方案中，报道染料当与腔结合时提供光信号。对于可取决于环境(例如，可在一种环境中发荧光但不能在不同环境中发荧光的报道染料)提供构成正信号或无信号之信号的报道染料，当该报道染料与腔结合时存在正信号。这与其中光信号存在于游离溶液，但在与蛋白质腔结合时不存在的报道染料相反。
[0144]
报道染料可以是根据式i的化合物
[0145][0146]
其中，n为3或更大，优选地n为3、4或5，更优选地n为3；并且r1和r2独立地选自芳基或杂芳基，优选芳基，更优选苯基。因此，根据式i的报道染料通常是疏水性的并且能够采用细长构型。在一个优选实施方案中，染料是1，6
‑
二苯基
‑
1，3，5
‑
己三烯。
[0147]
可使用替代染料，包括任何萘，例如6
‑
丙酰基
‑2‑
二甲基氨基萘(prodan)。
[0148]
传感器阵列可包含至少一个另外的传感器，其中报道染料在所述至少一个另外的传感器中是不同的。这允许使用其中染料具有非常不同特性的传感器或传感器的系列。这可允许将更多多样性带至传感器阵列。
[0149]
蛋白质桶可被固定在基底上。基底可以是例如表面，其包括玻璃或塑料材料。任何给定传感器的蛋白质桶均可被固定在多孔板的孔内。这将允许洗涤和重复使用蛋白质桶。任何给定传感器的蛋白质桶均可被固定在平面上，临近来自传感器阵列中不同传感器的邻近经固定蛋白质桶。这将允许单一分析物容易地应用于不同的传感器，而蛋白质桶不会扩散和彼此干扰。这也将允许传感器阵列的微型化，从而允许在小表面积(即，大概小于5或甚至小于2平方厘米)的表面积中存在相当数目的传感器(即，大概至少500个或至少1000个传感器)。这样的阵列将提供在便利且低成本的阵列中区分不同分析物的显著能力。这样的阵列有时被称为微芯片阵列。
[0150]
用于将蛋白质桶固定在基底上的技术是公知的(一个实例(pai等，2012)，公开了
将肽固定在微阵列中)。在蛋白质桶包含许多自组装亚基的情况下，可单独地固定仅一个、多个或所有亚基。通常来说，将n端或c端残基用于固定，因为这可减少破坏蛋白质折叠/3d结构的机会。然而，非末端残基可代替地用于将蛋白质桶与基底连接。例如，在使用α蛋白质桶的情况下，f位置氨基酸残基可提供用于固定的合适锚点。通常，可在蛋白质桶与基底之间使用柔性接头，以允许经固定蛋白质桶一定程度的移动。
[0151]
报道染料也可被固定。可通过允许报道染料足以自由移动以进入和离开蛋白质桶腔的接头，将报道染料固定至基底。或者，报道染料可通过与蛋白质桶连接来固定。此外，应使用允许报道染料足以自由移动以进入和离开蛋白质桶的接头。不同的可能性是报道染料被封装在腔内。在该可能性下，在报道染料与腔结合之后，腔的末端(end)将被封闭。染料与桶的固定还允许可重复使用或可在线使用，而无需考虑蛋白质桶或染料可能被洗掉的传感器阵列。
[0152]
蛋白质桶和报道染料可处于干燥状态。由此，我们意指蛋白质桶与报道染料的复合体已被干燥。干燥可通过包括风干和冻干的技术来进行。在干燥状态下，传感器阵列可容易地储存和运输。在使用之前，应将传感器阵列再水化。再水化可通过在施加受试样品之前添加水溶液或通过添加水性受试样品来实现。
[0153]
这些重复序列反映了形成五元、六元、七元和八元α
‑
螺旋桶的从头α
‑
螺旋桶的重复单元。
[0154]
虽然这些重复单元代表了α螺旋的基本构建单元，但是当然可能存在点突变，以使得并非每个单元都是相同的重复。
[0155]
