专利名称：疱疹病毒核苷酸还原酶的抑制剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及具有抗病毒特性的肽衍生物以及使用此衍生物治疗病毒感染的方法。更特别地，本发明涉及显示出抗疱疹病毒活性的肽衍生物(下文称为“肽”)，含有此肽的药物组合物以及使用此肽抑制疱疹病毒的复制并治疗疱疹病毒感染的方法。
疱疹病毒给人和动物带来的疾病范围很广，例如单纯性疱疹病毒1型和2型(HSV-1和HSV-2)可分别引起唇疱疹和生殖器损害；水痘带状疱疹病毒(VZV)会导致水痘和带状疱疹；Epstein-Barr病毒(EBV)会导致传染性单核细胞增多症。
在过去的二十年间，研究人员在研究新的治疗剂以治疗疱疹病毒感染的过程中，对已知为嘌呤和嘧啶核苷类似物的一类化合物倾注了最多的注意力。结果已将几种核苷类似物开发成抗病毒剂。至今最成功的是无环鸟苷，它是治疗人生殖器疱疹病毒感染的首选药物。
然而，虽然有一些重大进展，对治疗疱疹病毒感染的有效、安全的治疗剂的需要继续存在。
为评论此领域最新的治疗剂，可参看M.C.Nahata“抗病毒药物药物动力学，副作用和治疗作用”，J.Pharm.Technol.，3，100(1987)。
本申请公开了一组具有抗疱疹病毒活性的肽衍生物，这些肽有选择地抗疱疹病毒的作用，结合宽限度的安全性使此肽成为对抗疱疹病毒感染的合乎需要的药剂。
下列参考文献公开了与抗疱疹病毒活性相关的肽或肽衍生物B.M.Dutia等，Nature，321，439(1986)，E.A.Cohen等，Nature，321，441(1986)，J.H.Subak-Sharpe等，英国专利申请2185024，于1987年7月8日公布，P.Gaudreau等，J.Biol.Chem.，262，12413(1987)，E.A.Cohen等，美国专利4,795,740，1989年1月3日，R.Freidinger等，美国专利4,814,432，1989年3月21日，V.M.Garskey等，美国专利4,837,304，1989年6月6日，R.Colonno等，美国专利4,845,195，1989年7月4日，P.Gaudreau等，J.Med.Chem.，33，723(1990)，J.Adams等，欧洲专利申请408,973，公布于1991年1月23日，P.L.Beaulieu等，欧洲专利申请411,332，公布于1991年2月6日，J.Adams等，欧洲专利申请411,333，公布于1991年2月6日，J.Adams等，欧洲专利申请411,334，公布于1991年2月6日，R.L.Tolman等，欧洲专利申请412,595，公布于1991年2月13日，W.T.Ashton等，欧洲专利申请438,873，公布于1991年7月31日，P.L.Beaulieu等，欧洲专利申请461,546，公布于1991年12月18日，P.Gaudreau等，J.Med.Chem.，35，346(1992)，R.Deziel和Y.Guindon，加拿大专利申请2,033,488，公布于1992年7月1日以及L.L.Chang等，Biorganic & Medicinal ChemistryLetters，2，1207(1992)。
通过特征结构和生物学上的差异可将上述报告中有关的肽与本申请的肽区分开来。
下文中所用缩写和符号在本申请“发明细节”这一节中有限定。
本发明的肽或其可用于治疗的盐由式1表示A-B-D-NHCH{CH2C(O)R1}C(O)-NHCH{CR2(R3)C(O)OH}C(O)-E1其中A是双取代的低级链烷酰基，其中每个取代基分别选自包括苯基和单取代苯基的一组基团，其中该单取代基选自低级烷基、卤基、羟基和低级烷氧基；B是N(CH3)CHR4C(O)其中R4是低级烷基；D是NH-CHR5C(O)其中R5是低级烷基或被羧基、羟基、巯基或苄氧基单取代的低级烷基；R1是低级烷基、低级环烷基、{1-(低级烷基)-(低级环烷基)}，或NR6R7其中R6是氢或低级烷基而R7是低级烷基，或者R6和R7与它们共用的氮原子一起形成1-吡咯烷基(Pyrrolidino)、哌啶子基(Piperidino)、吗啉代(morpholino)或4-甲基1-哌嗪基(4-methylpiperazino)；R2是氢或低级烷基而R3是低级烷基，或R2和R3与它们共用的碳原子一起形成低级环烷基；而E是NHR8其中R8是(4-9C)烷基；低级环烷基；被低级烷基或(低级烷基)-(低级环烷基)单取代或双取代的低级环烷基；或E是NHCH(R9)-Z其中R9是(4-9C)烷基、低级环烷基或(低级环烷基)-(低级烷基)而Z是CH2OH、C(O)OH、C(O)NH2或C(O)OR10其中R10是低级烷基；一组优选的本发明肽或其可用于治疗的盐由式1表示，其中A是被苯基、4-(低级烷基)苯基、4-卤苯基或4-(低级烷氧基)苯基双取代的低级烷酰基；B是(N-Me)Val、(N-Me)Ile或(N-Me)Tbg；D是(S)-2-氨基-3-羟基-3-甲基丁酸或(R)-2-氨基-3-巯基-3-甲基丁酸的氨基酸残基或者是选自Val、Ile和Tbg的氨基酸残基；R1是低级烷基、低级环烷基、{1-(低级烷基)-(低级环烷基)}、N，N-二甲基氨基、N，N-二乙基氨基、1-吡咯烷基或吗啉代；R2和R3如上文所定义；而E是NHR8其中R8是(4-9C)烷基；低级环烷基；被低级烷基单取代或双取代的低级环烷基；或(低级烷基)-(低级环烷基)；或者E是NHCH(R9)-Z其中R9是(4-9C)烷基或(低级环烷基)甲基而Z如上文所定义；一组更优选的肽或其可用于治疗的盐由式1表示，其中A是2-(苯甲基)-3-苯丙酰基、2-{(4-氟苯基)-甲基}-3-(4-氟苯基)丙酰基、2-{(4-甲氧苯基)甲基}-3-苯丙酰基或2-{(4-甲氧苯基)甲基}-3-(4-甲氧苯基)丙酰基；B是(N-Me)-Val或(N-Me)-Ile；D是Val、Ile或Tbg；R1是1-甲基乙基、1，1-二甲基乙基、1，1-二甲基丙基、环丁基、环戊基、环己基、1-甲基环戊基、N，N-二甲基氨基、N，N-二乙基氨基、1-吡咯烷基或吗啉代；R2是氢而R3是甲基、乙基、1-甲基乙基、1，1-二甲基乙基或丙基，承载R2和R3的碳原子是(R)-构型，或者R2和R3各自独立地是甲基或乙基，或者R2和R3与它们共用的碳原子一起形成环丁基、环戊基或环己基；而E是NHR8其中R8是2，2-二甲基丙基、1(R)2，2-三甲基丙基、1(R)-乙基-2，2-二甲基丙基、2，2-二甲基丁基、3，3-二甲基丁基、1(R)，2，2-三甲基丁基、1(R)，3，3-三甲基丁基、1(R)-乙基-3，3-二甲基或环己基甲基；或者E是NHCH(R9)-Z，其中承载R9的碳原子是(S)-构型，R9是1，1-二甲基乙基、1-甲基丙基、2-甲基丙基、2，2-二甲基丙基或环己基甲基而Z是CH2OH、C(O)OH、C(O)NH2或C(O)OR10其中R10是甲基、乙基或丙基；一组最优选的肽或其可用于治疗的盐由式1表示，其中A是2-(苯甲基)-3-苯丙酰基；B是(N-Me)Val；D是Tbg；R1是1-甲基乙基、1，1-二甲基乙基、1-甲基丙基、1，1-二甲基丙基、2，2-二甲基丙基、环丁基、环戊基、环己基、1-甲基环戊基、1-吡咯烷基或吗啉代；R2是氢而R3是甲基、乙基、1-甲基乙基或丙基，承载R2和R3的碳原子是(R)-构型，或者R2和R3各自独立地是甲基或乙基，或者R2和R3与它们共用的碳原子一起形成环丁基、环戊基或环己基；而E是NHR8其中R8是2，2-二甲基丙基、1(R)，2，2-三甲基丙基、1(R)-乙基-2，2-二甲基丙基、2，2-二甲基丁基或1(R)-乙基-3，3-二甲基丁基，或者E是NHCH(R9)-Z，其中承载R9的碳原子是(S)-构型，R9是2，2-二甲基丙基而Z是CH2OH、C(O)OH、C(O)NH2或C(O)OR10其中R10是甲基、乙基或丙基。
