一种测定DNA甲基转移酶活性的方法及应用与流程

一种测定dna甲基转移酶活性的方法及应用
技术领域
1.本发明属于酶的活性检测技术领域，尤其涉及一种测定dna甲基转移酶活性的方法及应用。


背景技术：

2.目前，dna甲基转移酶催化dna甲基化，在调节基因表达和发育方面起关键作用。异常的dna甲基转移酶活性导致异常的dna甲基化，这与许多类型的疾病如癌症密切相关。显然，dna甲基转移酶活性被认为是一种潜在的癌症生物标志物和癌症治疗中的药物作用靶点。因此，发展一种灵敏、选择性的方法用于dna甲基转移酶活性的分析和其抑制剂(抗甲基化药物)的筛选对于早期癌症诊断和治疗至关重要。
3.目前，用于dna甲基转移酶活性检测的传统方法包括凝胶电泳、高效液相色谱和放射性标记法。尽管这些方法已经很好的建立，但大多数存在耗时费力、方法操作繁琐、灵敏度低，且需要复杂昂贵的仪器或繁琐的信号标记或需要放射性试剂等缺点。因此，亟需一种新的测定dna甲基转移酶活性的方法，以克服现有技术缺陷，提高酶活性检测的灵敏度。
4.通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：用于dna甲基转移酶活性检测的传统方法存在耗时费力、方法操作繁琐、灵敏度低，且需要复杂昂贵的仪器或繁琐的信号标记或需要放射性试剂等缺点。
5.解决以上问题及缺陷的难度为：需要经过繁琐的预处理过程和复杂的标记过程，而这些步骤造成了检测时间的延长和检测的低灵敏度。
6.解决以上问题及缺陷的意义为：pec法不仅具备光学的高灵敏度和电化学的高稳定性，还拥有背景干扰小，操作简便，检测响应快等优点。因此，在双信号放大系统的作用下，通过分析m.sssi mtase浓度和所产生的光电流信号响应之间的关系，该方法能够灵敏地检测出m.sssi mtase的活性，并为dna甲基化的临床诊断提供新的思路和方法。