待检测的分析物或分析物的复杂混合物在从患者(例如人或动物)获得的样品中，并且通常是液体或在溶液中。能够分析气态分析物(例如呼吸物(breath))也是有利的。作为固定在固体基底上的替代方法，可将蛋白质桶固定在水凝胶或3维多孔支架基底中或之上。其具有的优点是，传感器阵列可用于检测气态分析物，因为这些气态分析物可在水凝胶中溶解，并且因此可进入桶。特别地，可将桶共价或非共价地装载到水凝胶或3维多孔支架中。聚合物(例如聚(乙二醇)、聚二甲基硅氧烷和聚丙烯酰胺)，多糖(例如壳聚糖、藻酸盐(alginate)和琼脂糖)以及肽水凝胶是可用于形成水凝胶的材料的一些实例。
[0156]
本发明还提供了微阵列芯片，其包含根据本发明第一方面的传感器阵列。微阵列芯片技术是公知的。微阵列芯片可以是3d打印的。微阵列芯片可包含处于干燥状态的传感器阵列，其中将水性受试样品浸泡在该芯片上。微阵列芯片可由智能手机分析。
[0157]
本发明的传感器阵列提供了显著量的数据。对于人眼而言，检测区分分析物或者可能存在于样品中的分析物的复杂混合物的差异可非常困难或者甚至不可能。然而，这些差异更加适合于计算方法。因此，步骤(d)可包括使用计算模式识别。本领域中使用的计算模式识别的一些实例包括主成分分析(principal component analysis，pca)、线性判别分析(linear discriminant analysis，lda)、层次聚类分析(hierarchical cluster analysis，hca)和人工神经网络(artificial neural network，ann)。
[0158]
实验
[0159]
蛋白质桶的合成
[0160]
合成具有以下序列的基于α螺旋的α
‑
螺旋桶(对应于图6中所指的α
‑
螺旋桶)。
[0161][0162]
肽序列使用先前描述的技术(thomson等，2014)来合成和表征。
[0163]
fmoc氨基酸、dmf和cl
‑
hobt购自agtc bioproducts(hessle，uk)。rink amide chemmatrix固体支持物购自pcas biomatris inc(saint
‑
jean
‑
sur
‑
richelieu，canada)。tma
‑
dph和法尼基焦磷酸酯(farnesyl pyrophosphate，fpp)购自sigma
‑
aldrich(gillingham，uk)。法尼醇购自alfa aesar(heysham，uk)。所有其他化学品均购自fisher
‑
scientific(loughborough，uk)。除非另有说明，否则在hepes缓冲盐水(hbs；25mm hepes，100mm nacl，ph 7.0)中进行生物物理测量。在thermoscientific(hemel hemstead，uk)nanodrop 2000光谱仪(ε
280
＝5690cm
‑1)上通过uv
‑
vis确定肽浓度。
[0164]
标准fmoc固相肽合成在具有在线uv监测的cem(buckingham，uk)liberty blue自动化肽合成装置上进行。用dic/cl
‑
hobt实现激活。用20％v/v吗啉/dmf进行fmoc去保护。所有肽均在rink amidechemmatrix固体支持物上作为c端酰胺产生，并在室温(rt)下添加dmf(5ml)中的乙酸酐(0.25ml)和吡啶(0.3ml)持续30分钟之后使n端乙酰化。通过在rt下摇动的情况下添加三氟乙酸(9.5ml)、三异丙基硅烷(0.25ml)和水(0.25ml)持续3小时，将肽从固体支持物中切割。将切割溶液在氮流下减少至约5ml。在添加乙醚(40ml)之后使粗制肽沉淀，并通过离心回收。将所得沉淀物在1∶1乙腈和水(≈15ml)中溶解并且冻干，以得到作为白色固体的粗制肽。
[0165]