包括在本发明范围中的是含有抗疱疹病毒有效量的式1所示的肽或其可用于治疗的盐的药物组合物以及可药用或可兽医用载体。
还包括在本发明范围中的是含有式1所示的肽或其可用于治疗的盐的化妆品组合物以及适于表面施用的生理上可接受的载体。
本发明重要的一个方面包括通过给哺乳动物施用抗疱疹病毒有效剂量的式1所示的肽或其可用于治疗的盐以治疗哺乳动物疱疹病毒感染的方法。
本发明另一个重要的方面包括通过将该病毒与疱疹病毒核苷酸还原酶抑制剂量的式1所示的肽或其可用于治疗的盐接触以抑制疱疹病毒复制的方法。
另一个重要方面包括通过给哺乳动物联合施用抗疱疹病毒有效剂量的式1所示的肽或其可用于治疗的盐以及抗病毒的核苷类似物以治疗疱疹病毒感染的方法。含有此联合的药物组合物也在本发明的范围中。
制备式1所示的肽的方法在下文中描述。
可选择地，式1可表示为 关于氨基酸或氨基酸衍生物的“残基”一词是指相应的α-氨基酸通过脱去羧基上的羟基和α-氨基上的一个氢而得到的基团。
通常这里用来标明氨基酸和保护基团的缩写是根据生物化学命名IUPACIUB委员会的建议，见European Journal of Biochemistry138，9(1984)。例如Val、Ile、Asp和Leu分别表示L-缬氨酸、L-异亮氨酸、L-天冬氨酸和L-亮氨酸残基。
存在于式1肽的主要直链轴(即，主链)中的不对称碳原子。排除末端基团A和(E的)Z、但包括承载“R9”的碳原子(当E在文中被定义为NHCH(R9)-Z时)，具有S构型。
存在于氨基酸或衍生的氨基酸残基侧链的不对称碳原子、末端基团A以及当E如本文定义表示为NHR8时的末端基团E的不对称碳原子可以是S或R构型。
符号“Tbg”表示(S)-2-氨基-3，3-二甲基丁酸的氨基酸残基。符号“γMeleu”表示(S)-2-氨基-4，4-二甲基戊酸的氨基酸残基。符号“γMeleucinol”表示从α-氨基上脱去一个氢后的(S)-2-氨基-4，4-二甲基戊醇。
本文所用的另一些符号是(N-Me)Val是(S)-3-甲基-2-(甲基氨基)-丁酸的残基；(N-Me)Ile是(S)-3-甲基-2-(甲基氨基)-戊酸的残基；(N-Me)Tbg是(S)-2-(甲基氨基)-3，3-二甲基丁酸的残基；Asp(cyBu)是(S)-α-氨基-1-羧基环丁烷乙酸的残基；Asp(cyPn)是(S)-α-氨基-1-羧基环戊烷乙酸的残基；而Asp{(R)-Me}是3-(R)-甲基-L-天冬氨酸的残基(即，{S-(R*，S*)}-2-氨基-3-甲基丁二酸)。
本文所用的“卤基”一词是指选自溴、氯、氟或碘的卤基。
本文所用的“低级烷酰基”是指含有2至6个碳原子的直链1-氧代烷基(1-oxoalkyl)或者含有4至6个碳原子的支链1-氧代烷基；例如，乙酰基、丙酰基(1-氧代丙烷)和2-甲基-1-氧代丙烷。
本文所用的“(4-9C)烷基”一词是指含有4至9个碳原子的直链和支链烷基，包括例如1-甲基丙基、2-甲基丙基、2，2-二甲基丙基、1，2，2-三甲基丙基、3，3-二甲基丁基、1-乙基-2，2-二甲基-丁基和4，4-二甲基戊基。
本文所用的“低级烷基”一词，无论是单独的或与其它基团联合，都是指含有1到6个碳原子的直链烷基和含有3至6个碳原子的支链烷基，包括甲基、乙基、丙基、丁基、己基、1-甲基乙基、1-甲基丙基、2-甲基丙基和1，1-二甲基乙基。
本文所用的{1-(低级烷基)-(低级环烷基)}一词是指在位置1处带有低级烷基取代基的低级环烷基；例如1-乙基环丙基、1-丙基环戊基和1-丙基环己基。
本文所用的“低级环烷基”一词，无论是单独的或是与其它基团联合，都是指含有3至6个碳原子的饱和环烃基，包括环丙基、环丁基、环戊基和环己基。
本文所用的“低级烷氧基”一词是指含有1至4个碳原子的直链烷氧基和含有3至4个碳原子的支链烷氧基，包括甲氧基、乙氧基、丙氧基、1-甲基乙氧基、丁氧基和1，1-二甲基乙氧基，后一基团即通常所知的叔丁氧基。
本文所用的“可药用载体”或“可兽医用载体”是指无毒的、通常为活性成分的惰性赋形剂，它对该成分不造成不利影响。
本文所用的“生理上可接受的载体”一词是指含一种或多种无毒赋形剂的可接受的化妆品赋形剂，它不与其中所含的有效成分反应，或不会降低有效成分的效能。
本文所用的“可兽医用载体”是指含有一种或多种无毒药用可接受赋形剂、供给家养动物施用药物的生理上可接受的赋形剂，它不与药物反应或不降低药物的效能。
“有效剂量”一词是指预定的抗病毒剂的抗病毒剂量，即足够有效抗御体内病毒有机体的药剂用量。
本文所用的“连接剂”一词是指能够使氨基酸或肽的游离羧基与另一氨基酸或肽的游离氨基的脱水连接，从而在反应物之间形成酰胺键的试剂。同样，这种试剂可使酸和醇连接，从而形成相应的酯。此试剂通过激活羧基来促进脱水连接或使其易于发生。对这种连接剂和激活基团的描述可见于肽化学的一般课本中例如，E.Schroder和K.L.Lubke，“The Peptides”，Vol.l，AcademicPress，New York，N.Y.，1965，pp2-128，和K.D.Kopple，“Peptides and Amino acids”，W.A.Benjamin，Inc.，New York，N.Y.，1966，pp33-51。连接剂的例子有二苯基磷酰基叠氮化物、1，1-羰基二咪唑、二环己基碳化二亚胺、N-羟基丁二酰胺、或者在二环己基碳化二亚胺存在时的1-羟基-苯并三唑。很实用的连接剂是(苯并三唑-1-基氧)三(二甲基氨基)鏻六氟磷酸盐，由B.Castro等人描述，见Tetrahedron Letters，1219(1975)，也可见于D，Hudson，J.Org.Chem.，53，617(1988)，它可独自使用，或也可在1-羟基苯并三唑存在下使用。另一个很实用的连接剂是可购于市场的2-(1H-苯并三唑-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基脲四氟硼酸盐。
制备式1肽的方法可结合普通的肽的合成方法，如传统的液相连接氨基酸残基和/或肽片段的方法。这种方法的描述例见以上提及的教科书系列，E.Schroder和K.Lubke.“The PeptidesAna-lysis，Synthesis，Biology”，E.Gross等人，Eds.，AcademicPress，New York，N.Y.，1979-1987，卷1至8，和J.M.Stewart和J.D.Young“Solid Phase Peptide Synthesis”，2nd ed.，PierceChem.Co.，Rockford，IL，USA，1984。
以上提及的肽的制备方法的普遍特征是用适当的保护基团保护各个氨基酸残基或衍生的氨基酸残基(或者，如有必要，为此肽的非肽片段)的活性侧链基团，此保护基团可避免在此位点发生化学反应直至它最终离开。对氨基酸或片段的α-氨基的保护也很普遍，其时本体在羧基的位置处反应，然后通过选择性地除去α-氨基保护基团以允许此位置处后续反应的进行。另一个普遍的特征是用适当的保护基团最先保护氨基酸残基或肽片段的C-末端羧基，如果它存在即会成为肽的C-末端，保护基团会防止在此位点发生化学反应，直至所需肽的序列被合成完毕后保护基团被除去时。
因此，一般来说，式1的肽可通过逐步连接来制备，并应按照肽的氨基酸或衍生的氨基酸残基序列，以及肽的非肽片段(如主要中间体)的序列次序连接，如有必要需适当地保护，如果此保护存在，在逐步连接完成后还需除去所有的保护基团，然后就可得到式1的肽，在下文的实施例中将阐明更具体的方法。
大多数中间体以及制备它们的方法已被J.Adams等描述，见欧洲专利申请411332，于1991年2月6日公布，J.Adams等，欧洲专利申请411,334，于1991年2月6日公布，以及R.Deziel和Y.Guindon，加拿大专利申请2,033,448，于1992年7月1日公布。