技术实现要素：

7.针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种测定dna甲基转移酶活性的方法及应用，尤其涉及一种基于双信号放大光电化学法的测定dna甲基转移酶活性的方法。
8.本发明是这样实现的，一种测定dna甲基转移酶活性的方法，所述测定dna甲基转移酶活性的方法包括以下步骤：
9.步骤一，进行rgo
‑
cds：mn nps的制备；
10.步骤二，进行羧化cdte qds和cdte@dna网状结构的制备；
11.步骤三，进行金电极预处理；
12.步骤四，进行pec生物传感器的制备；
13.步骤五，进行pec信号响应检测。
14.进一步，步骤一中，所述rgo
‑
cds：mn nps的制备，包括：
15.(1)将5mg氧化石墨烯用5ml超纯水稀释，并通过水浴超声处理获得1mg/ml的均匀
分散的液体；
16.(2)0.2g pvp和200μl氧化石墨烯液体依次加入50ml超纯水中，期间用玻璃棒不断进行搅拌；
17.(3)向混合溶液中依次加入0.0917g cdcl2，0.0050g mncl2·
4h2o和0.1g taa，在80℃下连续搅拌反应2h；
18.(4)通过11000
×
g离心洗涤三次获得rgo
‑
cds：mn nps固体，真空干燥后将所得粉末放于4℃冰箱保存。
19.进一步，步骤二中，所述羧化cdte qds网状结构的制备，包括：
20.(1)称取0.0500g nabh4和1.5960g teo2，并将nabh4和teo2溶解于10ml超纯水中以获得新鲜的nahte溶液；
21.(2)配置另一种混合溶液，所述混合溶液含有1mm cdcl2和1.8mm tga，并用1mm naoh溶液调节ph至11；
22.(3)混合溶液通入n
2 0.5h以排除溶液中的o2后，快速加入新鲜配置的nahte溶液在80℃下连续反应5h，期间不断进行温和搅拌；
23.(4)反应结束之后，通过11000
×
g离心洗涤三次获得纯化的cdte qds，将cdte qds重新分散于超纯水中并放于4℃冰箱保存。
24.进一步，步骤二中，所述cdte@dna网状结构的制备，包括：
25.(1)配置活化液40μl，所述活化液含有10mm edc和20mm nhs；
26.(2)向配置好的活化液中加入40μl 5’端氨基修饰的target dna s3 1μm活化30min；
27.(3)向混合溶液中滴加等体积的cdte溶液并在37℃温育2h，并不断进行温和搅拌；
28.(4)反应结束后，通过离心洗涤重新溶解于超纯水中获得cdte@dna网状结构，放入4℃冰箱保存。
29.进一步，步骤三中，所述金电极预处理，包括：
30.(1)将金电极用直径为0.3μm和0.05μm的三氧化二铝粉末依次抛光打磨5min；
31.(2)将打磨好的金电极依次经过丙酮、无水乙醇和超纯水超声清洗；
32.(3)将清洗完成的金电极在空气中干燥后，放入新鲜配置的食人鱼溶液，活化15min；
33.(4)活化完成后，将金电极用超纯水冲洗干净，在n2氛围下干燥备用。
34.进一步，步骤三中，所述食人鱼溶液由30％过氧化氢和98％浓硫酸按照1：3，v/v的比例混合而成。
35.进一步，步骤四中，所述pec生物传感器的制备，包括：
36.(1)取10μl 3mg/ml的rgo
‑
cds：mn nps溶液滴加在金电极表面；待完全干燥后，将电极浸泡在tris
‑
hcl缓冲液中，并在4℃下反应5h得到tga封端的rgo
‑
cds：mn/ge，在电极表面引入羧基以完成后续dna的连接；
37.(2)将rgo
‑
cds：mn/ge修饰电极浸入活化液中反应30min以活化羧基；接着，在修饰电极上滴加10μl probe dna s1 1μm并在4℃下反应12h，通过edc/nhs偶联反应在电极上捕获dna链；
38.(3)将1％的bsa溶液滴加于修饰电极上，在室温下反应30min以阻断非特异性位点
结合；用洗涤液冲洗三次后，取10μl target dna s2 1μm滴加于修饰电极表面并在37℃下孵育2h；
39.(4)dna甲基化过程是通过在修饰电极上滴加10μl缓冲液并在37℃孵育2h完成的；用洗涤液冲洗三次后，继续滴加10μl 80u/ml hpaii溶液并在37℃下孵育2h以消极未甲基化的单链dna；
40.(5)在修饰电极上滴加10μl cdte@dna网状结构并在37℃下反应40min；反应完成后，将制备的电极放于4℃冰箱保存。
41.进一步，所述tris
‑
hcl缓冲液由0.1m nacl和0.3m tga组成；所述活化液由10mm edc和20mm nhs组成；所述缓冲液由160μm sam和0
‑
150u/ml m.sssi mtase组成。
42.进一步，步骤五中，所述pec信号响应检测，包括：
43.用三电极系统在光电化学工作站上进行光电流信号响应检测；
44.在该系统中，ag/agcl电极作为参比电极，铂电极作为辅助电极，2mm直径的金电极作为工作电极；光电流信号响应在0.1m pbs缓冲液中检测，其中白光作为检测光源，每隔10s开关光检测，同时施加的电压为0.0v。
45.进一步，所述pbs缓冲液为0.1m aa，ph7.4。
46.本发明的另一目的在于提供一种所述测定dna甲基转移酶活性的方法在dna甲基转移酶活性检测中的应用。
47.结合上述的所有技术方案，本发明所具备的优点及积极效果为：本发明提供的测定dna甲基转移酶活性的方法，制备了基于新型纳米复合材料rgo
‑
cds：mn nps和cdte@dna网状结构的双重信号放大系统的pec生物传感器来检测m.sssi mtase的活性；纳米复合材料rgo
‑
cds：mn nps由于其异质结结构可以产生较强的光电流信号响应；cdte@dna网状结构由于其更窄的禁带宽度，可以加速电子向rgo
‑
cds：mn nps转移，从而产生极强的光电流信号响应。在双重信号放大系统的帮助下，本发明所制备的生物传感器实现了对m.sssi mtase的超灵敏检测，其检测范围从0.01至80u/ml，同时与其他文献报道的方法相比，该方法操作简单，不需要复杂昂贵的仪器或繁琐的信号标记。
附图说明
48.为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对本发明实施例中所需要使用的附图做简单的介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下还可以根据这些附图获得其他的附图。
49.图1是本发明实施例提供的测定dna甲基转移酶活性的方法流程图。
具体实施方式