将肽通过反相hplc在phenomenex(macclesfield，uk)luna c18固定相柱(150
×
10mm，5μm粒径，孔径)上进行纯化。在30分钟内施加20％至80％梯度的乙腈和水(具有0.1％tfa)。通过分析型hplc和maldi
‑
tof ms鉴定包含纯肽的级分，并将其合并且冻干。
[0166]
染料与腔的结合
[0167]
初步实验试图证明报道染料会结合在α
‑
螺旋桶的腔内。针对多种α
‑
螺旋桶测定染
料1，6
‑
二苯基
‑
1，3，5
‑
己三烯(dph)和6
‑
丙酰基
‑2‑
二甲基氨基萘(prodan)，以确定其解离常数k
d
。将dph或prodan(1μm)与不同浓度的α
‑
螺旋桶(0.5至500μm)一起孵育多至2小时，并在相应的发射波长下测量荧光信号。
[0168][0169]
从上表可以看出，dph与所有四种α
‑
螺旋桶结合，而prodan未与包含cc
‑
pent或cc
‑
hex的α
‑
螺旋桶结合。prodan未像dph一样紧密地与这些α
‑
螺旋桶结合。
[0170]
某些分析物的染料置换
[0171]
在提供了报道染料可结合在α
‑
螺旋桶腔内的概念的证明之后，下一步是证明结合的报道染料可被分析物置换。基于具有疏水性特性并能够采用细长构型来选择以下四种分析物，因为这些被假定具有置换报道染料的最佳机会。
[0172][0173]
将dph用作报道染料，并使用标准竞争性抑制测定记录dph的置换。换句话说，分析物抑制dph结合的能力由抑制常数k
i
记录。将α
‑
螺旋桶与dph或其阳离子型变体1
‑
(4
‑
三甲基铵苯基)
‑6‑
苯基
‑
1，3，5
‑
己三烯对甲苯磺酸盐(tma
‑
dph)一起孵育。添加分析物(0.05至300μm)并测量荧光信号。
[0174][0175]
在其中观察到竞争性结合的所有情况下，抑制常数均在低微摩尔范围中，类似于dph的解离常数，表明类似的结合强度，并且表明报道染料可被分析物置换。
[0176]
分析物结合的另外的证据由结合在cc
‑
hex2α
‑
螺旋桶腔内的法尼醇的x射线晶体结构提供。这示于图5a和5b。为了获得该晶体结构，将cc
‑
hex2的冻干样品重悬在去离子水中至浓度为5mg ml
‑1。通过将1μl的cc
‑
hex2与1μl的储液(reservoir solution)混合，在19℃下使用先前优化的条件1(0.1m na hepes，4.3m氯化钠，在ph 7.5时)建立蒸气扩散结晶试验。在4天内获得衍射质量的晶体。在40％v/v dmso：h2o中制备法尼醇溶液(2mm)，并将晶体浸泡1、5、20、60和120分钟。在每个时间点，将晶体在冷冻之前浸泡在包含20％甘油的储液中。
[0177]
在diamond light source(didcot，uk)的光束线io4
‑
1上，以的波长收集x射线衍射数据。根据ccp4套件中的实施(winn等，2011)，使用mosflm(battye等，2011)和aimless(evans和murshudov，2013)处理数据。由于衍射数据中的高各向异性，因此使用衍射各向异性服务器(strong等，2006)将所得mtz文件在b轴中截取至
[0178]
使用cc
‑
hex2的聚丙氨酸模型(pdb 4pn8)通过分子置换解出晶体结构。在使用coot(emsley和cowtan，2004)进行迭代轮的模型建立并使用phenix精制(afonine等，2012)进行精制之后，获得结构。所述精制使用扭力
‑
振动
‑
螺旋(torsion
‑
libration
‑