制备本发明肽的N-末端所必需的被苯基或单取代的苯基双取代的低级链烷酸是已知的或可通过已知方法制备。例如，可参阅L.L.Chang等，Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters，21207(1992)，二苯乙酸已被M.R.Dolique描述，Ann.Chim.(Paris)，15(10)，425(1931)，也被F.Krollpfeiffer和A.Rosenberg描述于Chem.Ber.，69 465(1936)。
本发明的式1的肽可以药用可接受盐的形式获得。在一特定的肽中有一残基有碱的功能的情况下，此碱的盐是那些与有机酸，例如乙酸、乳酸、琥珀酸、甲磺酸或P-甲苯磺酸，以及聚合酸，如单宁酸或羧甲基纤维素生成的盐，也有与无机酸如氢卤酸，如氯化氢、或硫酸、或磷酸生成的盐。如有必要，可通过R.A.Boissonnas等，在Helv.Chim.Acta，43，1849(1960)中描述的、经过适当离子交换树脂处理的方法，将特定的酸加成盐转变为另一种酸加成盐，如无毒、可药用的盐。
在一特定的肽具有一个或多个自由羧基的情况下，这种羧基的盐是那些与钠、钾或钙阳离子，或与有机碱如三乙胺或N-甲基吗啉所生成的盐。
可通过生物化学、微生物学和生物学方法证实式1肽对单纯性疱疹病毒1型和2型(HSV-1和HSV-2)，以及其它疱疹病毒，例如水痘带状疱疹病毒(VZV)和Epstein-Barr病毒(EBV)复制的抑制作用。
在下文实施例中，描述了作为范例的式1所示的肽对疱疹病毒核苷酸还原酶的抑制作用。值得注意的是，与对疱疹病毒核苷酸还原酶的特殊抑制有关的是此肽对正常细胞复制所需的细胞核苷酸还原酶活性影响相对较小或不存在影响。
证实式1肽对病毒复制的抑制效果的方法是细胞培养技术；可参阅，如R.Deziel和Y.Guindon，加拿大专利申请2,033,488，于1992年7月1日公布。
此肽的治疗效果可用实验动物证明，例如，可使用C.R.Brandt等在J.Virol.Meth.，36,209(1992)中描述的、基于被单纯性疱疹病毒引发了眼病的鼠模型测定方法来进行。
当本发明的肽或它的可药用盐的一种被当作抗病毒剂使用时，它可以局部地或全身地施用给温血动物，如人、猪或马，其赋形剂含有一种或多种药用可接受载体，它的比例取决于此肽的可溶性和化学性质、所选择的施用途径以及标准的生物学操作。局部施用时，此肽可在含有0.1至5％，优选0.5至2％的活性剂的可药用赋形剂中成形。这种成形的形式可以是溶液、乳剂或洗剂。
全身施用时，式1肽可通过静脉、皮下或肌肉内注射中的任一种施用，其组分中含有可药用赋形剂或载体。当注射施药时，优选使用无菌水溶液载体中的肽，此溶液中还可含有其它溶质，例如缓冲液或防腐剂以及足够量的可药用盐类或葡萄糖以使此溶液等渗。
以上提到的成形所用的适当赋形剂或载体在一般的药学教科书中有所描述，例“Remington′s Pharmaceutical Sciences”，18thed，Mack Publishing Company，Easton，Penn.，1990。
此肽的剂量随施用的方式和所选择的特殊的活性剂的不同而不同，而且还随所治疗的特定宿主的不同而不同。通常治疗以小增量开始直至达到此情况下的最佳效果。一般此肽最合乎需要的施用浓度水平是一般能够保证抗病毒的效果同时不会导致任何有害或有毒的副作用。
至于局部使用，此肽以适当的外用配方施用于体表受感染的皮肤区域，例如皮肤或口腔的一部分或生殖器腔，所用剂量应足以履盖受感染的区域。治疗应该重复进行，例如每四至六小时一次直至损害被治愈。
至于全身施用，式1肽施用的剂量为每公斤体重每天10μg至500μg，尽管上述差异也会存在。然而为了达到效果，最合乎需要的使用剂量水平处于每公斤体重每天约10μg至200μg的范围之中。
本发明的另一方面包括化妆品组合物，它含有疱疹病毒预防剂量的式1肽，或者它的治疗用可接受盐，同时还含有生理上可接受的化妆品载体。配方中还可包括附加成分，例如皮肤软化剂。本发明的化妆品配方被用来预防皮肤疱疹病毒损害的发生。此配方可每晚施用于皮肤的易感区域。通常，化妆品组合物所含的肽比相应的局部使用的药物组合物中的肽要少。化妆品组合物中肽的优选的量的范围是重量的0.01％至0.2％。
尽管上述公开的配方被证明是治疗疱疹病毒感染有效而相对安全的药物，但并不排除这些配方与其它抗病毒药物或试剂一起施用会得到更好效果的可能性。这些其它的抗病毒药物或试剂包括抗病毒的核苷，例如无环鸟苷，以及抗病毒的表面活性剂或抗病毒的干扰素，如由S.S.Asculai和F.Rapp，1985年3月26日公开于美国专利4,507,281中。
有关通过同时施用来治疗疱疹病毒感染的更具体的情况是，已经发现抗病毒的核苷类似物经与式1肽联合施用，其抗疱疹病毒的活性可被协同增强，而没有相伴随的毒作用的增强。因而，本文提供了治疗哺乳动物疱疹病毒感染的药物组合物，它含有可药用或可兽医用的载体以及有效剂量的抗病毒的核苷类似物或其可药用的盐与可抑制核苷酸还原酶的式1肽或其可药用盐。
本文还提供了治疗哺乳动物疱疹病毒感染的方法。此方法包括给哺乳动物施用抗疱疹病毒有效剂量的式1化合物或其可治疗用盐以及抗病毒的核苷类似物或其可治疗用盐。
组合物中的抗病毒核苷类似物可经酶转变成(体内)疱疹病毒DNA聚合酶的病毒DNA聚合酶抑制剂，和/或其可选择的底物。抗病毒的核苷类似物可选自已知的核苷类似物。本发明优选的核苷类似物包括无环鸟苷及其类似物；例如式2的化合物及其可药用盐。 其中R11是氢、羟基或氨基，(当R11是羟基时，式2表示无环鸟苷)。
根据本发明使用的其它优选的抗病毒的核苷类似物包括阿糖腺苷(vidarabine)、碘苷(idoxuridine)、trifluridine、gangciclovir、edoxudine、brovavir、fiacitabine、penciclovir、famciclovir以及rociclovir。
“协同作用”一词用于描述上述定义的核苷类似物和式1肽组合物的抗病毒或抗疱疹病毒活性时，意味着它的抗病毒或抗疱疹病毒的作用比所预料的组合物中两个单独成分相加的作用要大。
当使用本发明的组合物治疗疱疹病毒感染时，该组合物是在含有一种或多种可药用载体的赋形剂中被施用给温血动物，例如人、猪或马，其比例取决于核苷类似物和式1肽的可溶性以及化学特性、所选择的施用途径、标准的生物学操作，以及为提供协同抗病毒效果的两种活性成分的相对量。该组合物最好局部施用，例如两种活性成分(即抗病毒的核苷类似物以及式1肽，或它们的可治疗用盐)可在可药用赋形剂中配制成溶液、乳浊液、乳剂或洗剂。这样的配方可含有占重量0.01％至1.0％的核苷类似物或其可治疗用的盐，以及可含有占重量约0.05％至1％的式1肽或其可药用盐。
在任何情况下，存在于药物组合物的两种活性剂的量要能提供协同的抗疱疹病毒的作用。
以下实施例将进一步阐明本发明，所给温度是摄氏温度，溶液百分含量或比率表示的是体积对体积的关系，除非有特别说明。核磁共振光谱由Bruker200或400MHz分光计来记录(开始时记下了400MHz的光谱)；化学移动(δ)由每百万分之几来表示。实施例中所用的缩写包括Boc叔丁基氧化羰基；Bzl苄基；EtOH乙醇；EtOAc乙酸乙酯；Et2O乙醚；HPLC高效液相色谱；MeOH甲醇；THF四氢呋喃。实施例1连接反应的一般步骤{也见R.Knorr等，Tetrahedron Letters，30，1927(1989)}将第一个反应物，即游离的胺(或其盐酸盐)溶解于CH2Cl2或乙腈中，并将该溶液冷却至4℃。在氮气下加入4当量的N-甲基吗啉于搅拌着的溶液中。20分钟后加入1当量第二反应物，即游离的羧酸以及1.05当量的连接剂。针对此目的的实用而有效的连接试剂是(苯并三唑-1-基氧)三-(二甲基氨基)鏻六氟磷酸盐或优选为2-(1H-苯并三唑-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基脲四氟硼酸盐。反应由TLC监测。反应结束后通过减压蒸发掉CH2Cl2(或乙腈)，将残留物溶于EtOAc，依次用1N柠檬酸水溶液、10％Na2CO3水溶液和盐水洗涤溶液，将有机相干燥(MgSO4)、过滤并通过减压浓缩成干品。根据Still的闪光色谱技术{W.C.Still等，J.Org.Chem.，43，2923(1978)}，将残留物经硅胶(SiO2)纯化。实施例2制备中间体H-Asp(cyPn)(Bzl)-NH-(S)-CH{CH2C(CH3)3}CH2OBzl(a)(S)-α-叠氮基-1-{(苯甲氧基)羰基}-环戊烷乙酸此化合物由M.N.Aboul-Enein等人在Pharm.Acta Helv.，55，50(1980)中描述的2-氧螺[4，4]壬烷-1，3-二酮制备得到，所根据的是使用Evan氏辅助剂的不对称叠氮化法，见D.A.Evans等，J.Amer.Chem.Soc.，112，4011(1990)。
