利用银纳米裂隙壳的阿尔茨海默病诊断方法与流程

1.本发明涉及利用银纳米裂隙壳(ag nanogapshell：agngs)的阿尔茨海默病诊断方法。更具体而言，本发明涉及利用基于银纳米裂隙壳的sers免疫测量法的阿尔茨海默病诊断方法，涉及一种可以以高灵敏度多重检测多个阿尔茨海默病靶标生物标志物并以非侵入方式早期诊断阿尔茨海默的诊断方法。


背景技术：

2.临床上的阿尔茨海默病(alzheimer's disease：ad)诊断依赖于pet等脑影像成像技法、问诊、脑脊液中存在的aβ40、aβ42等酶联免疫吸附检查(enzyme
‑
linked immunosorbent assay：elisa)。最近，为了ad诊断的准确度及早期诊断，正在开发基于多样纳米技术的诊断法。特别是基于sers的诊断法，在灵敏度及多重检测方面受到相当关注，但根据以往技术开发的基于sers的诊断法存在局限于对单一靶标的检测且灵敏度也相当低的问题。因此，正在继续进行旨在开发能够以高灵敏度检测血液内的多种靶标生物标志物的基于sers的ad诊断法的研究。
3.以往的方法需要昂贵的装备，并由于侵入式的脑脊液采样而伴随着患者的痛苦。另外，由于无法追踪疾病的进展程度，存在只有症状在相当程度上进展后才能诊断的致命问题。另外，为了追踪复杂机制的ad发病及进展程度，同时追踪相关多种生物标志物的技术是提高疾病诊断准确度及早期诊断可能性所必需的，但以往技术存在仅仅追踪单一生物标志物的界限。而且，为了早期诊断，要求通过非侵入式或最小侵入式方法而从血液等患者样本中检测多种生物标志物的技术，但在血液样本中存在pg/ml水平的极少量的ad靶标生物标志物，因而需要用于对此进行检测的非常灵敏的诊断技术，但诸如elisa的以往技术存在无法达到相应灵敏度的问题。因此，依然要求用于以高灵敏度进行非侵入式多重检测及早期诊断ad的技术。


技术实现要素：

4.技术问题
5.本发明要实现的技术课题旨在解决前述问题，提供一种能够同时检测用于阿尔茨海默病诊断的多个生物标志物的包含银纳米裂隙壳的阿尔茨海默病诊断用组合物。
6.另外，本发明的另一目的提供一种利用所述诊断用组合物的阿尔茨海默病诊断方法和鉴别并诊断阿尔茨海默病及轻度认知障碍的方法。
7.但是，本发明要实现的课题不限于以上提及的课题，未提及的其他课题是相应技术领域的普通技术人员可以从以下记载理解的。
8.技术方案
9.为了解决所述课题，本发明提供一种包含银纳米裂隙壳作为有效成分的阿尔茨海默病诊断用组合物，其中，所述银纳米裂隙壳导入了选自由对淀粉样蛋白β(amyloid beta：aβ)40的特异性抗体及对aβ42的特异性抗体构成的组的1种以上抗体。
10.另外，本发明提供一种包括导入了对aβ40或aβ42的特异性抗体的银纳米裂隙壳及固定有所述银纳米裂隙壳的基板的阿尔茨海默病诊断用生物传感器。
11.作为本发明的一个体现例，所述基板可以包括磁珠，利用磁珠而固定银纳米裂隙壳。
12.另外，本发明提供一种阿尔茨海默病诊断方法和用于阿尔茨海默病诊断的信息提供方法，包括：
13.(1)将对淀粉样蛋白β(amyloid beta：aβ)40的特异性抗体接合于银纳米裂隙壳(agngs)的表面而制备agngs
‑
aβ40的步骤；(2)将对aβ42的特异性抗体接合于agngs的表面而制备agngs
‑
aβ42的步骤；(3)将所述agngs
‑
aβ40及agngs
‑
aβ42和生物学样本在生物体外混合而诱导基于银纳米裂隙壳的夹层复合体(agngs
‑
based sandwich complex)形成的步骤；(4)在所述样本中测量各复合体的拉曼信号并计算aβ40与aβ42之比的步骤；及(5)当所述aβ40与aβ42之比为2.5至999时判定为阿尔茨海默病的步骤。
14.作为本发明的一个体现例，所述生物学样本可以为血液或血清，优选地，可以为血清。
15.另外，本发明提供包含导入对aβ40的特异性抗体的银纳米裂隙壳(agngs
‑
aβ40)及导入对aβ42的特异性抗体的银纳米裂隙壳(agngs
‑
aβ42)作为有效成分的阿尔茨海默病与轻度认知障碍鉴别诊断用组合物。
16.另外，本发明提供一种在基板上固定有所述agngs
‑
aβ40和agngs
‑
aβ42的阿尔茨海默病与轻度认知障碍鉴别诊断用生物传感器。
17.另外，本发明提供一种包括下述步骤的鉴别并诊断阿尔茨海默病与轻度认知障碍的方法及用于鉴别诊断的信息提供方法：