screw，tls)(zucker，champ和merritt，2010)和非晶体学对称性(non
‑
crystallographic symmetry，ncs)参数进行。在去除配体并在phenix中进行精制之后，根据最终模型计算omit图。使用phenix elbow(moriarty，grosse
‑
kunstleve和adams，2009)计算配体结构和几何约束。
[0179]
如通过molprobity(chen等，2010)分析，最终精制结构显示出良好的立体化学和拉氏图(ramachandran plot)，表明无残基落在骨架构象空间的优选区域之外。
[0180]
差分阵列
[0181]
在原理性实验的证明中，将15种不同的α
‑
螺旋桶设计为(如图6中所示)布置在96孔板中。不同的α
‑
螺旋桶具有多种尺寸，具有5至7个α螺旋。不同的α
‑
螺旋桶具有不同的电荷，其中一些在腔中是中性的，一些具有带负电荷的羧酸根基团，以及一些在腔中具有带正电荷的铵基。
[0182]
向每个孔添加报道染料dph，并允许其结合在每个α
‑
螺旋桶的腔内。然后对七种不同的小分子和大分子进行传感器测定。每个传感器测定中每个传感器的分子和光信号示于
图7。该图示出了每种分子的独特结合特征。
[0183]
重要的是意识到所筛选分子的重要性。胆固醇和神经酸主要是可预期容易地结合在α
‑
螺旋桶的腔内的疏水性分子。此外，二者均可用作生物标志物，胆固醇用于心血管疾病以及神经酸用于精神病。
[0184]
二甲基精氨酸和n
‑
乙酰基
‑
l
‑
天冬氨酸是带有多个电荷的高度极性氨基酸。可预期这些分子对具有不带电荷且为疏水性的腔的α
‑
螺旋桶几乎没有作用，然而，即使在这样的α
‑
螺旋桶上也可看到置换模式。
[0185]
六甲基四胺是炸药前体，并且再次产生明显的置换模式。三异丙基磷酸酯是空间体积大的神经药剂类似物。
[0186]
显著的结果是由胰岛素产生的传感器阵列模式。胰岛素是应不能够适合测定中所使用的α
‑
螺旋桶的腔内的肽。然而，仍然产生独特的报道染料置换模式。这提供了以下证据：即使当分析物与α
‑
螺旋桶的外表面相互作用时，也可发生报道染料置换。
[0187]
在重复测定中观察到高再现性，如可见于图9中所呈现的重复数据。
[0188]
图10示出了将计算模式识别应用于传感器阵列结果的工作流程。在寻找独特识别分析物的模式之前，对原始数据进行归一化。通过将机器学习应用于每种分子的传感器阵列模式，预测能力显示出高于95％的正确预测。
[0189]
图11示出了对来自原初(未示出)数据中分析物的预测如何随来自已知训练集中的数据比例的提高而提高。在该情况下，通过使用针对每种已知化合物所记录的阵列特征的150个数据集的仅≈30％的随机选择物，来自非训练集数据的＞90％的预测都是正确的。
[0190]
分析复杂混合物
[0191]
对茶的选择物进行分析作为分析复杂混合物的测试基础。其中从当地超级市场购买总共9种不同盒的茶袋。其包括3种红茶(pg tips、约克郡茶(yorkshire tea)和pukka英式早茶(pukka english breakfast))；3种格雷伯爵茶(earl grey tea)(川宁格雷伯爵茶(twinings the earl grey)、pukka华丽格雷伯爵茶(pukka gorgeous earl grey)和克利伯有机格雷伯爵茶(clipper organic earl grey))；以及三种绿茶(克利伯有机绿茶(clipper organic green tea)、川宁纯绿茶(twinings pure green tea)和泰特利纯绿茶(tetley pure green tea))。