更明确地说，将丁基锂的(469ml，750mmol)1.6M己烷溶液在氩气下滴加至手性辅助剂、4(S)-(1-甲基乙基)-2-噁唑烷酮{96.8g，750mmol，由L.N.Pridgen和J.Prol.描述于J.Org.Chem.，54，3231(1989)}于-40℃下干THF中的溶液里，将混合物在-40℃下搅拌30分钟，然后冷却至-78℃，在冷却的混合物中滴加2-氧螺[4，4]壬烷-1，3-二酮，再将此混合物在0℃下搅拌1小时。然后在混合物中加入20％(W/V)柠檬酸水溶液(600ml)。分离有机相，并用EtOAc抽提水相。结合的有机相经盐水洗涤、干燥(MgSO4)以及在减压下浓缩可得到3-{2-(1-羧基-环戊基)-1-氧代乙基)}-4-(S)-(1-甲基乙基)-2-噁唑烷酮(Oxazolidinone)的粉红色固体(300g)。
将所得到的固体(ca750mmol)溶解于乙腈中(1L)。在此溶液中加入苄基溴(128.3g，89.2ml，750mmol)和1，8-二氮杂双环[5，4，0]-十一碳-7-烯(114g，112ml，75mmol)，在氩气下搅拌此混合物16小时。减压除去挥发性物质，将残留物溶于H2O/EtOAc中。分离有机相，用10％(W/V)柠檬酸水溶液、盐水洗涤，减压干燥(MgSO4)并浓缩为干品可得到一油状物。将此油状物从己烷/EtOAc中结晶可得到相应苄基酯的白色固体(204g，73％)。
将所得化合物(70g，187mmol)于干THF(200ml)中的溶液冷却至-78℃。在15分钟的期间内在冷却的溶液中加入含有6％(W/V)异丙基苯的0.66M钾1，1，1，3，3，3-六甲基二硅氮烷(286ml，189mmol)的THF溶液。将该混合物在-78℃下搅拌45分钟。在冷的混合物中加入一份于干THF(100ml)中的2，4，6-三异丙基苯磺酰叠氮化物(67g，216mmol)溶液，2分钟后再加入冰醋酸(50ml，860mmol)。将该混合物在35-45℃下保温并搅拌1小时。减压除去挥发性物质。用己烷/EtOH(4∶1，1.7L)研制黄色残留物。用滤膜收集所得白色固体。将滤过液与SiO2混合(230-240目)。减压除去挥发性物质，将残留固体在35℃下减压干燥以除去异丙基苯。然后再将残留固体置于SiO2柱上。用己烷-EtOAc(9∶1)洗脱残留的固体和SiO2，浓缩洗脱液即可得到3-{{2(S)-叠氮基-1-氧代-2-{1-{(苯甲氧基)-羰基}环戊基}-乙基}-4(S)-(1-甲基乙基)-2-噁唑烷酮(66g，86％)。
将所得化合物(13.42g，32.4mmol)于THF/H2O(3∶1，608ml)中的溶液冷却至0℃。在冷却的溶液中加入过氧化氢/H2O(3∶7，16.3ml，518mmol的H2O2)，再加入LiOH·H2O(2.86g，68.2mmol)。
将混合物在0℃搅拌45分钟，再用10％(W/V)的亚硫酸钠水溶液(400ml)使之骤冷。加入NaHCO3(1.93g)后，减压浓缩此混合物。通过持续抽提(NaHCO3水溶液/氯仿)20小时可得到手性辅助剂。然后将水相冷却至0℃，通过加入浓HCl使之变为酸性，再用EtOAc抽提。
将抽提物用盐水洗涤，干燥(MgSO4)并减压浓缩就能得到所需化合物的白色固体(8.2g，84％)。该化合物的1H NMR(CDCl3)显示δ1.6-1.8(m，5H)，1.95-2.05(m，2H)，2.20-2.30(m，1H)，4.55(s，1H)，5.12(s，2H)和7.4(m，5H)。
该化合物用于本实施例的(C)部分。(b)NH2-(S)-CH{CH2C(CH3)3}CH2OBzL根据A.Gian-nis和K.Sandhoff，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.，28，218(1989)中的方法，用LiBH4/Me3SiCl还原H-γMeLeu-OH可得氨基醇NH2-(S)-CH{CH2C(CH3)3}CH2OH。将所得化合物(812mg，6.2mmol)与三乙胺(659mg，6.51mmol)及二叔丁基碳酸氢盐(1.42g，6.51mmol)于干THF(15ml)中的混合物在氮气下、4℃时搅拌15分钟，再于室温下搅拌4小时。减压使THF挥发。将残留物溶于EtOAc。将该溶液用10％柠檬酸水溶液、5％NaHCO3水溶液及盐水洗涤。将有机相干燥(MgSO4)，并在减压下浓缩成干品。残留物用闪光色谱法纯化(SiO2，洗脱剂己烷-EtOAc，2∶1)可得到Boc-NH-(S)-CH{CH2C(CH3)3}CH2OH(1.23g，86％)。
将四丁铵亚硫酸盐(106mg)和50％NaOH水溶液(3ml)依次加入Boc-NH-(S)-CH{CH2C(CH3)3}CH2OH(1.23g，5.35mmol)于苄基氯(13ml)的溶液中。将所得混合物在35-40℃下搅拌90分钟，用EtOAc稀释，用H2O和盐水洗涤，干燥(MgSO4)有机相并通过减压除去挥发性物质。将残留物溶于己烷。把该溶液倒在SiO2柱上。用己烷洗脱柱子以除去苄基氯，再用己烷-EtOAc(2∶1)洗脱可得到Boc-NH-(S)-CH{CH2C(CH3)3}CH2OBzl。所得化合物的1H NMR(CDCl3)显示δ0.95(s，9H)、1.42(s，9H)、1.30-1.55(m，2H)、3.42(d.J＝4Hz，2H)、3.88(broad，1H)、4.54(m，3H)、7.23-7.4(m，5H)。将所得化合物(1.28g，3.99mmol)溶于6N HCl/二烷中(10ml)。
将该溶液在氮气下、4℃时搅拌45分钟。将溶剂挥发可得到所需化合物的盐酸盐(1.05g)。此化合物在本实施例的下一步骤中不需进一步纯化即可使用。(c)本实施例的标题化合物按照实施例1的连接步骤，使用上一部分的NH2-(S)-CH{CH2C(CH3)3}CH2OBzl的盐酸盐作为第一反应物，本实施例(a)部分的(S)-α-叠氮基-1-{(苯甲氧基)羰基}-环戊烷乙酸作为第二反应物即可得到N-{(S)-1-苄氧甲基-3，3-二甲基-丁基}-(S)-α-叠氮基-1-{(苯甲氧基)羰基}-环戊烷乙酰胺。根据N.Maiti等、Tetrahedron Letters，27，1423(1986)中的方法，用溶于MeOH中的氯化锡(II)还原所得化合物即可得到本实施例的标题化合物。该化合物的1H NMR(CDCl3)显示δ0.98(s，9H)、1.22-2.25(m，12H)、3.4(d.J＝4Hz，2H)、3.64(s，1H)、4.18(broad m，1H)、4.52(s，2H)、5.12(s，2H)、7.18(d，J＝7Hz，1H)、7.22-7.38(broad m，10H)。