小反刍兽疫抗体检测ELISA试剂盒的制作方法

小反刍兽疫抗体检测elisa试剂盒
技术领域
1.本发明属于生物工程技术领域，具体涉一种小反刍兽疫抗体检测elisa试剂盒。


背景技术：

2.小反刍兽疫是一种对小反刍动物危害严重的急性、热性传染病，其发病率和死亡率均较高。世界卫生组织将小反刍兽疫列为需要通报的动物传染病，我国将其列为一类动物传染病，为国家免疫计划书中强制免疫的疫病之一。近年来，政府围绕动物疫病防控出台了一系列方针政策。这些政策的制定与贯彻执行，展示了我国政府在动物疫病防控方面的决心，而随着现代养殖业的持续发展以及动物疫病防控工作的进一步深化，动物疫病诊断技术亟待创新和突破，相关抗原、抗体的检测试剂用量存在巨大的缺口。近年来，国家建立健全了畜类疫病防治法律法规，加大了疫病监测与防控工程的关注度。


技术实现要素：

3.本发明的目的是为了提供一种小反刍兽疫抗体检测elisa试剂盒。
4.为实现上述目的，本发明提供一种小反刍兽疫抗体检测elisa试剂盒，所述试剂盒包括包被有抗原的酶标板，所述抗原为小反刍n蛋白。
5.所述小反刍n蛋白由以下步骤制备得到：1）重组大肠杆菌工程菌e.colibl21/pet28a
‑
pprv
‑
n的构建将pprv
‑
n蛋白基因序列进行全序列合成，并连接到pet28a质粒上，连接后的质粒转化大肠杆菌bl21，挑取单克隆在含有100ug/ml卡那霉素的lb培养基中培养过夜，提取质粒后测序分析，阳性克隆即为工程菌e.colibl21/pet28a
‑
pprv
‑
n；2）小反刍n蛋白的制备将e.colibl21/pet28a
‑
pprv
‑
n菌种0.5ml，接种至50ml含卡那霉素的lb液体培养基内，37℃、220转/分钟震荡4
‑
5小时，od600至0.6
‑
0.8，加入终浓度为0.5mmol/l的iptg溶液，诱导培养5h，菌液培养完成后离心收集菌体，按每克菌体湿重中加入20ml裂解液的比例重悬菌体，在冰浴中超声破碎20min，破碎液于4℃，10000r/min离心20min后收集上清，过滤后用ni
‑
nta亲和层析柱纯化即得。
6.步骤2）中，所述裂解液由tris缓冲液、nacl、咪唑组成，裂解液ph8.0；裂解液中，缓冲液20mmol/ltris，nacl0.15mol/l，咪唑20mmol/l。
7.酶标板包被抗原的方法为：用ph9.6的碳酸盐缓冲液将小反刍n蛋白进行稀释，包被酶标板，小反刍n蛋白的包被量10ng；封板后于2
‑
8℃包被16
‑
24h，弃去孔中液体，用洗涤液洗涤1次，300ul/孔，在吸水纸上拍干进行封闭处理即得。
8.所述封闭的具体操作为：每孔加入150ul含3%bsa的磷酸盐缓冲液37℃封闭2h，置18
‑
26℃，相对湿度30%以下环境中干燥3
‑
6h。
9.所述试剂盒还包括样品稀释液、洗涤液、显色液、酶标记结合物、终止液。
10.所述样品稀释液的配置为：取氯化钠8g、磷酸氢二钠2.9g、磷酸二氢钾0.24g、氯化
钾0.2g、纯化水600ml、proclin3001ml、新生牛血清200ml混匀，用纯化水定容至1000ml，混匀即可。
11.所述洗涤液的配置为：取氯化钠8g、磷酸氢二钠2.9g、磷酸二氢钾0.24g、氯化钾0.2g、吐温200.5ml、纯化水800ml混匀，补加纯化水定容至1000ml，混匀即可。
12.所述显色液包括显色剂a液和显色剂b液，其中显色剂a液的配置为：显色剂a液；取磷酸氢二钠14.7g、柠檬酸9.3g、过氧化脲0.3g，溶于800ml纯化水混匀，补加纯化水定容至1000ml，混匀得到；显色剂b液：取四甲基联苯二胺（tmb）0.2g，无水乙醇10ml，溶于800ml纯化水混匀，补加纯化水定容至1000ml，混匀得到。