[0192]
将茶在实验室中按照以下冲泡：首先，在适用的情况下，从茶袋中取出细绳和标签。接下来，将去离子水在新购买的无水垢的壶中煮沸。将单个茶袋置于带有50mm搅拌棒的500ml schott瓶中，然后添加250ml的去离子水，并允许在搅拌(100rpm)的同时将茶冲泡5分钟。在此之后，移出1ml的茶溶液，并用去离子水1∶10稀释，并将溶液在液氮中速冻，并随后在
‑
80℃下储存。使用相同的方案为每个实验重复准备新鲜的茶样品。
[0193]
使用由15种形成桶的肽加上不含肽的对照组成的套件，通过观察产生如图12中所示指纹的dph置换对茶进行分析。图12示出了由如下所选择的茶样品产生的dph置换指纹：图a pgtips；图b pukka英式早茶；图c约克郡茶；图d克利伯有机格雷伯爵茶；图e pukka华丽格雷伯爵茶；图f川宁格雷伯爵茶；图g克利伯有机绿茶；图h泰特利纯绿茶；和图i川宁纯绿茶。
[0194]
实施机器学习技术，可按等级(即红茶、格雷伯爵茶或绿茶)对茶进行成功地分类，其中准确度为82.3％，并且按特定类型具有90.0％的准确度。
[0195]
分析差向异构体
[0196]
在15种肽和dph对照的阵列中分析葡萄糖、半乳糖和甘露糖。这三种糖是差向异构体，因为它们的构型和单一立体中心不同。以10mm浓度在离子水中制备所述三种糖中的每一种的溶液，然后在其中测量dph置换的桶阵列中以1mm的终浓度进行分析。在独立的两天中，在两个384孔板中的每个板中，使用每种桶的24个重复检查每种糖(即每种糖4个板)。肽阵列能够区分这3种非常相似的分子，如图13所示，其描绘了在顶部的葡萄糖、半乳糖和甘露糖的dph置换指纹，以及在底部的每种差向异构体的结构。
[0197]
非天然氨基酸
[0198]
为了证明非天然氨基酸的用途，通过替换3种蛋白原性肽将3种非蛋白原性肽并入至15种桶和dph对照的阵列中。
[0199][0200]
可以看出，在标准蛋白原性阵列中的肽在左侧示出，而在右侧的非蛋白原性阵列则并入具有非天然氨基酸的3种肽序列。nle＝正亮氨酸，dl＝脱氢亮氨酸。
[0201]
cchept
‑
l28nle：ac
‑
geiaqalkeiakalkeiawalkeiaqanlekg
‑
nh2
[0202]
cchept
‑
dl：ac
‑
ge1aqadlkelakadlkeiawadlkeiaqadlkg
‑
nh2
[0203]
cchex
‑
l24nle：ac
‑
gelkaiaqelkaiakelkaiawenlekaiaqg
‑
nh2
[0204]
将胆固醇以1μm进行分析，并分析dph置换指纹。
[0205]
如可从图14中看出，当比较蛋白原性指纹(在左侧)与非蛋白原性指纹(在右侧)时，观察到明显的差异。
[0206]
d氨基酸肽
[0207]
为了证明d氨基酸在桶阵列中的用途，制备完全包含d氨基酸的肽alkeva的类似物(即下方的肽d
‑
(avkeva))
[0208]
d
‑
(avkeva)：ac
‑
gevaqavkevakavkevawavkevaqakvg
‑
nh2[0209]
这种肽在每个手性中心具有与肽alkeva相反的手性，将这种肽替换成15肽桶阵列(如实施例1中所列)，以代替肽avkeia。使用该经修饰的阵列，对以下两种小分子的dph置换进行分析：n
‑
乙酰基
‑
l
‑
天冬氨酸和ng，ng
‑
二甲基精氨酸。每种分子的溶液均以10μm在水中制备，然后以1μm浓度进行检查，其中在三个384孔板中的每个板中具有24个重复。图15示出了这两种分子中每一种分子的dph置换特征。特别地，图15示出了使用包含一个全d