实施例3制备(PhCH2)2CHC(O)-(N-Me)-Val-Tbg-Asp(1-吡咯烷基)-Asp(cyPn)-γMeleucinol(式1，A＝2-(苯甲基)-3-苯丙酰基，B＝N-Me-Val，D＝Tbg，R1＝1-吡咯烷基，R2和R3和与它们结合的碳原子一起形成环戊基，而E＝NHCH(R9)-Z其中R9是2，2-二甲基丙基，Z＝CH2OH)(a)制备中间体Boc-(N-Me)-Val-Tbg-Asp(1-吡咯烷基)-Asp(cyPn)(Bzl)-NH-(S)-CH{CH2C(CH3)3}CH2OBzl根据P.L.Beaulieu等在1991年12月18日的欧洲专利申请461,546中的描述，按照实施例1中的连接步骤，将实施例2的标题化合物(第一反应物)与Boc-Asp(1-吡咯烷基)-OH(第二反应物)相连接可得到Boc-Asp(1-吡咯烷基)-Asp(cyPn)-NH-(S)-CH{CH2C(CH3)3}CH2OBzl。依次将所得化合物脱保护(6N HCl/二噁烷，45分钟，4℃)并在类似条件下与Boc-Tbg-OH相连接可得到Boc-Tbg-Asp(1-吡咯烷基)-Asp(cyPn)-NH-(S)-CH{CH2C(CH3)3}CH2OBzl。随后将所得化合物除去Boc保护基团(6N HCl/二噁烷，4℃，45分钟)可得到以其相应盐酸加成盐形式存在的相应的游离N-末端氨基衍生物。然后将所得氨基衍生物在类似条件下与Boc-(N-Me)-Val-OH相连接可得到所需的中间体。(b)制备标题化合物将上述(a)部分的产物在6N HCl/二噁烷(4℃，45分钟)中转化成其相应的游离N-末端氨基衍生物。将该氨基衍生物的盐酸加成盐(447mg，0.490mmol)溶解于CH2Cl2(1.5ml)中。在氮气下向溶液中加入N-甲基吗啉(200μl，1.83mmol)和二苄基乙酰基氯(269mg，1.04mmol)。将混合物在室温下搅拌7小时，然后减压蒸发掉挥发性物质。将残留物溶于EtOAc中。依次用1N HCl水溶液、NaHCO3的饱和水溶液以及盐水洗涤此溶液，干燥(MgSo4)并减压浓缩。将残留物溶于EtOH(5ml)中。在氢气下(1大气压)，10％(W/V)Pd(OH)2/C(100mg)存在时，将溶液搅拌(磁力搅拌)22小时。在滤膜上收集催化剂，将滤过液浓缩成干品。将残留物通过C-18反相柱HPLC纯化，所使用的是乙腈和H2O的梯度，每种溶剂含有0.06％三氟乙酸，最终可得标题化合物的白色固体(220mg)；1HNMR(DMSO-d6，400MHz，需说明此化合物在DMSO中存在方式为4∶1的旋转异构体混合物)δ0.16(d，J＝6.5Hz，0.6H)、0.22(d，J＝6.5Hz，2.4H)、0.71(d，J＝6.5Hz，2.4H)、0.75(d，J＝6.5Hz，0.6H)、0.80(s，1.8H)、0.82(s，7.2H)、0.87(s，9H)、1.40-1.55(m，7H)、1.65-2.00(m，8H)、2.52-3.90(m，13H)、2.70(s，2.4H)、2.89(s，0.6H)、4.21(d，J＝9.5Hz，0.8H)、4.34(d，J＝9.5Hz，0.2H)、4.43(d，J＝11Hz，与来自较少的旋转异构体的信号相重叠，1H)，4.65-4.73(m，1H)、4.82(d，J＝10Hz，与来自较少的旋转异构体的信号相重叠，1H)、7.04-7.40(m，10.8H)、7.57(d，J＝8.5Hz，1H)、8.01(d，J＝10Hz，与来自较少的旋转异构体的信号相重叠，1H)、8.25(d，J＝9.5Hz，0.2H)、8.30(d，J＝7.5Hz，0.8H)、8.51(d，J＝7.5Hz，0.2H)；FAB质谱m/z939(M＋Na) 。实施例4制备一些典型的中间体以详细描述式1肽的C-末端(a)NH2-(R)-CH(C2H5)C(CH3)3在4，4-二甲基-3-戊酮(106g，0.928mol)、三乙胺(513ml，3.68mol)和(R)-α-甲苄胺(114g，0.940mol)于干苯(1L)的冷却溶液内加入苯(200ml)溶液中的TiCl4(50.5ml，0.459mol)，加入的速率应使混合物的温度低于10℃。然后将混合物在40℃机械搅拌3小时，冷却至室温并用硅藻土过滤。用Et2O洗涤硅藻土。浓缩合并的滤过液及洗液。将残留物溶于无水MeOH(2L)中。将溶液冷却至0℃。分批加入NaBH4(20g，0.53mol)，同时将混合物的温度保持在5℃以下。加入约2ml10％HCl水溶液并蒸发掉MeOH。将残留物溶于Et2O中。将溶液用盐水洗涤，干燥(MgSO4)并蒸发至干品可得到带红色的油状物(由NMR显示出它为18∶1的非对映异构体混合物)。用闪光色谱法纯化此油状物(SiO2、洗脱液EtOAc/己烷、7∶93)可得到N-(1(R)-苯乙基)-1(R)-乙基-2，2-二甲基丙基胺的液体(110g，54％)。将此物质溶于己烷(1.5L)中。在15分钟的期间内向溶液中加入于二噁烷中的6N HCl(90ml)。将所得白色固体收集在滤膜上，然后用己烷洗涤即可得到N-(1(R)-苯乙基)-1(R)-乙基-2，2-二甲基丙基氯化氢(125g，97％)。1H NMR(CDCl3)δ0.55(t，J＝7.5Hz，3H)、1.14(s，9H)、1.54-1.95(m，2H)、2.23(d，J＝6.5Hz，3H)、2.36-2.44(m，1H)、4.31-4.49(m，1H)、7.30-7.48(m，3H)、7.74-7.79(m，2H)。
将溶于MeOH(120ml)中的所得化合物(41.5g)溶液与10％(W/W)Pd/C(4.0g)相混合，将混合物置于帕尔氢气发生器上，在室温下，50psi的氢气中振荡48小时。过滤混合物并浓缩滤过液即可得到所需NH2-(R)-CH(C2H5)C-(CH3)3的盐酸加成盐形式的白色固体(25g，100％)。1H NMR(CDCl3δ1.10(s，9H)、1.22(t，J＝7Hz，2H)、1.58-1.90(m，2H)、2.70-2.85(m，1H)、8.10-8.40(broad s，3H)。
在上述步骤中，以同样的方式，只是用3，3-二甲基-2-丁酮取代4，4-二甲基-3-戊酮即可得到NH2-(R)-CH(CH3)C(CH3)3·HCl。实施例5对单纯性疱疹病毒1型(HSV-1)的核苷酸还原酶的抑制作用(a)酶的制备根据E.A.Cohen等，J.Gen.Virol.，66，733(1985)的描述从被HSV-1F品系病毒感染的静止期的BHK-21/C13细胞中可得到HSV-1核苷酸还原酶(部分被纯化)，感染率为每个细胸10个噬菌斑形成单位。(b)测定P.Gaudreau等在J.Biol.Chem.，262，12413(1987)中描述的测定法被用来评价本发明化合物抑制HSV-1核苷酸还原酶的活力。结果表示为引起酶活性最大抑制50％(IC50)时的化合物浓度，根据酶制品的特殊活性，在每次测定中所用酶制品的单位数是不变的。该结果是相对于没有待测化合物的对照实验中所得活性来说的，代表它们之间相差不到10％的四次测定的平均值。