13.所述终止液为2mh2so4。
14.与现有技术相比，本发明具有以下技术效果：本发明所述试剂盒的支持介质上包被有小反刍n蛋白，实现小反刍兽疫抗体的快速检测；本发明试剂盒选取了极低的抗原含量进行包被，不仅检测灵敏度较高，且极大降低了背景值，检测结果更准确。
具体实施方式
15.为进一步说明本发明效果，下面结合具体实施方式对本发明作进一步说明。
16.本发明中，所用的碳酸盐缓冲液的ph值为9.6，其1l体积配方为na2co31.59g、nahco32.93g；所用磷酸盐缓冲液，ph值为7.4，其1l体积配方为：nacl8.0g、kcl0.2g、na2hpo4.12h2o2.9g、kh2po40.24g。所用的化学试剂均为分析纯，购自国药集团。本发明所述的实验方法，若无特殊说明，均为常规方法；所述生物材料，若无特殊说明，均可从商业途径获得。
17.本发明中，所用的小反刍兽疫抗体elisa试剂盒检测方法的判定标准为：s/p值=od样品/od阳性血清均值其中，od表示od450
‑
630，即od450
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od630的值，当od参考阳性血清≥0.3，od阴性血清≤0.1时结果成立；当血清样本的s/p值≥0.5时为阳性，当s/p值＜0.5时为阴性。
18.实施例1小反刍n蛋白的制备1、重组大肠杆菌工程菌e.colibl21/pet28a
‑
pprv
‑
n的构建将pprv
‑
n蛋白基因序列送由华大基因科技有限公司进行全序列合成，并连接到pet28a质粒上。连接后的质粒转化大肠杆菌bl21（de3），挑取单克隆在含有100ug/ml卡那霉素的lb培养基中培养过夜，提取质粒后测序分析，阳性克隆即为工程菌e.colibl21/pet28a
‑
pprv
‑
n。
[0019] 2、pprv
‑
n蛋白的表达将e.colibl21/pet28a
‑
pprv
‑
n菌种0.5ml，接种至50ml含卡那霉素的lb液体培养基内，37℃220转/分钟震荡4
‑
5小时，od600至0.6
‑
0.8，加入终浓度为0.5mmol/l的iptg溶液，诱导培养5h。菌液培养完成后离心收集菌体，按每克菌体湿重中加入20ml裂解液（20mmol/ltris缓冲液，0.15mol/lnacl，20mmol/l咪唑ph8.0）的比例重悬菌体，在冰浴中超声破碎20min，破碎液于4℃，10000r/min离心20min后收集上清，过滤后用ni
‑
nta亲和层析柱纯化。
[0020]
实施例2小反刍兽疫抗体elisa检测试剂盒制备
1、酶标板制备酶标板包被抗原：用ph9.6的碳酸盐缓冲液将小反刍n蛋白进行稀释，包被量10ng包被酶标板，用封板模封板后于2
‑
8℃包被16
‑
24h。弃去孔中液体，用洗涤液洗涤1次，300ul/孔，在吸水纸上拍干。
[0021]
封闭：每孔加入150ul含3%bsa的磷酸盐缓冲液37℃封闭2h，置18
‑
26℃，相对湿度30%以下环境中干燥3
‑
6小时。
[0022]
样品稀释液:取氯化钠8g、磷酸氢二钠2.9g、磷酸二氢钾0.24g、氯化钾0.2g、纯化水600ml、proclin3001ml、新生牛血清200ml混匀，用纯化水定容至1000ml，混匀；洗涤液：取氯化钠8g、磷酸氢二钠2.9g、磷酸二氢钾0.24g、氯化钾0.2g、吐温200.5ml、纯化水800ml混匀，补加纯化水定容至1000ml，混匀；显色剂a液；取磷酸氢二钠14.7g、柠檬酸9.3g、过氧化脲0.3g，溶于800ml纯化水混匀，补加纯化水定容至1000ml，混匀；显色剂b液：取四甲基联苯二胺（tmb）0.2g，无水乙醇10ml，溶于800ml纯化水混匀，补加纯化水定容至1000ml，混匀；终止液：2mh2so4。