18.一种用于阿尔茨海默病与轻度认知障碍的鉴别诊断的信息提供方法，包括：
19.(1)将对淀粉样蛋白β(amyloid beta：aβ)40的特异性抗体接合于银纳米裂隙壳(agngs)的表面而制备agngs
‑
aβ40的步骤；(2)将对aβ42的特异性抗体接合于agngs的表面而制备agngs
‑
aβ42的步骤；(3)将所述agngs
‑
aβ40及agngs
‑
aβ42和生物学样本在生物体外混合而诱导基于银纳米裂隙壳的夹层复合体(agngs
‑
based sandwich complex)形成的步骤；(4)在所述样本中测量各复合体的拉曼信号并计算aβ40与aβ42之比的步骤；及(5)为
‑
999至1.1时，区分为正常人，为1.1至2.5时，区分为轻度认知障碍，为2.5至999时，区分为阿尔茨海默病的步骤。
20.另外，本发明提供一种用于阿尔茨海默病与轻度认知障碍的鉴别诊断的agngs
‑
aβ40及agngs
‑
aβ42的用途。
21.技术效果
22.根据本发明的利用银纳米裂隙壳的阿尔茨海默病诊断方法，可以利用极强地显示出标志物固有的特异性表面增强拉曼散射(surface
‑
enhanced raman scattering：sers)信号的agngs纳米探针和磁珠，以免疫测量法同时检测2种淀粉样肽(aβ40、aβ42)。
23.特别是基于agngs的sers免疫测量法针对aβ40、aβ42，可实现不足1pg/ml的超高灵敏度检测，对各靶标特异性地进行反应，因而具有可以无干扰地同时检测多个靶标生物标志物的优点。
24.而且，根据本发明，即使在复杂环境的人血清条件下，也以高灵敏度多重检测aβ
40、aβ42，从而具有基于血液的ad非侵入早期诊断可能性，这具有除ad以外，还可应用于要求高灵敏度及多重检测能力的多种疾病诊断与追踪的优点。
附图说明
25.图1是对于利用以靶标特异性抗体改性的磁珠及agngs的免疫测量法及拉曼信号测量方法的模式图。
26.图2是显示对阿尔茨海默病(ad)生物标志物2种(aβ、aβ)的检测结果的图((a)是对于aβ检测的各浓度的微阵列映射图像，(b)是显示出对于(a)所示区域的agngs拉曼信号的图表，(c)是对于(a)的各浓度的信号的图表，(d)是对于aβ检测的各浓度的微阵列映射图像，(e)是对于(d)所示区域的agngs的拉曼信号，(f)是对于(d)的各浓度的信号的图表)。
27.图3是显示基于agngs的sers免疫反应的特异性检验的图。
28.图4是显示血液样本中的多重检测能力的图。
29.图5是显示临床样本中aβ40与aβ42的检测结果及其比值(ratio)的图。
30.优选实施方式
31.本发明人对于用于以高灵敏度从非侵入性样本检测多重生物标志物而早期诊断ad的技术进行锐意研究，从而完成了本发明。
32.阿尔茨海默(alzheimer's disease,ad)痴呆为退行性脑疾病，初期主要从对最近事情的记忆力下降开始，如果病情进展，则伴随着多种认知功能的异常。如果检查阿尔茨海默患者的脑组织，则观察到神经斑块和神经纤维缠结，在利用mri的脑结构影像中，可见因神经细胞消失导致的全面脑萎缩(brain atrophy)。在疾病初期，主要局限于作为负责记忆力的主要脑部位的海马体(hippocampus)和内嗅皮层(entorhinal cortex)部位出现，但逐渐经顶叶、前额叶等扩散到全脑。特别是已知当具有apolipoprotein e(apoe)epsilon 4等位基因时，阿尔茨海默痴呆的发病率高，已知apoe epsilon基因中除epsilon 4外，还抑制淀粉样蛋白β(amyloid beta protein:aβprotein)生成。
33.本发明人以非侵入性样本(特别是血清)为对象，确认了当利用基于银纳米裂隙壳(ag nanogapshell：agngs)的sers免疫测量法时，能够以极高灵敏度进行阿尔茨海默病诊断的生物标志物检测，能够同时检查2种以上的生物标志物。
34.因此，本发明可以提供一种包含导入了对aβ40及/或aβ42的特异性抗体的银纳米裂隙壳作为有效成分的阿尔茨海默病诊断用组合物。