‑
氨基酸肽(d
‑
(avkeva))的肽桶阵列的n
‑
乙酰基
‑
l
‑
天冬氨酸(图a)和ngng
‑
二甲基精氨酸(图b)的dph置换指纹，其在每个指纹中由在左侧从底部开始的第2个方框表示。根据这些数据，实施机器学习技术，并且以95.5％的准确度区分所述两种分子。
实施例
[0210]
该实施例表明传感器阵列技术可区分由非癌细胞、来源于原发性肿瘤的细胞和来源于继发性肿瘤的细胞产生的不同分泌组。
[0211]
总共使用了10种细胞系，所有的均是小鼠来源的：3种非癌性的(nmumg、hc11和eph4)、3种原发性乳腺肿瘤来源(yei、113和734)和4种转移性乳腺肿瘤来源(yej
‑
m1、yej
‑
m2、113
‑
m1和113
‑
m2)。表1总结了当前研究中使用的细胞系。还应注意的是，细胞系yej、yej
‑
m1和yej
‑
m2是同源的
‑
也就是说，yej
‑
m1和yej
‑
m2系各自来源于在接受者小鼠中由脂肪垫移植和yej源性肿瘤的生长产生的继发性肿瘤。以相似的方式，113、113
‑
m1和113
‑
m2系也是同源的，但是在这种情况下，113
‑
m1和113
‑
m2来源于尾静脉注射113原代细胞系之后的肺转移。
[0212]
表1：本研究中使用的细胞系
[0213]
非癌性的原发性肿瘤转移性肿瘤nmumgyejyej
‑
m1hc11113yej
‑
m2eph4724113
‑
m1
ꢀꢀ
113
‑
m2
[0214]
制备样品
‑
细胞系和条件培养基
[0215]
nmumg、eph4和hc11细胞是来源于正常腺性小鼠组织(市售)的上皮细胞。乳腺肿瘤细胞系是在格拉斯哥cruk beatson研究所(cruk beatson institute，glasgow)从mmtv
‑
pymt小鼠乳腺癌模型中产生的自发性肿瘤制备的。在该模型中，pymt癌基因在乳腺特异性mmtv
‑
ltr启动子的控制下表达，导致充分表征了概括了在人转移性乳腺癌中发生的关键事件的疾病进展。从小鼠切下测量最大尺寸为9mm
×
9mm的肿瘤，使用组织切碎机将其处理成酱质地(pate texture)，并随后在轻轻摇晃的情况下在37℃下在胶原酶/透明质酸酶(15000u胶原酶/5000u透明质酸酶)中消化1至2小时。然后将样品以15g离心1分钟，并收集上清液。然后将上清液以100g离心3分钟，并随后将所得上清液以400g离心10分钟。然后弃去上清液，将细胞沉淀物重悬在完全生长培养基中，并随后以800r.p.m离心3分钟以洗涤细胞。将该洗涤步骤重复另外的两次，并随后将细胞重悬在完全生长培养基中，并在37℃/5％co2下孵育并维持以进行传代。
[0216]
使用脂肪垫移植模型制备乳腺肿瘤细胞系的转移性变体。简言之，将50万个肿瘤细胞注射到接受者小鼠的第四乳腺脂肪垫中，并使肿瘤生长直至9mm
×
9mm的可测量尺寸。然后手术去除肿瘤并使接受者恢复，随时间监测体重和一般健康状况。一旦有转移性疾病的迹象，包括恶病质、体重减轻和呼吸困难，则宰杀接受者。收获肺并如上所述进行处理，并因此从已经死于肺转移的接受者的肺分离转移性肿瘤细胞系。
[0217]
在37℃/5％co2下，将正常小鼠乳腺上皮细胞、原发性乳腺肿瘤细胞系和原发性肿瘤细胞系的转移性变体维持在补充有10％fbs、2mm l
‑
谷氨酰胺、10ug/ml胰岛素、20ng/ml egf和100u/l青霉素
‑
链霉素的dmem中。将细胞以10ml的总体积、2
×
