专利名称：补骨脂素与异补骨脂素的制造方法
技术领域：
本发明涉及一种补骨脂素与异补骨脂素的制造方法，它以豆科植物补骨脂为原料来制得的，属中草药化学药物制造领域。
对补骨脂的研究，国内外一般集中在对心血管系统的影响，抗菌作用，治疗白癜疯的作用，对平滑肌的兴奋作用以及雌激素样作用等。但是，作为中草药的补骨脂素与异补骨脂素是否可用作抗肿瘤药物，其抗癌的机理和实践从未有人作过深入研究。另外对于补骨脂素与异补骨脂素的提取制造也需采用一种新的工艺方法。
本发明对补骨脂的化学成分及药理活性进行了深入研究。从补骨脂中分离得到两种化合物补骨脂素与异补骨脂素，并对这两种化合物进行了抗癌活性研究，探讨其治疗胃癌的可行性，发现它们有很好的抑制胃癌细胞的作用。为开发一种新的抗肿瘤药物提供了可能性。
本发明的目的是通过以下手段和工艺措施来达到的。
本发明的一种补骨脂素与异补骨脂素的制造方法如下本发明以豆科植物补骨脂为原料，首先将补骨脂经粉碎后所得之粉末用氯仿在室温下浸提三次，将所得浸提液进行真空减压，回收溶剂，得氯仿提取物浸膏。将氯仿提取物加硅胶并搅拌均匀；然后在低温下烘干、研细，分批上色谱柱分离提取。以不同比例的石油醚—乙酸乙酯混合溶液梯度洗脱，将洗脱液在旋转蒸发器上真空蒸馏到十分之一；静置一段时间，结晶而得两种化合物补骨脂素与异补骨脂素。
补骨脂素的分子式为C11H6O3，其结构式为
它为白色针状晶体，熔点162～163℃；UVλmaxnm(MeOH)208.3、244.7、289.7、327.9；溶于乙醇、氯仿，微溶于水、乙醚和石油醚。
异补骨脂素C11H6O3，为同分异构体。其结构式为 它为白色絮状晶体，熔点137～138℃，UVλmaxnm(MeOH)203.1、246.3、297.7；溶于乙醇、乙醚，微溶于石油醚。
补骨脂素与异补骨脂素对人的胃癌细胞具有较好的抑制作用。
本发明通过以下实验方法对上述效果获得了证实。一、对人胃癌细胞BGC-823的细胞毒作用的实验将以对数生长的胃癌细胞BGC-823接种在含15％小牛血清的RPMI 1640培养液中，置37℃，5％二氧化碳、饱合湿度下的培养箱内培养，以EDTA(乙二胺四乙酸)-胰酶混合溶液消化传代，以100μL(1.0×105/mL)剂量浓度接种在96孔平板上，孵育24小时后，倾去培养液，将不同浓度补骨脂素(25、12.5、6.25、3.13、1.56、0.78μg/mL)、和不同浓度的异补骨脂素(200、100、50、25、12.5μg/mL)分别加入孔内，每一浓度加3孔，每孔100μL，对照组加同量培养液，孵育24小时后，弃去培养液.随后每孔加入100μL 0.2％MTT的D-Hank’s液，37℃继续孵育4h，吸去上清，每孔加碱化二甲基亚砜(DMSO)100μL，37℃温育30分钟，并不时轻轻振荡。在酶联免疫仪490nm波长处检测各孔吸光度(A值)，按公式计算其抑瘤率。抑瘤率(％)＝[(对照组A值-实验组A值)/对照组A值]×100。
结果表明(见表2.1，表2.2)补骨脂素与异补骨脂素对人胃癌细胞BGC-823有显著的生长抑制作用，MTT试验结果显示，随着药物浓度加大，抑制率也随之增高，与对照组相比均有显著性差异。说明补骨脂素与异补骨脂素对胃癌细胞BGC-823的抑制作用与药物浓度呈正相关，其IC50(半数抑制浓度)分别为5.82μg/mL和148.8μg/mL。
表2.1 补骨脂素对人胃癌细胞BGC-823的细胞毒作用
表2.2 和厚朴酚对人胃癌细胞BGC-823的细胞毒作用
二、细胞凋亡光镜观察将细胞接种于位于24孔培养板中有盖玻片小条内，培养24小时后，于次日加入相应的药物，试验设不加药物作为对照组，作用48小时后，于OLYMPUS显微镜下观察和拍照。细胞形态学观察表明，对照组细胞生长旺盛，呈纤维状贴壁生长。给药组细胞生长明显受抑制，细胞变圆，已凋亡。
权利要求