35.本发明的组合物除了所述导入了抗体的银纳米裂隙壳之外，可以追加包含在药理学上或生理学上可接受的载体、赋形剂、稀释剂，作为这种组合物中可以包含的适合的载体、赋形剂及稀释剂的示例，可以例如乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯树胶、海藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、无定形纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石粉、硬脂酸镁和矿物油等。所述组合物在进行药剂化时，可以追加包含通常的填充剂、增量剂、粘合剂、崩解剂、表面活性剂、抗凝剂、润滑剂、润湿剂、香料、乳化剂、防腐剂等。
36.在本发明中，银纳米裂隙壳(ag nanogap shell:agngs)为纳米探针(nanoprobe)，包括作为基础颗粒的二氧化硅颗粒及包含银(ag)的金属层构成，其中，所述金属层包裹所述二氧化硅颗粒，存在多个裂隙(gap)，在所述金属层存在的裂隙(gap)中导入拉曼标记，显
示出表面增强拉曼散射信号，在金属层的表面导入对aβ40或aβ42的特异性抗体，分别形成agngs
‑
aβ40或agngs
‑
aβ42。构成所述agngs
‑
aβ40及agngs
‑
aβ42的抗体与各个样本中包含的aβ40或aβ42具有高特异性并结合，形成基于银纳米裂隙壳的夹层复合体(agngs
‑
based sandwich complex)。本发明人确认了当检测所述复合体的表面增强拉曼散射(surface
‑
enhanced raman scattering：sers)信号时，能够以极高灵敏度实现aβ40及/或aβ42的检测。
37.另一方面，轻度认知障碍(mild cognitive impairment：mci)是认知功能比正常下降的状态，是指被认为是阿尔茨海默痴呆的前兆，但保存了处理日常生活的能力，尚未痴呆的状态。就轻度认知障碍患者而言，已知发展为阿尔茨海默病的可能性相当大，但在早期接受适当治疗的情况下，25～30％的轻度认知障碍患者恢复正常。为了预防阿尔茨海默病并在发病后尽快治疗，需能够早期诊断轻度认知障碍患者，同时为了适宜的治疗，最好能够鉴别诊断轻度认知障碍患者与阿尔茨海默病患者。
38.因此，本发明人使正常人、确诊为轻度认知障碍或阿尔茨海默病的患者的血清样本与本发明的agngs
‑
aβ40及agngs
‑
aβ42反应，诱导复合体形成，根据下式1，从sers信号值计算了aβ40与aβ42的比率。
39.[式1]
[0040][0041]
i
a
‑
b
＝将a～b范围的接曼强度全部相加的值
[0042]
结果，正常人、轻度认知障碍及阿尔茨海默各自的样本具有不同的aβ40/aβ42值，可知所述结果值越小，认知能力越正常，结果值越大，认知能力等越发生问题。具体可知，当是轻度认知障碍时，aβ40/aβ42值在1.1至2.5范围内，当具有比其更小的值时，可以判定为正常，当具有比其更高的值时，可以判定为阿尔茨海默病。
[0043]
因此，本发明人可以迅速准确地鉴别并诊断痴呆患者与轻度认知障碍患者，特别是从可以利用非侵入性样本(血清)而提供准确的诊断结果这点上，可以简单地通过追踪检查而预防痴呆或通过早期诊断而适时进行适当治疗。
具体实施方式
[0044]
本发明可以施加多样的变换，可以具有多个实施例，下面将在附图中示例性图示特定实施例并在发明内容中详细说明。但是，这并非要针对特定实施形态而限定本发明，应理解为包括本发明的思想及技术范围内包含的所有变换、均等物以及替代物。在说明本发明方面，当判断认为对相关公知技术的具体说明可能混淆本发明要旨时，省略该详细说明。
[0045]
【实施例】
[0046]
实施例1.agngs
‑
aβ40及agngs
‑
aβ42的制备
[0047]
根据下述方法，制备了独立地导入了对aβ40或aβ42的特异性抗体的银纳米裂隙壳(参照kr 10
‑
1944346)。
[0048]1‑
1.二氧化硅颗粒合成及硫醇作用基形成
[0049]
(1)将原硅酸四乙酯溶解于40ml纯乙醇后，添加氢氧化铵，在常温下反应20小时。
[0050]
(2)利用离心机去除未反应物后，最终稀释为1mg/ml的浓度。
[0051]
(3)在1ml的合成的二氧化硅颗粒(1mg/ml)中添加巯基丙基三聚乙氧基硅烷和氢氧化铵，在常温下反应12小时。
[0052]
(4)利用离心机去除未反应物。(mpts
‑
silica)
[0053]1‑
2.利用硫醇
