一种银杏叶滴丸的质量控制方法与流程

1.本发明涉及中药质量控制领域，尤其涉及一种银杏叶滴丸的质量控制方法。


背景技术：

2.中医发挥疗效的物质基础是中药中的有效成分，而一味中药中的有效成分可能是几种，也可能是几十种甚至更多。目前，中药质量的评价和质量控制方法一般是先解决复杂样品的组分分析，才能建立其质量标准。
3.现有技术中，常用的中药质量控制方法包括高效液相色谱(hplc)、气相色谱(gc)、毛细管电泳(ce)等多种色谱联用技术，利用其不同的分离效果，再结合计算机技术和色谱专家系统，将其运用于中药质量的检验中，对中药样品的成分进行分离，再使用红外光谱、质谱
‑
质谱的联用技术，就可以完成对中药中有效成分的分离和测定，从而实现对中药的质量评价和质量控制。
4.例如，公开号为cn111983106a的中国专利文献公开了一种化湿败毒组合物的质量控制方法，包括：(1)采用高效液相色谱法测定化湿败毒组合物中总蒽醌含量、游离蒽醌含量、盐酸麻黄碱含量、盐酸伪麻黄碱含量和芍药苷含量，并计算结合蒽醌含量；其中，结合蒽醌含量＝总蒽醌含量
‑
游离蒽醌含量；(2)采用薄层色谱对麻黄、甘草、厚朴进行鉴别。
5.例如，公开号为cn111879884a的中国专利文献公开了一种中药制剂的质量控制方法，采用hplc特征图谱对温经汤中的化学成分种类及数量进行有效表征，并同时测定温经汤制剂中芍药苷、甘草苷、β
‑
蜕皮甾酮、阿魏酸的含量。
6.但是，中药本身具有多成分、多靶点，批次间成分差异大，整体发挥作用等特点，因此以检测化学成分为主的指标性成分检测方法无法较好地反映中药的安全性、有效性以及整体质量，同时也达不到更好的质量控制效果，缺乏有效的质量控制方法制约了中药的发展。
7.银杏是我国古老的树种，具有很高的药用价值，银杏叶提取物为干燥的银杏叶经加工制成的，具有改善血液流变学、降血脂、抗血小板凝集、保护神经等作用，具有良好的市场应用前景。目前，2020版药典对银杏叶提取物的质量控制标准为黄酮醇苷≥24％，银杏叶内酯≥6％，银杏叶酸≤5ppm，而对于剩余的70％的成分并没有加以控制，该方法存在一定的局限性。
8.基于银杏叶提取物为原料的银杏叶制剂种类数量繁多，各种银杏叶制剂虽然在质量控制上均符合药典要求，由于质控方法的局限性，导致不同银杏叶制剂在临床上的疗效有所差异。例如：有团队研究发现银杏叶滴丸在神经保护方面效果强于金纳多(ad y,a p z,a j l,et al.neuroprotective effects of ginkgo biloba dropping pills in parkinson
‘
sdisease[j].journal of pharmaceutical analysis,2021,11(2):220
‑
231)。银杏叶滴丸在临床上被用来治疗高血压、心肌梗死等心血管疾病，是预防和治疗心血管疾病一线药物。为提高银杏叶滴丸的质量控制要求，达到提高银杏叶滴丸临床综合效益和区别其他银杏叶制剂，急需开发一种有效的质量控制方法。


技术实现要素：

[0009]
针对现有技术中银杏叶提取物质量控制方法的缺点，本发明提供了一种银杏叶滴丸的质量控制方法，该质量控制方法无需通过检测银杏叶中多种物质成分的含量，从整体上对银杏叶滴丸进行质量控制，比现行标准控制更全面。
[0010]
本发明的技术方案如下：
[0011]
一种银杏叶滴丸的质量控制方法，包括：通过检测银杏叶滴丸的血管紧张素转换酶(ace)活性抑制率，对银杏叶滴丸进行质量控制。
[0012]
血管紧张素转换酶ace为肾素
‑
血管紧张素系统重要的酶，是高血压、心衰、心肌梗死等心血管疾病重要靶点，还与肾功能损害、糖脂代谢异常相关。银杏叶滴丸是万邦德制药集团以银杏叶提取物为原料研制的独家剂型，其主要活性成分为银杏叶提取物，具有活血化瘀通络之功效。