1.一种补骨脂素与异补骨脂素的制造方法，其特征是以豆科植物补骨脂为原料，首先将补骨脂经粉碎后所得之粉末用氯仿在室温下浸提三次，将所得浸提液进行真空减压，回收溶剂，得氯仿提取物浸膏；将氯仿提取物加硅胶并搅拌均匀；然后在低温下烘干、研细，分批上色谱柱分离提取；以不同比例的石油醚—乙酸乙酯混合溶液梯度洗脱，将洗脱液在旋转蒸发器上真空蒸馏到十分之一；静置一段时间，结晶而得两种化合物补骨脂素与异补骨脂素。
2.根据权利要求1所述的一种补骨脂素与异补骨脂素的制造方法，其特征在于所述的氯仿浸提液是在60℃温度和0.1MPa压力下进行真空减压，回收溶剂的。
3.根据权利要求1所述的一种补骨脂素与异补骨脂素的制造方法，其特征在于所述的色谱柱为硅胶400克、200-300目。
4.根据权利要求1所述的一种补骨脂素与异补骨脂素的制造方法，其特征在于所用的洗脱液的石油醚与乙酸乙酯的比例为8∶2时，分离得化合物补骨脂素和异补骨脂素。
5.根据权利要求1的制造方法所制得的产品补骨脂素与异补骨脂素的用途是作为一种抑制胃癌细胞增生的药物。
全文摘要
本发明提供了一种补骨脂素与异补骨脂素的制造方法，其特征是以豆科植物补骨脂为原料，首先将补骨脂经粉碎后所得之粉末用氯仿在室温下浸提三次，将所得浸提液进行真空减压，回收溶剂，得氯仿提取物浸膏；将该氯仿提取物加硅胶并搅拌均匀；然后在低温下烘干、研细，分批上色谱柱分离提取；以不同比例的石油醚—乙酸乙酯混合溶液梯度洗脱，将洗脱液在旋转蒸发器上真空蒸馏到十分之一；静置一段时间，结晶而得两种化合物补骨脂素与异补骨脂素。该物质经研究并通过实验证实具有抑制胃癌细胞的作用，可用于制造防治胃癌的药物。
文档编号C07D493/00GK1446814SQ03115689
公开日2003年10月8日 申请日期2003年3月7日 优先权日2003年3月7日
发明者翁新楚, 吴侯, 郭江宁 申请人:上海大学
技术领域：
本发明涉及一种补骨脂素与异补骨脂素的制造方法，它以豆科植物补骨脂为原料来制得的，属中草药化学药物制造领域。
对补骨脂的研究，国内外一般集中在对心血管系统的影响，抗菌作用，治疗白癜疯的作用，对平滑肌的兴奋作用以及雌激素样作用等。但是，作为中草药的补骨脂素与异补骨脂素是否可用作抗肿瘤药物，其抗癌的机理和实践从未有人作过深入研究。另外对于补骨脂素与异补骨脂素的提取制造也需采用一种新的工艺方法。
本发明对补骨脂的化学成分及药理活性进行了深入研究。从补骨脂中分离得到两种化合物补骨脂素与异补骨脂素，并对这两种化合物进行了抗癌活性研究，探讨其治疗胃癌的可行性，发现它们有很好的抑制胃癌细胞的作用。为开发一种新的抗肿瘤药物提供了可能性。
本发明的目的是通过以下手段和工艺措施来达到的。
本发明的一种补骨脂素与异补骨脂素的制造方法如下本发明以豆科植物补骨脂为原料，首先将补骨脂经粉碎后所得之粉末用氯仿在室温下浸提三次，将所得浸提液进行真空减压，回收溶剂，得氯仿提取物浸膏。将氯仿提取物加硅胶并搅拌均匀；然后在低温下烘干、研细，分批上色谱柱分离提取。以不同比例的石油醚—乙酸乙酯混合溶液梯度洗脱，将洗脱液在旋转蒸发器上真空蒸馏到十分之一；静置一段时间，结晶而得两种化合物补骨脂素与异补骨脂素。
补骨脂素的分子式为C11H6O3，其结构式为
它为白色针状晶体，熔点162～163℃；UVλmaxnm(MeOH)208.3、244.7、289.7、327.9；溶于乙醇、氯仿，微溶于水、乙醚和石油醚。
异补骨脂素C11H6O3，为同分异构体。其结构式为 它为白色絮状晶体，熔点137～138℃，UVλmaxnm(MeOH)203.1、246.3、297.7；溶于乙醇、乙醚，微溶于石油醚。
补骨脂素与异补骨脂素对人的胃癌细胞具有较好的抑制作用。