当根据上述测定法评价实施例3中的(PhCH2)2CHC(O)-(N-Me)-Val-Tbg-Asp(1-吡咯烷基)-Asp(cyPn)-γMeLeucinol时，导致HSV-1核苷酸还原酶活性降低50％的化合物浓度，即IC50，为0.17μm。实施例6对单纯性疱疹病毒2型(HSV-2)在细胞培养中复制的抑制测检将BHK-21/C13细胞(ATCC CCL 10)在150cm2三角锥瓶(1.5×106个细胞/瓶)中培育两天，所用培养基为加有8％(V/V)小牛血清(FBS.Gibco Canada Inc.)的α-MEM培养基(Gibco Canada Inc.，Burlington，Ontario，Canada)。细胞经胰酶消化再转移到24孔培养板的新鲜培养基中以使每孔750μl的培养基中有2.5×105个细胞。将细胞在37℃下培养6小时以使它们附着在培养板上。然后，用500μl加有0.5％(V/V)FBS的α-MEM将细胞洗涤一次，再用750μl同样的培养基(低血清)培养3天。血清饥饿期过后，除去低血清培养基，将细胞在500μl BBMT中培养2至3小时{BBMT培养基由P.Brazeau等描述于Prac.Natl.Acad.Sci.USA，79，7909(1982)}。然后，在100μl BBMT培养基中用HSV-2感染细胞(感染复数＝0.02空斑形成单位/细胞)(注所用HSV-2为HG-52品系，见Y.Lange-lier和G.Buttin，J.Gen.Virol.，57，21(1981)；该病毒被保存于-80℃下。)在37℃下进行病毒吸收1小时后，除去培养基，用BBMT(3×250μl)洗涤细胞。每孔中的细胞与或不与(对照)溶于200μl BBMT培养基中的适当浓度的待检测剂一起温育。在37℃下培养29小时后，通过先在-80℃下冷冻培养板，再解冻来收获被感染的细胞。由于融化的冰晶的作用，可将孔中的细胞从孔表面刮下来。解冻完成后，收集细胞悬浮液，用150μl BBMT培养基冲洗每个孔。将病毒样品(悬浮液加上洗涤液)在4℃下轻微超声处理4分钟。通过离心(1000g，4℃，10分钟)除去细胞碎片。收集上清液，保存于-80℃下直至测定病毒效价。
病毒的滴定是通过R.Deziel和Y.Guindon(前述文献)详细描述的经修改的比色测定法进行的，比色测定法是经M.Langlois等人描述于Journal of Biological Standardization，14，201(1986)。
因而，可测定不同浓度待检测剂对病毒生长抑制的百分率，并可计算出能达到病毒复制50％抑制的待检测剂(即式1肽)的浓度，即EC50。
当根据本实施例的细胞培养测定法来测定实施例3中的(PhCH2)2CHC(O)-(N-Me)-Val-Tbg-Asp(1-吡咯烷基)-Asp(cyPn)-γMeLeucinol时，发现能达到HSV-1病毒复制的50％抑制的浓度，即EC50，为3μM。
根据本发明所用的式1化合物的其它特别的例子为(PhCH2)2CHC(O)-(N-Me)-Val-Tbg-Asp(1-吡咯烷基)-Asp-(cyPn)-γMeLeu-OH，(PhCH2)2CHC(O)-(N-Me)-Val-Tbg-Asp(1-吡咯烷基)-Asp-(cyPn)-NHCH2C(CH3)3以及(PhCH2)2CHC(O)-(N-Me)-Val-Tbg-Asp(1-吡咯烷基)-Asp-(cyPn)-NH-(R)-CH(C2H5)C(CH3)3。
权利要求
1.式1肽或其可用于治疗的盐，A-B-D-NHCH{CH2C(O)R1}C(O)-NHCH{CR2(R3)C(O)OH}C(O)-E1其中A是双取代的低级烷酰基，其中该每个取代基分别选自含有苯基和单取代苯基的一组基团，其中该单取代基选自含有低级烷基、卤基、羟基和低级烷氧基的一组基团；B是N(CH3)CHR4C(O)其中R4是低级烷基；D是NH-CHR5C(O)其中R5是低级烷基或被羧基、羟基、巯基或苄氧基单取代的低级烷基；R1是低级烷基、低级环烷基、{1-(低级烷基)-(低级环烷基)}，或NR6R7其中R6是氢或低级烷基而R7是低级烷基，或者R6和R7与它们共用的氮原子一起形成1-吡咯烷基、哌啶子基、吗啉代或4-甲基1-哌嗪基；R2是氢或低级烷基而R3是低级烷基，或R2和R3与它们共用的碳原子一起形成低级环烷基；而E是NHR8其中R8是(4-9C)烷基；低级环烷基；被低级烷基或(低级烷基)-(低级环烷基)单取代或双取代的低级环烷基；或E是NHCH(R9)-Z其中R9是(4-9C)烷基、低级环烷基或(低级环烷基)-(低级烷基)而Z是CH2OH、C(O)OH、C(O)NH2或C(O)OR10其中R10是低级烷基。
2.一种如权利要求1所述的肽或其可用于治疗的盐，其中A是被苯基、4-(低级烷基)苯基、4-卤苯基或4-(低级烷氧基)苯基双取代的低级烷酰基；B是(N-Me)Val、(N-Me)Ile、(N-Me)Tbg；D是(S)-2-氨基-3-羟基-3-甲基丁酸或(R)-2-氨基-3-巯基-3-甲基丁酸的氨基酸残基或者是选自Val、Ile和Tbg的氨基酸残基；R1是低级烷基、低级环烷基、{1-(低级烷基)-(低级环烷基)}、N，N-二甲基氨基、N，N-二乙基氨基、1-吡咯烷基或吗啉代；R2和R3如权利要求1中所述；而E是NHR8其中R8是(4-9C)烷基；低级环烷基；被低级烷基单取代或双取代的低级环烷基；或(低级烷基)-(低级环烷基)；或者E是NHCH(R9)-Z其中R9是(4-9C)烷基或(低级环烷基)甲基而Z如权利要求1中所述。
3.一种如权利要求2中所述的肽或其可用于治疗的盐，其中A是2-(苯甲基)-3-苯丙酰基、2-{(4-氟苯基)甲基}-3-(4-氟苯基)丙酰基、2-{(4-甲氧苯基)甲基}-3-苯丙酰基或2-{(4-甲氧苯基)甲基}-3-(4-甲氧苯基)丙酰基；B是(N-Me)-Val或(N-Me)-Ile；D是Val，Ile或Tbg；R1是1-甲基乙基、1，1-二甲基乙基、1，1-二甲基丙基、环丁基、环戊基、环己基、1-甲基环戊基、N，N-二甲基氨基、N，N-二乙基氨基、1-吡咯烷基或吗啉代；R2是氢而R3是甲基、乙基、1-甲基乙基、1，1-二甲基乙基或丙基，承载R2和R3的碳原子是(R)-构型，或者R2和R3各自独立地是甲基或乙基，或者R2和R3与它们共用的碳原子一起形成环丁基、环戊基或环己基；而E是NHR8其中R8是2，2-二甲基丙基、1(R)2，2-三甲基丙基、1(R)-乙基-2，2-二甲基丙基、2，2-二甲基丁基、3，3-二甲基丁基、1(R)，2，2-三甲基丁基、1(R)，3，3-三甲基丁基、1(R)-乙基-3，3-二甲基或环己基甲基；或者E是NHCH(R9)-Z，其中承载R9的碳原子是(S)-构型，R9是1，1-二甲基乙基、1-甲基丙基、2-甲基丙基、2，2-二甲基丙基或环己基甲基而Z是CH2OH、C(O)OH、C(O)NH2或C(O)OR10其中R10是甲基、乙基或丙基。
4.一种如权利要求3所述的肽或其可用于治疗的盐，其中A是2-(苯甲基)-3-苯丙酰基；B是(N-Me)Val；D是Tbg；R1是1-甲基乙基、1，1-二甲基乙基、1-甲基丙基、1，1-二甲基丙基、2，2-二甲基丙基、环丁基、环戊基、环己基、1-甲基环戊基、1-吡咯烷基或吗啉代；R2是氢而R3是甲基、乙基、1-甲基乙基或丙基，承载R2和R3的碳原子是(R)-构型，或者R2和R3各自独立地是甲基或乙基，或者R2和R3与它们的共用碳原子一起形成环丁基、环戊基或环己基；而E是NHR8其中R8是2，2-二甲基丙基、1(R)，2，2-三甲基丙基、1(R)-乙基-2，2-二甲基丙基、2，2-二甲基丁基或1(R)-乙基-3，3-二甲基丁基，或者E是NHCH(R9)-Z，其中承载R9的碳原子是(S)-构型，R9是2，2-二甲基丙基而Z是CH2OH、C(O)OH、C(O)NH2或C(O)OR10其中R10是甲基、乙基或丙基。
5.一种如权利要求1所述的肽选自(PhCH2)2CHC(O)-(N-Me)-Val-Tbg-Asp(1-吡咯烷基)-Asp-(cyPn)-γMeLeucinol，(PhCH2)2CHC(O)-(N-Me)-Val-Tbg-Asp(1-吡咯烷基)-Asp-(cyPn)-γMeLeu-OH，(PhCH2)2CHC(O)-(N-Me)-Val-Tbg-Asp(1-吡咯烷基)-Asp-(cyPn)-NHCH2C(CH3)3，以及(PhCH2)2CHC(O)-(N-Me)-Val-Tbg-Asp(1-吡咯烷基)-Asp-(cyPn)-NH-(R)-CH(C2H5)C(CH3)3。
6.一种药物组合物，包含抗疱疹病毒有效剂量的如权利要求1所述的肽或其可用于治疗的盐和可药用或可兽医用的载体。