[0013]
银杏叶滴丸临床应用与血管紧张素转换酶(ace)活性息息相关，有文献报道，银杏叶滴丸的原料银杏叶提取物通过抑制高血压小鼠体内的ace活性，可以治疗高血压及改善其他异常指标(ginkgo biloba extract(egb 761)normalizes hypertension in 2k,1c hypertensive rats:role of antioxidant mechanisms,ace inhibiting activity and improvement of endothelial dysfunction[j].phytomedicine,2011,18(8
–
9):641
‑
6)。前期通过相关实验发现银杏叶滴丸具有显著的ace抑制活性，且不同的银杏叶制剂ace抑制活性并不同。根据cde发布的中药生物效应检测研究技术指导原则，ace活性可以一定程度上反应银杏叶滴丸的临床疗效，通过控制银杏叶滴丸的ace抑制活性，不仅可以达到评价和控制银杏叶滴丸质量的目的，还可以用于区别其他银杏叶制剂。
[0014]
常用的ace体外检测方法主要有两种，一种是利用ace酶水解三肽hhl生成马尿酸和二肽(his
‑
leu，hl)，其中以马尿酸的生成定量，常规方法操作繁琐，易产生实验误差；另一种是ace测定酶偶联法，底物马尿酸双甘肽(hip
‑
gly
‑
gly，hgg)在ace催化下生成马尿酸和双甘肽(gly
‑
gly)，然后加入l
‑
γ
‑
谷氨酰
‑3‑
羧基
‑4‑
硝基苯胺(l
‑
γ
‑
glutamyl
‑3‑
carboxy
‑4‑
nitroanilide，ggcn)和γ
‑
谷氨酰基转移酶(γ
‑
glutamyl transferase，ggt)，催化与偶联，产生3
‑
羧基
‑4‑
硝基苯胺于410nm处有最大吸收。这两种方法在药品生产中作为质量控制的方法，均有其局限性，例如操作较为繁琐，不能同时进行多批次检测等。
[0015]
本发明的质量控制方法同样适用于其他剂型的以银杏叶提取物为主要活性成分的中药制剂。因此，本发明还提供了一种中药制剂的质量控制方法，包括：通过检测中药制剂的血管紧张素转换酶活性抑制率，对中药制剂进行质量控制；所述中药制剂的主要活性成分为银杏叶提取物。
[0016]
优选的，本发明采用共聚焦荧光探针tpe
‑
sdkp对血管紧张素转换酶活性进行检测；
[0017]
所述的共聚焦荧光探针tpe
‑
sdkp的结构如式(i)所示：
[0018][0019]
荧光成像作为一种高灵敏度、非侵入性的重要生物应用技术，可以监控生命体复杂的生理活动，如病理进化、生物学过程、药物监测等，在生物医学中得到了广泛的应用。具有聚集诱导发光(aggregation
‑
induced emission,aie)效应的荧光探针可有效地避免传统荧光材料存在的聚集态荧光减弱甚至猝灭的现象。
[0020]
本发明所采用的共聚焦荧光探针tpe
‑
sdkp可以对ace进行专属性识别，其荧光强度代表了ace活性程度，具有操作简单、准确度高、重复性好等特点。tpe
‑
sdkp探针的合成方法参考wang h,huang y,zhao x,gong w,wang y,cheng y.a novel aggregation
‑
induced emission based fluorescent probe for an angiotensin converting enzyme(ace)assay and inhibitor screening electronic supplementary information(esi).2014；5(95):1575
‑
8.
