一种甲基化电化学免疫分析方法、电极、电化学传感器与流程

1.本发明属于免疫分析技术领域，尤其涉及一种甲基化电化学免疫分析方法、电极、电化学传感器。


背景技术：

2.目前，dna甲基化一直是表观遗传领域研究的前沿和热点，由于其在细胞分化、胚胎发育、遗传性疾病和肿瘤发生等基因表达调控方面起着重要作用，dna甲基化分析已成为表观遗传紊乱疾病和肿瘤早期预警的新手段。传统dna甲基化检测技术存在一定的不足，如重亚硫酸氢测序存在测序深度﹑转化效率和庞大数据分析等不足，甲基化限制性酶切分析引物设计受酶识别序列的限制等,高效液相色谱、质谱等操作繁琐且需要庞大的仪器设备。电化学传感分析检测技术克服了以上缺点，具有成本低、操作简便、响应快速、灵敏度高和设备易于小型化等诸多优点，国内外应用电化学传感器检测dna甲基化主要是通过检测dna甲基转移酶的活性间接反映dna甲基化的的水平，灵敏度﹑特异性仍有待提高。
3.通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：国内外应用电化学传感器检测dna甲基化主要是通过检测dna甲基转移酶的活性间接反映dna甲基化的的水平低，灵敏度差﹑特异性差。