[0023]
将上述制备的试剂及材料组装成非洲猪瘟抗体试剂盒，按包被原的不同组装成不同的试剂盒。
[0024]
实施例3小反刍兽疫抗体elisa检测试剂盒的使用方法1、样品稀释：将羊血清或血浆用稀释液100倍（v/v）稀释，用移液器混匀，100ul/孔加样；2、样品孵育：用封板膜封板后，置37℃孵育30min;3、洗板：揭掉封板膜，洗板；机洗：用洗板剂洗涤5遍，最后一次吸水纸上拍干；手洗：弃去反应液，每孔加入洗涤液300ul，浸泡30s，甩弃洗液。如此反复连续洗板5次，最后一次吸水纸上拍干；4、酶标孵育：每孔加入酶标养抗猪二抗100ul，空白对照孔除外。用封板膜封板后，置37℃孵育30min；5、洗板：同3；6、显示：显色剂a液和显色剂b液按体积比1:1混匀，100ul/孔，37℃避光孵育15min；7、每孔加入50ul终止液反应；8、读数：用酶标仪读取od450
‑
630，根据判定标准进行判定。
[0025]
实施例4小反刍兽疫抗体elisa检测试剂盒的鉴定1、特异性试验将实施例2制备的小反刍兽疫抗体elisa检测试剂盒对牛瘟阳性血清、山羊痘阳性血清，羊包虫病阳性血清，羊口蹄疫阳性血清、小反刍临床抗体阳性血清样品进行elisa检测，每个样品做3个重复，并同时设置阴阳性对照。
[0026]
试验结果表明，小反刍抗体临床阳性血清和阳性对照血清od平均值分别为1.208和1.106，其余样本试剂盒检测的od值均小于0.1，说明试剂盒与其他主要牛羊病无交叉反应，特异性好。
[0027] 2、灵敏度试验将小反刍兽疫高免血清做1:10、1:50、1:100、1:200、1:400、1:800倍（v/v）稀释。用试剂盒进行elisa检测。结果见下表所示。
[0028]
当小反刍抗体阳性血清稀释到1:200倍时，各试剂盒通过elisa检测显色后用肉眼即可判断结果，在酶标仪上读数时检出结果均为阳性，而在1:400血清稀释度检测结果为阴性。表明试剂盒的灵敏度较高。
[0029]
2、批内重复性试验选取10份抗体阳性样品，用实施例3中的试剂盒按照实施例4建立的方法检测，每个样品做10次重复。用统计学分析od值发现批內重复变异系数在6.7
‑
8.4%之间，均小于10%，说明该试剂盒重复性好。
[0030]
3、批间重复性试验用3个批次的试剂盒对10个抗体阳性样品进行测定，经统计学进行分析，3批次的实验结果差异不显著，变异系数在5.4
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8.9%之间，均小于10%，说明该试剂盒重复性好。
[0031]
4、保存期试验将包被好抗原的酶标板一式四份封好后置于2
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8℃分别保存3，6，9和12个月，即试剂盒的实时稳定性试验。对不同时间保存的酶标板用10份背景已知样品进行检测。
[0032]
经统计学分析，结果表明：各酶标板对每一样品进行检测时，3个月，6个月，9个月和12个月的结果均无明显差异，说明试剂盒在2
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8℃条件下可保存12个月。