7.一种如权利要求6所述的药物组合物，其中该肽选自(PhCH2)2CHC(O)-(N-Me)-Val-Tbg-Asp(1-吡咯烷基)-Asp-(cyPn)-γMeLeucinol，(PhCH2)2CHC(O)-(N-Me)-Val-Tbg-Asp(1-吡咯烷基)-Asp-(cyPn)-γMeLeu-OH，(PhCH2)2CHC(O)-(N-Me)-Val-Tbg-Asp(1-吡咯烷基)-Asp-(cyPn)-NHCH2C(CH3)3，以及(PhCH2)2CHC(O)-(N-Me)-Val-Tbg-Asp(1-吡咯烷基)-Asp-(cyPn)-NH-(R)-CH(C2H5)C(CH3)3。
8.一种化妆品组合物，包含权利要求1所述肽或其可用于治疗的盐以及适于局部施用的生理上可接受的载体。
9.一种治疗哺乳动物疱疹病毒感染的方法，包括给哺乳动物施用抗疱疹病毒有效剂量的如权利要求1所述的肽或其可用于治疗的盐。
10.一种如权利要求9的方法，其中该肽选自(PhCH2)2CHC(O)-(N-Me)-Val-Tbg-Asp(1-吡咯烷基)-Asp-(cyPn)-γMeLeucinol，(PhCH2)2CHC(O)-(N-Me)-Val-Tbg-Asp(1-吡咯烷基)-Asp-(cyPn)-γMeLeu-OH，(PhCH2)2CHC(O)-(N-Me)-Val-Tbg-Asp(1-吡咯烷基)-Asp-(cyPn)-NHCH2C(CH3)3，以及(PhCH2)2CHC(O)-(N-Me)-Val-Tbg-Asp(1-吡咯烷基)-Asp-(cyPn)-NH-(R)-CH(C2H5)C(CH3)3。
11.一种抑制疱疹病毒复制的方法，通过将病毒与疱疹病毒核苷酸还原酶抑制剂量的权利要求1所述肽或其可用于治疗的盐相接触来实现。
12.一种如权利要求11的方法，其中肽选自(PhCH2)2CHC(O)-(N-Me)-Val-Tbg-Asp(1-吡咯烷基)-Asp-(cyPn)-γMeLeucinol，(PhCH2)2CHC(O)-(N-Me)-Val-Tbg-Asp(1-吡咯烷基)-Asp-(cyPn)-γMeLeu-OH，(PhCH2)2CHC(O)-(N-Me)-Val-Tbg-Asp(1-吡咯烷基)-Asp-(cyPn)-NHCH2C(CH3)3，以及(PhCH2)2CHC(O)-(N-Me)-Val-Tbg-Asp(1-吡咯烷基)-Asp-(cyPn)-NH-(R)-CH(C2H5)C(CH3)3。
13.一种药物组合物，包含可药用或可兽医用载体，以及有效剂量的抗病毒的核苷类似物或其可用于治疗的盐与可抑制核苷酸还原酶的如权利要求1所述的肽或其可用于治疗的盐。
14.一种如权利要求13所述的药物组合物，其中该核苷类似物是式2所示的化合物或其可用于治疗的盐 其中R11是氢、羟基或氨基。
15.一种如权利要求13的药物组合物，其中该抗病毒核苷类似物是选自阿糖腺苷、碘苷、trifluridine、ganciclovir、edoxudine、brovavir、fiacitabine、penciclovir、famciclovir以及rociclovir。
16.一种治疗哺乳动物中疱疹病毒感染的方法，包括施用有效剂量的抗病毒核苷类似物或其可用于治疗的盐与可抑制核苷酸还原酶的如权利要求1的式1肽或其可用于治疗的盐的联合。
17.一种如权利要求16的方法，其中该核苷类似物以及式1肽可依次施用或同时施用。
18.一种如权利要求16的方法，其中该组合物被局部施用。
19.一种如权利要求16的方法，其中抗病毒的核苷类似物选自无环鸟苷、6-脱氧无环鸟苷、2，6-二氨基-9-{(2-羟基乙氧基)甲基}嘌呤、阿糖腺苷、碘苷、trifluridine、gangciclovir、edoxudine、brovavir、fiacitabine、penciclovir、famciclovir以及rociclovir。
20.一种治疗哺乳动物中单纯性疱疹病毒1型或2型感染的方法，包括施用有效剂量的如权利要求6的药物组合物，其中该组合物中的肽是(PhCH2)2CHC(O)-(N-Me)-Val-Tbg-Asp(1-吡咯烷基)-Asp-(cyPn)-γMeLeucinol。
21.一种制备如权利要求1所述肽或其可用于治疗的盐的方法，包括a)按照肽的序列逐步连接氨基酸或衍生的氨基酸残基以及此肽的非肽片段，其中i)将残基或片段的活性侧链基团用适当的保护基团保护以防止该位点化学反应的发生，直至逐步连接完成后保护基团最终被除去；ii)将连接反应物的α-氨基基团用α-氨基保护基团保护，而该反应物的游离羧基与第二反应物的游离α-氨基基团相连接；该α-氨基保护基团为一个可被选择性地除去的保护基，以使随后的连接步骤可在此α-氨基基团处发生；以及iii)将要成为被保护肽的C-末端的氨基酸残基或肽片段的C-末端羧基，如果存在，需用适当的保护基团保护以防止此位点化学反应的发生，直至此肽合乎需要的氨基酸序列被组装完毕；以及b)连接完成后，除去任何保护基团以及，如有必要，使之进行常规转化以得到如权利要求1所述的肽；以及如有必要将此肽转变为其可用于治疗的盐。
全文摘要
此处公开了如式A-B-D-NHCH{CH
文档编号C07K7/06GK1118601SQ94191343
公开日1996年3月13日 申请日期1994年2月28日 优先权日1993年3月3日
发明者罗伯特·德兹伊尔, 尼尔·莫斯 申请人:比奥-梅加/贝林格尔·英格海姆研究公司
技术领域：
本发明涉及具有抗病毒特性的肽衍生物以及使用此衍生物治疗病毒感染的方法。更特别地，本发明涉及显示出抗疱疹病毒活性的肽衍生物(下文称为“肽”)，含有此肽的药物组合物以及使用此肽抑制疱疹病毒的复制并治疗疱疹病毒感染的方法。
疱疹病毒给人和动物带来的疾病范围很广，例如单纯性疱疹病毒1型和2型(HSV-1和HSV-2)可分别引起唇疱疹和生殖器损害；水痘带状疱疹病毒(VZV)会导致水痘和带状疱疹；Epstein-Barr病毒(EBV)会导致传染性单核细胞增多症。
在过去的二十年间，研究人员在研究新的治疗剂以治疗疱疹病毒感染的过程中，对已知为嘌呤和嘧啶核苷类似物的一类化合物倾注了最多的注意力。结果已将几种核苷类似物开发成抗病毒剂。至今最成功的是无环鸟苷，它是治疗人生殖器疱疹病毒感染的首选药物。
然而，虽然有一些重大进展，对治疗疱疹病毒感染的有效、安全的治疗剂的需要继续存在。
为评论此领域最新的治疗剂，可参看M.C.Nahata“抗病毒药物药物动力学，副作用和治疗作用”，J.Pharm.Technol.，3，100(1987)。
本申请公开了一组具有抗疱疹病毒活性的肽衍生物，这些肽有选择地抗疱疹病毒的作用，结合宽限度的安全性使此肽成为对抗疱疹病毒感染的合乎需要的药剂。
下列参考文献公开了与抗疱疹病毒活性相关的肽或肽衍生物B.M.Dutia等，Nature，321，439(1986)，E.A.Cohen等，Nature，321，441(1986)，J.H.Subak-Sharpe等，英国专利申请2185024，于1987年7月8日公布，P.Gaudreau等，J.Biol.Chem.，262，12413(1987)，E.A.Cohen等，美国专利4,795,740，1989年1月3日，R.Freidinger等，美国专利4,814,432，1989年3月21日，V.M.Garskey等，美国专利4,837,304，1989年6月6日，R.Colonno等，美国专利4,845,195，1989年7月4日，P.Gaudreau等，J.Med.Chem.，33，723(1990)，J.Adams等，欧洲专利申请408,973，公布于1991年1月23日，P.L.Beaulieu等，欧洲专利申请411,332，公布于1991年2月6日，J.Adams等，欧洲专利申请411,333，公布于1991年2月6日，J.Adams等，欧洲专利申请411,334，公布于1991年2月6日，R.L.Tolman等，欧洲专利申请412,595，公布于1991年2月13日，W.T.Ashton等，欧洲专利申请438,873，公布于1991年7月31日，P.L.Beaulieu等，欧洲专利申请461,546，公布于1991年12月18日，P.Gaudreau等，J.Med.Chem.，35，346(1992)，R.Deziel和Y.Guindon，加拿大专利申请2,033,488，公布于1992年7月1日以及L.L.Chang等，Biorganic & Medicinal ChemistryLetters，2，1207(1992)。