[0021]
进一步优选的，银杏叶滴丸的质量控制方法包括：
[0022]
(1)设置空白组、对照组、给药空白组、给药实验组；
[0023]
根据设置，在酶标仪孔板中分别加入相应的试剂，之后将酶标仪孔板检测体系于离心机中离心；
[0024]
空白组在酶标仪孔板中依次加入tpe
‑
sdkp的溶液、二甲亚砜(dmso)、缓冲溶液；
[0025]
对照组在酶标仪孔板中依次加入tpe
‑
sdkp的溶液、二甲亚砜(dmso)、血管紧张素转换酶溶液；
[0026]
给药空白组在酶标仪孔板中依次加入tpe
‑
sdkp的溶液、银杏叶滴丸样品溶液、血管紧张素转换酶溶液；
[0027]
给药实验组在酶标仪孔板中依次加入tpe
‑
sdkp溶液、银杏叶滴丸样品溶液、血管紧张素转换酶溶液，
[0028]
(2)将离心后的酶标仪孔板检测体系于37℃恒温孵育，孵育后向酶标仪孔板检测体系中加入zncl2工作液，继续于37℃恒温孵育；
[0029]
(3)孵育完成后在酶标仪中测定荧光强度，根据荧光强度计算银杏叶滴丸样品的血管紧张素转换酶活性抑制率，对银杏叶滴丸进行质量控制。
[0030]
所述的tpe
‑
sdkp的溶液为500μm/ml的tpe
‑
sdkp水溶液与50mm/ml的tris
‑
hcl(ph＝7.5)的混合液，二者的体积比为1：7；
[0031]
所述的缓冲溶液为50mm/ml的tris
‑
hcl(ph＝7.5)缓冲液；
[0032]
所述的银杏叶滴丸样品溶液的浓度为7.5
‑
500μg/ml；
[0033]
所述的血管紧张素转换酶溶液的浓度为100
‑
150mu/ml。
[0034]
进一步优选的，所述的银杏叶滴丸样品溶液的浓度为20
‑
500μg/ml；最优选为37.5μg/ml。
[0035]
步骤(1)中，各组中三种溶液的体积比为5
‑
10：1：1。
[0036]
步骤(2)中，zncl2工作液的浓度为5
‑
10mm，加入体积为100μl。
[0037]
优选的，步骤(3)中，通过式(ii)计算血管紧张素转换酶活性抑制率：
[0038][0039]
其中，i
给药对照组
为给药实验组的荧光强度；i
给药空白组
为给药空白组的荧光强度；i
对照组
为对照组的荧光强度；i
空白组
为空白组的荧光强度。
[0040]
优选的，步骤(3)中，酶标仪的参数设置为：激发波长为320nm；发射波长为470nm；激发带宽为20nm；发射带宽为20nm；梯度为50手动；闪光频率为400hz。
[0041]
本发明采用共聚焦荧光探针tpe
‑
sdkp对银杏叶滴丸进行ace抑制活性检测，统计对比不同批次间银杏叶滴丸ace抑制活性情况，制定出合理的ace抑制率标准，对银杏叶滴丸进行质量控制。该方法与现行标准比，无需通过检测银杏叶中多种物质成分的含量，从整体上对银杏叶滴丸进行质量控制，比现行标准控制更全面，在检测上无需通过hplc分析，仅使用酶标仪便可检测，大大缩短了检测时间，提高了生产效率，降低了生产成本。
附图说明
[0042]
图1为不同浓度银杏叶滴丸ace抑制情况图；
[0043]
图2为6批银杏叶滴丸37.5μg/ml下的ace抑制情况图。
具体实施方式
[0044]
以银杏叶滴丸为质量控制对象，对本发明的技术方案作进一步详细描述，需要指出的是，以下所述实施例旨在便于对本发明的理解，而对其不起任何限定作用。
[0045]
银杏叶滴丸是万邦德制药集团以银杏叶提取物为原料研制的独家剂型，具有活血化瘀通络之功效，具有良好的市场应用前景。
[0046]
以下实施例中，具体的实验方式如下：
[0047]
(1)tris储备液的配制：精密称取3.0285g tris粉末置于50ml容量瓶中，加入50ml超纯水溶解，充分混匀，配制成500mm的tris储备液，常温保存备用。
[0048]
(2)tris
‑
hcl溶液的配制：量取5ml体积500mm的tris储备液置于50ml离心管中，加入45ml超纯水将其浓度稀释至50mm，盐酸调节ph至7.5，现配现用。
[0049]
(3)tpe
‑
sdkp探针储备液的配制：精密称取62.5440mg tpe
‑
sdkp探针粉末置于1.5ml离心管，加入1.5ml dmso溶解，充分混匀，配制成50mm的tpe
‑
sdkp探针储备液，
‑
20℃保存备用。(tpe
‑
sdkp探针的合成方法参考wang h,huang y,zhao x,gong w,wang y,cheng y.anovel aggregation
‑
induced emission based fluorescent probe for an angiotensin converting enzyme(ace)assay and inhibitor screening electronic supplementary information(esi).2014；5(95):1575
‑
8.)