50.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
51.针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种测定dna甲基转移酶活性的方法及应用，下面结合附图对本发明作详细的描述。
52.如图1所示，本发明实施例提供的测定dna甲基转移酶活性的方法包括以下步骤：
53.s101，进行rgo
‑
cds：mn nps的制备；
54.s102，进行羧化cdte qds和cdte@dna网状结构的制备；
55.s103，进行金电极预处理；
56.s104，进行pec生物传感器的制备；
57.s105，进行pec信号响应检测。
58.下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步描述。
59.1、本发明实施例提供的测定dna甲基转移酶活性的过程步骤如下：
60.(1)rgo
‑
cds：mn nps的制备
61.首先，5mg氧化石墨烯用5ml超纯水稀释，并通过水浴超声处理获得均匀分散的液体，其浓度为1mg/ml。接着，取0.2g pvp和200μl氧化石墨烯液体依次加入50ml超纯水中，期间用玻璃棒不断进行搅拌。然后，向混合溶液中依次加入0.0917g cdcl2，0.0050g mncl2·
4h2o和0.1g taa，在80℃下连续搅拌反应2小时。最后，通过11000
×
g离心洗涤三次获得rgo
‑
cds：mn nps固体，真空干燥后将所得粉末放于4℃冰箱保存。
62.(2)羧化cdte qds和cdte@dna网状结构的制备
63.首先，称取0.0500g nabh4和1.5960g teo2，将它们溶解于10ml超纯水中以获得新鲜的nahte溶液。接着，配置另一种混合溶液，其含有1mm cdcl2和1.8mm tga，并用1mm naoh溶液调节ph至11。混合溶液通入n2半小时以排除溶液中的o2后，快速加入新鲜配置的nahte溶液在80℃下连续反应5小时，期间不断进行温和搅拌。反应结束之后，通过11000
×
g离心洗涤三次获得纯化的cdte qds，将其重新分散于超纯水中并放于4℃冰箱保存。cdte@dna网状结构的制备步骤如下：首先，配置活化液40μl，其含有10mm edc和20mm nhs。接着，向配置好的活化液中加入40μl 5’端氨基修饰的target dna s3(1μm)活化30分钟。随后，向混合溶液中滴加等体积的cdte溶液并在37℃温育2小时，并不断进行温和搅拌。反应结束后，通过离心洗涤重新溶解于超纯水中获得cdte@dna网状结构，放入4℃冰箱保存。
64.(3)金电极预处理
65.首先，金电极用直径为0.3μm和0.05μm的三氧化二铝粉末依次抛光打磨5分钟。接着，将打磨好的金电极依次经过丙酮、无水乙醇和超纯水超声清洗。清洗完成的金电极在空气中干燥后，放入新鲜配置的食人鱼溶液[30％过氧化氢和98％浓硫酸(1：3)，v/v]活化15分钟。活化完成后，将金电极用超纯水冲洗干净，在n2氛围下干燥备用。
[0066]
(4)pec生物传感器的制备
[0067]
首先，取10μl rgo
‑
cds：mn nps溶液(3mg/ml)滴加在金电极表面。待完全干燥后，为了在电极表面引入羧基以完成后续dna的连接，将电极浸泡在tris
‑
hcl缓冲液(0.1m nacl，0.3m tga)中，并在4℃下反应5小时得到tga封端的rgo
‑
cds：mn/ge。然后，将rgo
‑
cds：mn/ge修饰电极浸入活化液(10mm edc，20mm nhs)中反应30分钟以活化羧基。接着，在修饰电极上滴加10μl probe dna s1(1μm)并在4℃下反应12小时，通过edc/nhs偶联反应在电极上捕获dna链。随后，将1％的bsa溶液滴加于修饰电极上，在室温下反应30分钟以阻断非特异性位点结合。用洗涤液冲洗三次后，取10μl target dna s2(1μm)滴加于修饰电极表面并在37℃下孵育2小时。dna甲基化过程是通过在修饰电极上滴加10μl缓冲液(160μm sam，0
‑
150u/ml m.sssi mtase)并在37℃孵育2小时完成的。用洗涤液冲洗三次后，继续滴加10μ
l80u/ml hpaii溶液并在37℃下孵育2小时以消极未甲基化的单链dna。最后，在修饰电极上滴加10μl cdte@dna网状结构并在37℃下反应40分钟。反应完成后，将制备的电极放于4℃冰箱保存。
[0068]
(5)pec信号响应检测
[0069]
本实验使用三电极系统在光电化学工作站上进行光电流信号响应检测。在该系统中，ag/agcl电极作为参比电极，铂电极作为辅助电极，2mm直径的金电极作为工作电极。光电流信号响应在0.1m pbs缓冲液(0.1m aa，ph7.4)中检测，其中白光作为检测光源，每隔10秒开关光检测。同时施加的电压为0.0v。
[0070]
2、实验结果
[0071]
本发明制备了基于新型纳米复合材料rgo
‑
cds：mn nps和cdte@dna网状结构的双重信号放大系统的pec生物传感器来检测m.sssi mtase的活性。纳米复合材料rgo
‑
cds：mn nps由于其异质结结构可以产生较强的光电流信号响应。cdte@dna网状结构由于其更窄的禁带宽度，可以加速电子向rgo
‑
cds：mn nps转移，从而产生极强的光电流信号响应。在双重信号放大系统的帮助下，所制备的生物传感器实现了对m.sssi mtase的超灵敏检测，其检测范围从0.01至80u/ml，同时与其他文献报道的方法相比，该方法操作简单，不需要复杂昂贵的仪器或繁琐的信号标记。
[0072]
下面结合实验对本发明的技术效果作详细的描述。
[0073]
本实验构建了一种新型pec生物传感器，利用rgo
‑
cds:mn nps和cdte@dna网状结构的双重信号放大策略来检测m.sssi mtase的活性。首先，rgo
‑
cds:mn nps附着在金电极表面作为基底材料。接着，依次在修饰电极上捕获探针dnas1，bsa和具有dna甲基化识别序列的靶标dna s2。在经过甲基化和消化过程之后，甲基化的双链dna可以保留并与cdte@dna网状结构杂交，产生增强的光电流信号响应。
[0074]
在最优实验条件下，光电流(i)与m.sssi mtase浓度的对数呈良好的线性关系，线性范围为0.01u/ml至80u/ml，检测限为0.0071u/ml。
[0075]
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。