一种测定DNA甲基转移酶活性的方法及应用与流程

技术特征：
1.一种测定dna甲基转移酶活性的方法，其特征在于，所述测定dna甲基转移酶活性的方法包括：rgo
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cds：mnnps的制备；羧化cdte qds和cdte@dna网状结构的制备；金电极预处理；pec生物传感器的制备；pec信号响应检测。2.如权利要求1所述的测定dna甲基转移酶活性的方法，其特征在于，所述rgo
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cds：mnnps的制备，包括：(1)将5mg氧化石墨烯用5ml超纯水稀释，并通过水浴超声处理获得1mg/ml的均匀分散的液体；(2)0.2g pvp和200μl氧化石墨烯液体依次加入50ml超纯水中，期间用玻璃棒不断进行搅拌；(3)向混合溶液中依次加入0.0917g cdcl2，0.0050g mncl2·
4h2o和0.1gtaa，在80℃下连续搅拌反应2h；(4)通过11000
×
g离心洗涤三次获得rgo
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cds：mnnps固体，真空干燥后将所得粉末放于4℃冰箱保存。3.如权利要求1所述的测定dna甲基转移酶活性的方法，其特征在于，所述羧化cdte qds网状结构的制备，包括：(1)称取0.0500g nabh4和1.5960g teo2，并将nabh4和teo2溶解于10ml超纯水中以获得新鲜的nahte溶液；(2)配置另一种混合溶液，所述混合溶液含有1mm cdcl2和1.8mm tga，并用1mm naoh溶液调节ph至11；(3)混合溶液通入n20.5h以排除溶液中的o2后，快速加入新鲜配置的nahte溶液在80℃下连续反应5h，期间不断进行温和搅拌；(4)反应结束之后，通过11000
×
g离心洗涤三次获得纯化的cdte qds，将cdte qds重新分散于超纯水中并放于4℃冰箱保存。4.如权利要求1所述的测定dna甲基转移酶活性的方法，其特征在于，所述cdte@dna网状结构的制备，包括：(1)配置活化液40μl，所述活化液含有10mm edc和20mm nhs；(2)向配置好的活化液中加入40μl 5’端氨基修饰的target dna s31μm活化30min；(3)向混合溶液中滴加等体积的cdte溶液并在37℃温育2h，并不断进行温和搅拌；(4)反应结束后，通过离心洗涤重新溶解于超纯水中获得cdte@dna网状结构，放入4℃冰箱保存。5.如权利要求1所述的测定dna甲基转移酶活性的方法，其特征在于，所述金电极预处理，包括：(1)将金电极用直径为0.3μm和0.05μm的三氧化二铝粉末依次抛光打磨5min；(2)将打磨好的金电极依次经过丙酮、无水乙醇和超纯水超声清洗；(3)将清洗完成的金电极在空气中干燥后，放入新鲜配置的食人鱼溶液，活化15min；
(4)活化完成后，将金电极用超纯水冲洗干净，在n2氛围下干燥备用。6.如权利要求1所述的测定dna甲基转移酶活性的方法，其特征在于，所述食人鱼溶液由30％过氧化氢和98％浓硫酸按照1：3，v/v的比例混合而成。7.如权利要求1所述的测定dna甲基转移酶活性的方法，其特征在于，所述pec生物传感器的制备，包括：(1)取10μl 3mg/ml的rgo
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cds：mnnps溶液滴加在金电极表面；待完全干燥后，将电极浸泡在tris
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hcl缓冲液中，并在4℃下反应5h得到tga封端的rgo
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cds：mn/ge，在电极表面引入羧基以完成后续dna的连接；(2)将rgo
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cds：mn/ge修饰电极浸入活化液中反应30min以活化羧基；接着，在修饰电极上滴加10μl probe dna s11μm并在4℃下反应12h，通过edc/nhs偶联反应在电极上捕获dna链；(3)将1％的bsa溶液滴加于修饰电极上，在室温下反应30min以阻断非特异性位点结合；用洗涤液冲洗三次后，取10μl target dna s21μm滴加于修饰电极表面并在37℃下孵育2h；(4)dna甲基化过程是通过在修饰电极上滴加10μl缓冲液并在37℃孵育2h完成的；用洗涤液冲洗三次后，继续滴加10μl 80u/ml hpaii溶液并在37℃下孵育2h以消极未甲基化的单链dna；(5)在修饰电极上滴加10μl cdte@dna网状结构并在37℃下反应40min；反应完成后，将制备的电极放于4℃冰箱保存。8.如权利要求7所述的测定dna甲基转移酶活性的方法，其特征在于，所述tris
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hcl缓冲液由0.1m nacl和0.3m tga组成；所述活化液由10mm edc和20mm nhs组成；所述缓冲液由160μm sam和0
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150u/ml m.sssimtase组成。9.如权利要求1所述的测定dna甲基转移酶活性的方法，其特征在于，所述pec信号响应检测，包括：用三电极系统在光电化学工作站上进行光电流信号响应检测；在该系统中，ag/agcl电极作为参比电极，铂电极作为辅助电极，2mm直径的金电极作为工作电极；光电流信号响应在0.1m pbs缓冲液中检测，其中白光作为检测光源，每隔10s开关光检测，同时施加的电压为0.0v；所述pbs缓冲液为0.1m aa，ph7.4。10.一种如权利要求1～9任意一项所述测定dna甲基转移酶活性的方法在dna甲基转移酶活性检测中的应用。

技术总结
本发明属于酶的活性检测技术领域，公开了一种测定DNA甲基转移酶活性的方法及应用，测定DNA甲基转移酶活性的方法包括：进行RGO


技术研发人员：郑峻松 朱全敬 李艳 刘华敏 黄辉 方立超 汪莉娜 邓均 朱垂雨 李承红 刘飞雪 吴春梅
受保护的技术使用者：中国人民解放军陆军军医大学
技术研发日：2021.08.13
技术公布日：2021/10/23