[0050]
(4)zncl2溶液的配制：精密称取40.896mg zncl2置于50ml离心管中，加入50ml超纯水溶解，充分混匀，配制成6mm的zncl2溶液，常温保存备用。
[0051]
(5)银杏叶滴丸溶液的配制：称取适量的银杏叶滴丸置于各自编号的离心管中，加入1.5ml dmso超声溶解，充分混匀，分别配制成100mg/ml的样品储备液，
‑
20℃保存备用。
[0052]
(6)ace溶液的配制：按照产品指导说明书，将ace配制成1250mu/ml溶液，分装，
‑
20
℃保存备用。
[0053]
(7)空白组：在96孔黑板中依次加入80μl混合液(500μm/ml tpe
‑
sdkp:50mm/ml tris
‑
hcl＝1:7)，10μl dmso(tris
‑
hcl稀释100倍)，10μl tris
‑
hcl(ph 7.5)缓冲液。
[0054]
(8)对照组：在96孔黑板中依次加入80μl混合液(500μm/ml tpe
‑
sdkp:50mm/ml tris
‑
hcl＝1:7)，10μl dmso(tris
‑
hcl稀释100倍)，10μl ace溶液(125mu/ml)。
[0055]
(9)给药空白组：在96孔黑板中依次加入80μl混合液(500μm/ml tpe
‑
sdkp:50mm/ml tris
‑
hcl＝1:7)，10μl样品，10μl tris
‑
hcl(ph 7.5)缓冲液。
[0056]
(10)给药对照组：在96孔黑板中依次加入80μl混合液(500μm/ml tpe
‑
sdkp:50mm/ml tris
‑
hcl＝1:7)，10μl样品，10μl ace溶液(125mu/ml)。
[0057]
(11)将96孔检测板置于离心机中，以300rpm转速离心30s；将离心后的96孔检测板体系于37℃恒温孵育2h后，以100μl/孔zncl2(6mm)工作液加入体系中继续以上条件孵育1h，最后在酶标仪中测量荧光强度。通过计算得出ace抑制率，公式如下：
[0058][0059]
(12)酶标仪参数设置：选择excitation wavelength:320nm,emission wavelength:470nm,excitation bandwidth:20nm；emission bandwidth:20nm,gain:50manual,flash frequency:400hz。
[0060]
实施例1
‑6[0061]
称取适量的银杏叶滴丸分别置于各自编号的离心管中，加入1.5ml dmso超声溶解，充分混匀，配制成100mg/ml的样品储备液，将储备液稀释至一定浓度后加入黑色96孔板中。实施例1
‑
6中，银杏叶滴丸溶液的浓度分别为7.5、18.75、37.5、93.75、187.5、375μg/ml，分别测定不同浓度银杏叶滴丸溶液的ace抑制率，结果如表1和图1所示。
[0062]
表1不同浓度银杏叶滴丸ace抑制活性情况
[0063][0064]
实验结果如表1所示，银杏叶滴丸ace抑制活性随着银杏叶滴丸浓度增加而增强，说明具有良好的量效关系，tpe
‑
sdkp探针可以检测银杏叶滴丸的ace抑制活性。通过graphad计算银杏叶滴丸的ic
50
值为22.98μg/ml，若换算为提取物浓度，则ic
50
值为6.13μg/ml，说明银杏叶滴丸具有良好的ace活性抑制作用。
[0065]
重复性验证
[0066]
称取银杏叶滴丸15粒分别置于离心管中，加入9ml dmso超声溶解，充分混匀，将储备液稀释至一定浓度后加入黑色96孔板中，使得板中的浓度为37.5μg/ml。相同条件下重复6次实验，结果如表2和图2所示。
[0067]
表2银杏叶滴丸6次ace活性检测情况
[0068][0069]
通过对表2的数据进行计算，rsd＝2.35％，说明采用ace探针对银杏叶滴丸进行活性检测，重复性较好。
[0070]
不同批次银杏叶滴丸ace抑制率测定
[0071]
称取不同批号的银杏叶滴丸15粒分别置于各自编号的离心管中，加入9ml dmso超声溶解，充分混匀，将储备液稀释至一定浓度后加入黑色96孔板中，使得板中的浓度为37.5μg/ml。相同条件下测定其ace抑制活性，结果如表3所示。
[0072]
表3不同批次银杏叶滴丸ace抑制活性
[0073][0074][0075]
从表3中可知，本次采用的6批银杏叶滴丸37.5μg/ml浓度下ace抑制率在64％～76％之间。
[0076]
其他银杏叶制剂ace抑制率测定
[0077]
取不同银杏叶制剂，除去外包以后碾磨成细粉，加入适量dmso超声溶解，充分混匀，将储备液稀释至一定浓度后加入黑色96孔板中，使得板中的提取物浓度为10μg/ml，相同条件下测定其ace抑制活性，结果如表4所示
[0078]
表4其他银杏叶制剂ace抑制活性
[0079][0080]
从表4中可知道，各银杏叶制剂在提取物浓度为10μg/ml时，其ace抑制活性均在50％
‑
80％。可以通过该方法对其他银杏叶制剂进行质量控制。
[0081]
以上所述的实施例对本发明的技术方案和有益效果进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充和等同替换等，均应包含在本发明的保护范围之内。