106个细胞/10cm皿的密度平板接种，并在37℃/5％co2下孵育24小时。然后收集条件培养基并进行以下差速离心方案：300g 10分钟、2000g 10分钟和10000g 30分钟，其中所有离心步骤均在4℃下进行。然后在用于传感器阵列之前将所得细胞培养物上清液快速冷冻并储存在
‑
80℃下。还在条件培
养基收集的点时进行细胞计数，以使得能够对最终细胞数目进行归一化。对于每种细胞系，在三个单独日收集条件培养基，以使n＝3。因此，在使用10种不同的细胞系(3种非癌症的、3种原发性的和4种转移性的)并且收集3次条件培养基的条件下，我们检查了30种不同的培养基批次。
[0218]
与传感器阵列接触
[0219]
在于传感器阵列中进行分析之前，将冷冻的条件培养基样品解冻并相对于收集培养基时测量的细胞计数进行稀释。这些细胞计数为1.67
×
105个细胞/ml至6.84
×
105个细胞/ml。样品中培养基的最终浓度为2.0％(对于细胞计数最低的条件培养基)至0.49％(对于细胞计数最高的培养基)。
[0220]
使用在上文实验部分的开头所述的传感器阵列，如上文所述进行条件培养基样品的分析。简言之，用二苯基己三烯(dph；1μm)将15个桶形成的卷曲螺旋肽(加上单个无肽对照)的组布置(以在hepes缓冲盐水中10μm)在384孔板(即每个肽加上对照以每板24个重复放置)上。接下来，将给定的条件培养基分析物添加至板的第1至5、8至14和17至24列。向第6、7、15&16列添加等体积的水用作对照。在1小时之后，测量dph荧光(350/450nm，激发/发射)，并对含有分析物的每个孔，相对于针对给定桶肽获得的对照孔值进行归一化。将每个条件培养基样品在4个不同日在4个单独的384孔板上进行测定，以使n＝4。
[0221]
结果
‑
指纹的生成。
[0222]
对于条件培养基的每个样品，将来自每个桶形成肽的归一化dph荧光数据在四个板中的每一个上取平均值。如上所述，颜色等级(colour graduation)可用于将来自15个桶(加上
‑
ve对照)中的每一个的这种平均荧光表示为16个细胞指纹。
[0223]
图16示出了针对所有10个条件培养基样品生成的指纹。这包括从如所示的“非癌性”、“原发性肿瘤”和“转移性肿瘤”来源的细胞收集的培养基。每种指纹条件培养基如下标记。a：nmumg；b：hc11；c：eph4；d：yej；e：113；f：724；g：yej
‑
m1；h：yej
‑
m2；i：113
‑
m1；j：113
‑
m2。
[0224]
图17示出了针对组合的“非癌性”(图a)、“原发性肿瘤”(b)和转移性肿瘤(c)来源的条件培养基生成的指纹。
[0225]
结果
‑
机器学习算法
[0226]
使用机器学习技术，我们能够以65.5％的准确度成功地将细胞分类为来自癌性或非癌性来源。对这一分析进行进一步分析，尝试对非癌症与原发性癌症与转移性癌症进行3向分类，准确度恢复为47.5％(基线“猜测(guessing)”将恢复为仅33％)。并且最终，仅集中于原发性和转移性肿瘤来源的样品，准确度恢复为67.1％，能够区分这两者。预计随着更大的数据集以及模式识别和人工智能的进一步使用，准确度将进一步大大提高。针对这些分析中的每一个的混淆矩阵示于图18、19和20中。
[0227]
图18是健康、非癌细胞和肿瘤来源细胞的2向预测的混淆矩阵。
[0228]
图19是健康、非癌细胞以及来源于原发性肿瘤和转移性肿瘤的细胞的3向预测的混淆矩阵。
[0229]
图20是来源于原发性肿瘤和转移性肿瘤的细胞的2向预测的混淆矩阵。
[0230]
体外询问传感器指纹
[0231]
级分方法(fractionation approach)可用于询问原发性肿瘤细胞及其转移性变