本发明通过以下实验方法对上述效果获得了证实。一、对人胃癌细胞BGC-823的细胞毒作用的实验将以对数生长的胃癌细胞BGC-823接种在含15％小牛血清的RPMI 1640培养液中，置37℃，5％二氧化碳、饱合湿度下的培养箱内培养，以EDTA(乙二胺四乙酸)-胰酶混合溶液消化传代，以100μL(1.0×105/mL)剂量浓度接种在96孔平板上，孵育24小时后，倾去培养液，将不同浓度补骨脂素(25、12.5、6.25、3.13、1.56、0.78μg/mL)、和不同浓度的异补骨脂素(200、100、50、25、12.5μg/mL)分别加入孔内，每一浓度加3孔，每孔100μL，对照组加同量培养液，孵育24小时后，弃去培养液.随后每孔加入100μL 0.2％MTT的D-Hank’s液，37℃继续孵育4h，吸去上清，每孔加碱化二甲基亚砜(DMSO)100μL，37℃温育30分钟，并不时轻轻振荡。在酶联免疫仪490nm波长处检测各孔吸光度(A值)，按公式计算其抑瘤率。抑瘤率(％)＝[(对照组A值-实验组A值)/对照组A值]×100。
结果表明(见表2.1，表2.2)补骨脂素与异补骨脂素对人胃癌细胞BGC-823有显著的生长抑制作用，MTT试验结果显示，随着药物浓度加大，抑制率也随之增高，与对照组相比均有显著性差异。说明补骨脂素与异补骨脂素对胃癌细胞BGC-823的抑制作用与药物浓度呈正相关，其IC50(半数抑制浓度)分别为5.82μg/mL和148.8μg/mL。
表2.1 补骨脂素对人胃癌细胞BGC-823的细胞毒作用
表2.2 和厚朴酚对人胃癌细胞BGC-823的细胞毒作用
二、细胞凋亡光镜观察将细胞接种于位于24孔培养板中有盖玻片小条内，培养24小时后，于次日加入相应的药物，试验设不加药物作为对照组，作用48小时后，于OLYMPUS显微镜下观察和拍照。细胞形态学观察表明，对照组细胞生长旺盛，呈纤维状贴壁生长。给药组细胞生长明显受抑制，细胞变圆，已凋亡。
权利要求
1.一种补骨脂素与异补骨脂素的制造方法，其特征是以豆科植物补骨脂为原料，首先将补骨脂经粉碎后所得之粉末用氯仿在室温下浸提三次，将所得浸提液进行真空减压，回收溶剂，得氯仿提取物浸膏；将氯仿提取物加硅胶并搅拌均匀；然后在低温下烘干、研细，分批上色谱柱分离提取；以不同比例的石油醚—乙酸乙酯混合溶液梯度洗脱，将洗脱液在旋转蒸发器上真空蒸馏到十分之一；静置一段时间，结晶而得两种化合物补骨脂素与异补骨脂素。
2.根据权利要求1所述的一种补骨脂素与异补骨脂素的制造方法，其特征在于所述的氯仿浸提液是在60℃温度和0.1MPa压力下进行真空减压，回收溶剂的。
3.根据权利要求1所述的一种补骨脂素与异补骨脂素的制造方法，其特征在于所述的色谱柱为硅胶400克、200-300目。
4.根据权利要求1所述的一种补骨脂素与异补骨脂素的制造方法，其特征在于所用的洗脱液的石油醚与乙酸乙酯的比例为8∶2时，分离得化合物补骨脂素和异补骨脂素。
5.根据权利要求1的制造方法所制得的产品补骨脂素与异补骨脂素的用途是作为一种抑制胃癌细胞增生的药物。
全文摘要
本发明提供了一种补骨脂素与异补骨脂素的制造方法，其特征是以豆科植物补骨脂为原料，首先将补骨脂经粉碎后所得之粉末用氯仿在室温下浸提三次，将所得浸提液进行真空减压，回收溶剂，得氯仿提取物浸膏；将该氯仿提取物加硅胶并搅拌均匀；然后在低温下烘干、研细，分批上色谱柱分离提取；以不同比例的石油醚—乙酸乙酯混合溶液梯度洗脱，将洗脱液在旋转蒸发器上真空蒸馏到十分之一；静置一段时间，结晶而得两种化合物补骨脂素与异补骨脂素。该物质经研究并通过实验证实具有抑制胃癌细胞的作用，可用于制造防治胃癌的药物。
文档编号C07D493/00GK1446814SQ03115689
公开日2003年10月8日 申请日期2003年3月7日 优先权日2003年3月7日
发明者翁新楚, 吴侯, 郭江宁 申请人:上海大学
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