技术实现要素：

4.针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种甲基化电化学免疫分析方法、电极、电化学传感器，为基于mecp2蛋白和双酶信号放大的dna甲基化电化学免疫分析方法。
5.本发明是这样实现的，一种甲基化电化学免疫分析方法，所述甲基化电化学免疫分析方法，包括：
6.步骤一，制备纳米金修饰金电极；
7.步骤二，制备电化学传感器；
8.步骤三，抗5
‑
mc抗体和酶标二抗的固定；
9.步骤四，电化学测定。
10.进一步，所述步骤一中，纳米金修饰金电极的制备具体过程为：
11.将直径为2mm的金电极用0.05μm的al2o3粉打磨成镜面，然后分别在超纯水、无水乙醇、超纯水中超声清洗5min；
12.室温晾干后，将电极放入现配的piranha溶液中活化15min以上，然后用超纯水彻底清洗干净，氮气吹干；将上述处理好的金电极浸入haucl4·
3h2o溶液中，最后用超纯水充分淋洗干净，制得修饰的金电极。
13.进一步，所述piranha溶液为98％h2so4与30％h2o2按3∶1的体积混合。
14.进一步，所述haucl4·
3h2o为3mmol/l，含0.1mol/lkno3，于－0.2v电位下沉积120s。
15.进一步，所述步骤二中，电化学传感器的制备具体过程为：
16.向修饰的金电极表面滴加10μl1
×
te缓冲液，于4℃孵育过夜，使末端巯基化的dna探针通过au
‑
s键固定在电极表面；取出电极，用pbs充分淋洗去除多余吸附的dna，即制得单链dna修饰的金电极；然后滴加1mmol/lmch10μl，室温放置1h，以封闭电极表面的空白位点，pbs淋洗电极后氮气吹干；继续滴加10μl含0.1μmol/l靶dna、50mmol/lnacl和10mmol/lmgcl2的1
×
te缓冲液，于37℃水浴箱杂交90min；杂交完成后，电极用pbs重复冲洗3次，得到双链dna修饰的金电极，制得实验所用电化学传感器。
17.进一步，所述1
×
te缓冲液ph7.4，含有0.1μmol/l探针dna、50mmol/lnacl和1.0mmol/ltcep。
18.进一步，所述步骤三中，抗5
‑
mc抗体和酶标二抗的固定具体过程为：
19.将上述制备的电极用5％bsa室温封闭30min以防止后续加入抗体的非特异性吸附；向电极表面滴加10mg/l抗5
‑
mc抗体10μl，37℃孵育1h后，再次淋洗电极，继续滴加80mg/l酶标二抗10μl，于室温孵育30min；以上两步反应每一步后均用pbs重复淋洗3次后再进行下一步操作。
20.进一步，所述步骤四中，电化学测定具体过程为：
21.在含1mmol/lh2o2和1mmol/l对苯二酚的pbs溶液中，采用差分脉冲伏安法进行电化学测定；
22.测定参数：电位扫描范围－0.3～0.1v、采样间隔0.0167s、脉冲宽度0.05s、脉冲周期0.2s、静止时间2s。
23.本发明的另一目的在于提供一种所述甲基化电化学免疫分析方法在纳米金修饰金电极检测dna甲基化中的应用。
24.本发明的另一目的在于提供一种所述甲基化电化学免疫分析方法在电化学传感器检测dna甲基化中的应用。
25.结合上述的所有技术方案，本发明所具备的优点及积极效果为：本发明对电极进行电化学表征，裸金电极经过纳米金修饰、探针固定、mch封闭及靶序列杂交的修饰，每一步修饰后均在含0.1mol/lkcl的1mmol/l[fe(cn)]
3－/4－
溶液中采用循环伏安法(cv)进行电化学表征。结果显示，裸金电极在0.2～0.3v出现一对明显的氧化还原峰，电势差小于0.1v，提示[fe(cn)
3－/4
]
－6
在电极表面转移速度快；当电沉积纳米金后，由于电极表面的aunps有效提高电极比表面积，促进电子转移，所以氧化还原峰电流增高；当电极表面修饰上探针后，由于其带负电荷的磷酸骨架排斥溶液中同样带负电荷的离子扩散至电极表面，所以氧化还原峰电流减小，氧化峰与还原峰之间的电位差增大。电化学表征结果表明各成分均成功修饰到电极上，电极组装成功，如图2所示。
[0026]
本发明dna甲基化位点定量分析，分别对dnas1～s5进行检测，观察dpv峰电流与靶dna甲基化位点数量的关系。分别对0.1μmol/l的dnas1～s5进行检测，随着dna甲基化位点数量的增加，dpv峰电流随之增高，以甲基化位点数量和dpv峰电流值分别为横纵坐标作图，并计算得回归方程i(μa)＝1.598n 3.309，r＝0.991，在1～5个甲基化位点范围内，dpv峰电流与靶dna甲基化位点的数量呈线性关系，如图5
‑
图6所示。
附图说明
[0027]
图1是本发明实施例提供的甲基化电化学免疫分析方法流程图。
[0028]
图2是本发明实施例提供的循环伏安法进行电化学表征电位
‑
电流曲线示意图。
[0029]
图3是本发明实施例提供的杂交时间
‑
电流曲线示意图。
[0030]
图4是本发明实施例提供的抗体浓度
‑
电流曲线示意图。
[0031]
图5是本发明实施例提供的dna甲基化位点定量分析电位
‑
电流曲线示意图。
[0032]
图6是本发明实施例提供的甲基化位点数