‑
银结合力在二氧化硅颗粒表面形成银纳米裂隙壳
[0054]
(1)将mpts
‑
silica、pvp、agno3溶解于50ml乙二醇后，添加辛胺进行还原反应。添加辛胺后1分钟，添加拉曼标记(4
‑
氟苯硫酚、4
‑
溴苯硫酚、4
‑
氯苯硫酚、苯硫酚)。
[0055]
(2)利用离心机去除未反应物。(agngs)
[0056]1‑
3.为了在银纳米裂隙壳表面导入化学作用基而利用巯基十一烷酸和巯基己醇形成自组装单分子膜
[0057]
(1)在合成的agngs中添加巯基己醇和巯基十一烷酸后，在乙醇中反应1小时。
[0058]
(2)利用离心机去除未反应物。(sam
‑
agngs)
[0059]1‑
4.在银纳米裂隙壳表面导入选择性结合于aβ40或aβ42的抗体
[0060]
(1)在合成的sam
‑
agngs中添加edc/nhs(1
‑
乙基
‑3‑
(3
‑
二甲氨基丙基)碳二亚胺/n
‑
羟基琥珀酰亚胺)偶联剂后，在ph 6.0 100mm pbs溶液中反应30分钟。
[0061]
(2)利用离心机去除未反应物。
[0062]
(3)加入与aβ40或aβ42选择性地反应的抗体(1mg/ml 10l)并搅拌，在ph 7.4 100mm pbs缓冲液中反应2小时。
[0063]
(4)利用离心机去除未反应物后，分散于1％牛血清白蛋白溶液并冷藏保管。
[0064]
实施例2.对阿尔茨海默病(ad)生物标志物2种(aβ40、aβ42)的检测
[0065]
图2是显示对阿尔茨海默病(ad)生物标志物2种(aβ、aβ)的检测结果的图((a)是对于aβ检测的各浓度的微阵列映射图像，(b)是显示出对于(a)所示区域的agngs拉曼信号的图表，(c)是对于(a)的各浓度的信号的图表，(d)是对于aβ检测的各浓度的微阵列映射图像，(e)是对于(d)所示区域的agngs的拉曼信号，(f)是对于(d)的各浓度的信号的图表)。
[0066]
如果参照图2可以确认，可以通过基于agngs的sers免疫测量法而以浓度依赖方式检测aβ40、aβ42。
[0067]
实施例3.基于agngs的sers免疫反应的特异性检验
[0068]
图3是显示基于agngs的sers免疫反应的特异性检验的图。
[0069]
图3(a)是以对各靶标的特异性抗体改性的agngs只针对各靶标特异性地进行反应的靶标生物标志物，进行免疫反应并显示出拉曼信号。图3(b)是aβ42浓度固定为10ng/ml、aβ40的浓度变为0～10ng/ml时，针对两种生物标志物的混合溶液，基于agngs的sers免疫测量法显示出反映两种生物标志物的浓度变化的拉曼信号倾斜性。另外，如果参照图3(c)，当aβ40和aβ42按x轴的比率存在时，基于agngs的sers免疫测量法显示出反映两种生物标志物的浓度变化的拉曼信号倾向性。通过相应结果可以证明，基于agngs的sers免疫测量法可以针对多重生物标志物特异性地反应而无交叉反应。
[0070]
实施例4.血液样本中的多重检测能力确认
[0071]
图4是显示血液样本中的多重检测能力的图。如果参照图4，在aβ40和aβ42以0～1000ng/ml浓度存在的人血清样本中，当通过基于agngs的sers免疫测量法检测aβ40和aβ42时，显示出反映两种生物标志物的浓度变化的拉曼信号倾向性。由此可知，即使在复杂构成
的血液样本中，也可以特异性地检测aβ40和aβ42。
[0072]
实施例5.在临床样本中利用aβ40与aβ42之比(ratio)的诊断
[0073]
从博拉梅医院获供正常人和被确诊为轻度认知障碍或阿尔茨海默的患者的血清样本并利用。
[0074]
图5是显示临床样本中的aβ40与aβ42的检测结果的图。如果参照图5，利用基于agngs的sers免疫测量法，检测阿尔茨海默病患者血清中存在的aβ40与aβ42，计算两种生物标志物的浓度比率，结果可知，就轻度认知障碍患者样本而言，所述比率存在于1.1～2.5范围内，就正常人而言，具有不足1.1的值，就阿尔茨海默病而言，表现出超过2.5的值。从所述结果可知，可以区分并诊断阿尔茨海默病患者与轻度认知障碍患者(mci)及普通人(nc)。
[0075]
以上详细记述了本发明内容的特定的部分，这种具体记述只是优选的实施形态，并非由此限制本发明的范围，这是本行业的技术人员不言而喻的。因此，本发明的实质性范围由附带的权利要求项及其等价物所定义。