体的分泌组，以告知哪些组分负责区分非癌症样品与癌性样品以及原发性样品与转移性样品的指纹。可使用多种方法来了解这些区别特征是样品的外排体的、水溶性室的还是脂溶性室的组分。
[0232]
关于外排体含量，可使用将样品在4℃下以100,000g离心70分钟来从所述细胞系的条件培养基中分离外排体，并随后使用传感器阵列对外排体耗竭的样品进行指纹分析，并使我们能够了解外排体是否是该分析中的一个区别因素。
[0233]
为了同样的目的，我们还可从这样的样品中耗竭分泌的蛋白质，以了解分泌的蛋白质组是否也是一个促成因素。在这种情况下，将条件培养基在4℃下以300g离心10分钟，收集上清液并在4℃下以2000g离心10分钟，并随后收集上清液并在4℃下以10,000g离心30分钟。然后将所得上清液用10％tfa酸化至ph5，并添加10ul strataclean(羟基化二氧化硅)珠/1ml培养基。然后将培养基/珠浆体涡旋1分钟，并在4℃下在转轮上孵育过夜。然后通过短暂离心收集珠，其中分泌的蛋白质随后与珠结合，然后因此留下蛋白质耗竭的条件培养基并且可用于根据本发明的传感器阵列的指纹分析。
[0234]
我们也能够从这样的样品中分离代谢物和脂质，并且因此能够在该分析中实施这些方法。关于代谢组学，在极性溶剂(50％甲醇、30％乙腈、20％水)中提取代谢物并进行离心以沉淀和去除任何存在的蛋白质。然后可将这些提取物应用于传感器阵列以获得非癌症、原发性和转移性样品的指纹，同时，并行地，我们使用hilic液相色谱(liquid chromatography，lc)结合高分辨率orbitrap质谱(thermo scientific)来以非靶向方式分析这些样品中的极性代谢物。关于分泌组的脂质组分，可通过folch方法以两步程序提取脂质。将生物样品用氯仿和甲醇的混合物处理，形成双相层，并且然后将氯仿层随后蒸发并在相容的有机溶剂中重构。我们再次能够在传感器阵列上测试脂质提取物，同时还并行地分析这些样品的内容物以表征样品中的任何差异。简言之，使用c18柱以及流动相改性剂，使用反相(reversed
‑
phase，rp)液相色谱来分离脂质。我们使用两种色谱方法来分离脂质：
[0235]
‑
一般的脂质组学方法使用溶剂梯度分离脂质物质，所述溶剂例如水、乙腈和异丙醇以及作为改性剂的甲酸铵。该方法允许鉴定多于20种脂质类别，包括三酰甘油(triacylglycerol，tg)、磷脂酰乙醇胺(phosphatidyl ethanolamine，pe)、磷脂酰胆碱(phosphatidyl choline，pc)和神经酰胺(ceramide，cer)家族。
[0236]
‑
极性脂质组学方法在色谱梯度中仅使用水和甲醇，并且我们使用氨作为改性剂。当意图是分析在一般方法中检测不到的极性脂质例如溶血磷脂酸(1ysophosphatidic acid，lpa)时，这是有用的。
[0237]
然后，我们可在单独的极性模式和数据依赖性片段化采集(ddms2)中使用高分辨率orbitrap质谱，其中脂质鉴定取决于准确重量和片段化模式二者。这两种方法都将使我们能够提取样品的代谢物和脂质组成、对其进行指纹分析和确定。
[0238]
体内询问传感器指纹
[0239]
上述方法也可应用于来源于我们的癌症小鼠模型的样品。我们可以测试传感器阵列区分来源于不同遗传背景的小鼠血清的能力。我们可将上述原理应用于来自癌症小鼠模型的完全和级分化的血清，以及来自健康志愿者和癌症患者的血清。
[0240]
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