‑
电流示意图。
具体实施方式
[0033]
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0034]
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种甲基化电化学免疫分析方法、电极、电化学传感器，下面结合附图对本发明作详细的描述。
[0035]
本发明提供的甲基化电化学免疫分析方法业内的普通技术人员还可以采用其他的步骤实施，图1的本发明提供的甲基化电化学免疫分析方法仅仅是一个具体实施例而已。
[0036]
如图1所示，本发明实施例提供的甲基化电化学免疫分析方法，包括：
[0037]
s101：制备纳米金修饰金电极；
[0038]
s102：制备电化学传感器；
[0039]
s103：抗5
‑
mc抗体和酶标二抗的固定；
[0040]
s104：电化学测定。
[0041]
本发明实施例提供的s101中，纳米金修饰金电极的制备具体过程为：
[0042]
将直径为2mm的金电极用0.05μm的al2o3粉打磨成镜面，然后分别在超纯水、无水乙醇、超纯水中超声清洗5min。室温晾干后，将电极放入现配的piranha溶液(98％h2so4与30％h2o2按3∶1的体积混合)中活化15min以上，然后用超纯水彻底清洗干净，氮气吹干。将上述处理好的金电极浸入3mmol/lhaucl4·
3h2o(含0.1mol/lkno3)溶液中，于－0.2v电位下沉积120s，最后用超纯水充分淋洗干净，制得修饰的金电极。
[0043]
本发明实施例提供的s102中，电化学传感器的制备具体过程为：
[0044]
向修饰的金电极表面滴加10μl含有0.1μmol/l探针dna、50mmol/lnacl和1.0mmol/ltcep的1
×
te缓冲液(ph7.4)，于4℃孵育过夜，使末端巯基化的dna探针通过au
‑
s键固定在电极表面。取出电极，用pbs充分淋洗去除多余吸附的dna，即制得单链dna(ssdna)修饰的金电极。然后滴加1mmol/lmch10μl，室温放置1h，以封闭电极表面的空白位点，pbs淋洗电极后氮气吹干。继续滴加10μl含0.1μmol/l靶dna、50mmol/lnacl和10mmol/lmgcl2的1
×
te缓冲液(ph7.4)，于37℃水浴箱杂交90min。杂交完成后，电极用pbs重复冲洗3次，得到双链dna(dsdna)修饰的金电极，即为实验所用电化学传感器。
[0045]
本发明实施例提供的s103中，抗5
‑
mc抗体和酶标二抗的固定具体过程为：
[0046]
将上述制备的电极用5％bsa室温封闭30min以防止后续加入抗体的非特异性吸附。向电极表面滴加10mg/l抗5
‑
mc抗体10μl，37℃孵育1h后，再次淋洗电极，继续滴加80mg/l酶标二抗10μl，于室温孵育30min；以上两步反应每一步后均用pbs重复淋洗3次后再进行下一步操作。
[0047]
本发明实施例提供的s104中，电化学测定具体过程为：
[0048]
在含1mmol/lh2o2和1mmol/l对苯二酚的pbs溶液中，采用差分脉冲伏安法(dpv)进行电化学测定。测定参数:电位扫描范围－0.3～0.1v、采样间隔0.0167s、脉冲宽度0.05s、脉冲周期0.2s、静止时间2s。
[0049]
下面结合具体仿真实验对本发明的技术方案作进一步的描述。
[0050]
1、对电极进行电化学表征，裸金电极经过纳米金修饰、探针固定、mch封闭及靶序列杂交的修饰，每一步修饰后均在含0.1mol/lkcl的1mmol/l[fe(cn)]
3－/4－
溶液中采用循环伏安法(cv)进行电化学表征。结果显示，裸金电极在0.2～0.3v出现一对明显的氧化还原峰，电势差小于0.1v，提示[fe(cn)
3－/4
]
－6
在电极表面转移速度快；当电沉积纳米金后，由于电极表面的aunps有效提高电极比表面积，促进电子转移，所以氧化还原峰电流增高；当电极表面修饰上探针后，由于其带负电荷的磷酸骨架排斥溶液中同样带负电荷的离子扩散至电极表面，所以氧化还原峰电流减小，氧化峰与还原峰之间的电位差增大。电化学表征结果表明各成分均成功修饰到电极上，电极组装成功，如图2所示。
[0051]
2、dna甲基化电化学测定条件的优化，包括杂交时间的优化及抗5
‑
mc抗体浓度的优化。得到最佳的杂交时间为90分钟，最佳抗体浓度为10mg/l，如图3
‑
图4所示。
[0052]
3、dna甲基化位点定量分析，分别对dnas1～s5进行检测，观察dpv峰电流与靶dna甲基化位点数量的关系。分别对0.1μmol/l的dnas1～s5进行检测，随着dna甲基化位点数量的增加，dpv峰电流随之增高，以甲基化位点数量和dpv峰电流值分别为横纵坐标作图，并计算得回归方程i(μa)＝1.598n 3.309，r＝0.991，在1～5个甲基化位点范围内，dpv峰电流与靶dna甲基化位点的数量呈线性关系，如图5
‑
图6所示。
[0053]
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。