通过特征结构和生物学上的差异可将上述报告中有关的肽与本申请的肽区分开来。
下文中所用缩写和符号在本申请“发明细节”这一节中有限定。
本发明的肽或其可用于治疗的盐由式1表示A-B-D-NHCH{CH2C(O)R1}C(O)-NHCH{CR2(R3)C(O)OH}C(O)-E1其中A是双取代的低级链烷酰基，其中每个取代基分别选自包括苯基和单取代苯基的一组基团，其中该单取代基选自低级烷基、卤基、羟基和低级烷氧基；B是N(CH3)CHR4C(O)其中R4是低级烷基；D是NH-CHR5C(O)其中R5是低级烷基或被羧基、羟基、巯基或苄氧基单取代的低级烷基；R1是低级烷基、低级环烷基、{1-(低级烷基)-(低级环烷基)}，或NR6R7其中R6是氢或低级烷基而R7是低级烷基，或者R6和R7与它们共用的氮原子一起形成1-吡咯烷基(Pyrrolidino)、哌啶子基(Piperidino)、吗啉代(morpholino)或4-甲基1-哌嗪基(4-methylpiperazino)；R2是氢或低级烷基而R3是低级烷基，或R2和R3与它们共用的碳原子一起形成低级环烷基；而E是NHR8其中R8是(4-9C)烷基；低级环烷基；被低级烷基或(低级烷基)-(低级环烷基)单取代或双取代的低级环烷基；或E是NHCH(R9)-Z其中R9是(4-9C)烷基、低级环烷基或(低级环烷基)-(低级烷基)而Z是CH2OH、C(O)OH、C(O)NH2或C(O)OR10其中R10是低级烷基；一组优选的本发明肽或其可用于治疗的盐由式1表示，其中A是被苯基、4-(低级烷基)苯基、4-卤苯基或4-(低级烷氧基)苯基双取代的低级烷酰基；B是(N-Me)Val、(N-Me)Ile或(N-Me)Tbg；D是(S)-2-氨基-3-羟基-3-甲基丁酸或(R)-2-氨基-3-巯基-3-甲基丁酸的氨基酸残基或者是选自Val、Ile和Tbg的氨基酸残基；R1是低级烷基、低级环烷基、{1-(低级烷基)-(低级环烷基)}、N，N-二甲基氨基、N，N-二乙基氨基、1-吡咯烷基或吗啉代；R2和R3如上文所定义；而E是NHR8其中R8是(4-9C)烷基；低级环烷基；被低级烷基单取代或双取代的低级环烷基；或(低级烷基)-(低级环烷基)；或者E是NHCH(R9)-Z其中R9是(4-9C)烷基或(低级环烷基)甲基而Z如上文所定义；一组更优选的肽或其可用于治疗的盐由式1表示，其中A是2-(苯甲基)-3-苯丙酰基、2-{(4-氟苯基)-甲基}-3-(4-氟苯基)丙酰基、2-{(4-甲氧苯基)甲基}-3-苯丙酰基或2-{(4-甲氧苯基)甲基}-3-(4-甲氧苯基)丙酰基；B是(N-Me)-Val或(N-Me)-Ile；D是Val、Ile或Tbg；R1是1-甲基乙基、1，1-二甲基乙基、1，1-二甲基丙基、环丁基、环戊基、环己基、1-甲基环戊基、N，N-二甲基氨基、N，N-二乙基氨基、1-吡咯烷基或吗啉代；R2是氢而R3是甲基、乙基、1-甲基乙基、1，1-二甲基乙基或丙基，承载R2和R3的碳原子是(R)-构型，或者R2和R3各自独立地是甲基或乙基，或者R2和R3与它们共用的碳原子一起形成环丁基、环戊基或环己基；而E是NHR8其中R8是2，2-二甲基丙基、1(R)2，2-三甲基丙基、1(R)-乙基-2，2-二甲基丙基、2，2-二甲基丁基、3，3-二甲基丁基、1(R)，2，2-三甲基丁基、1(R)，3，3-三甲基丁基、1(R)-乙基-3，3-二甲基或环己基甲基；或者E是NHCH(R9)-Z，其中承载R9的碳原子是(S)-构型，R9是1，1-二甲基乙基、1-甲基丙基、2-甲基丙基、2，2-二甲基丙基或环己基甲基而Z是CH2OH、C(O)OH、C(O)NH2或C(O)OR10其中R10是甲基、乙基或丙基；一组最优选的肽或其可用于治疗的盐由式1表示，其中A是2-(苯甲基)-3-苯丙酰基；B是(N-Me)Val；D是Tbg；R1是1-甲基乙基、1，1-二甲基乙基、1-甲基丙基、1，1-二甲基丙基、2，2-二甲基丙基、环丁基、环戊基、环己基、1-甲基环戊基、1-吡咯烷基或吗啉代；R2是氢而R3是甲基、乙基、1-甲基乙基或丙基，承载R2和R3的碳原子是(R)-构型，或者R2和R3各自独立地是甲基或乙基，或者R2和R3与它们共用的碳原子一起形成环丁基、环戊基或环己基；而E是NHR8其中R8是2，2-二甲基丙基、1(R)，2，2-三甲基丙基、1(R)-乙基-2，2-二甲基丙基、2，2-二甲基丁基或1(R)-乙基-3，3-二甲基丁基，或者E是NHCH(R9)-Z，其中承载R9的碳原子是(S)-构型，R9是2，2-二甲基丙基而Z是CH2OH、C(O)OH、C(O)NH2或C(O)OR10其中R10是甲基、乙基或丙基。
包括在本发明范围中的是含有抗疱疹病毒有效量的式1所示的肽或其可用于治疗的盐的药物组合物以及可药用或可兽医用载体。
还包括在本发明范围中的是含有式1所示的肽或其可用于治疗的盐的化妆品组合物以及适于表面施用的生理上可接受的载体。
本发明重要的一个方面包括通过给哺乳动物施用抗疱疹病毒有效剂量的式1所示的肽或其可用于治疗的盐以治疗哺乳动物疱疹病毒感染的方法。
本发明另一个重要的方面包括通过将该病毒与疱疹病毒核苷酸还原酶抑制剂量的式1所示的肽或其可用于治疗的盐接触以抑制疱疹病毒复制的方法。
另一个重要方面包括通过给哺乳动物联合施用抗疱疹病毒有效剂量的式1所示的肽或其可用于治疗的盐以及抗病毒的核苷类似物以治疗疱疹病毒感染的方法。含有此联合的药物组合物也在本发明的范围中。
制备式1所示的肽的方法在下文中描述。
可选择地，式1可表示为 关于氨基酸或氨基酸衍生物的“残基”一词是指相应的α-氨基酸通过脱去羧基上的羟基和α-氨基上的一个氢而得到的基团。
通常这里用来标明氨基酸和保护基团的缩写是根据生物化学命名IUPACIUB委员会的建议，见European Journal of Biochemistry138，9(1984)。例如Val、Ile、Asp和Leu分别表示L-缬氨酸、L-异亮氨酸、L-天冬氨酸和L-亮氨酸残基。
存在于式1肽的主要直链轴(即，主链)中的不对称碳原子。排除末端基团A和(E的)Z、但包括承载“R9”的碳原子(当E在文中被定义为NHCH(R9)-Z时)，具有S构型。
存在于氨基酸或衍生的氨基酸残基侧链的不对称碳原子、末端基团A以及当E如本文定义表示为NHR8时的末端基团E的不对称碳原子可以是S或R构型。
符号“Tbg”表示(S)-2-氨基-3，3-二甲基丁酸的氨基酸残基。符号“γMeleu”表示(S)-2-氨基-4，4-二甲基戊酸的氨基酸残基。符号“γMeleucinol”表示从α-氨基上脱去一个氢后的(S)-2-氨基-4，4-二甲基戊醇。
本文所用的另一些符号是(N-Me)Val是(S)-3-甲基-2-(甲基氨基)-丁酸的残基；(N-Me)Ile是(S)-3-甲基-2-(甲基氨基)-戊酸的残基；(N-Me)Tbg是(S)-2-(甲基氨基)-3，3-二甲基丁酸的残基；Asp(cyBu)是(S)-α-氨基-1-羧基环丁烷乙酸的残基；Asp(cyPn)是(S)-α-氨基-1-羧基环戊烷乙酸的残基；而Asp{(R)-Me}是3-(R)-甲基-L-天冬氨酸的残基(即，{S-(R*，S*)}-2-氨基-3-甲基丁二酸)。
本文所用的“卤基”一词是指选自溴、氯、氟或碘的卤基。
本文所用的“低级烷酰基”是指含有2至6个碳原子的直链1-氧代烷基(1-oxoalkyl)或者含有4至6个碳原子的支链1-氧代烷基；例如，乙酰基、丙酰基(1-氧代丙烷)和2-甲基-1-氧代丙烷。
本文所用的“(4-9C)烷基”一词是指含有4至9个碳原子的直链和支链烷基，包括例如1-甲基丙基、2-甲基丙基、2，2-二甲基丙基、1，2，2-三甲基丙基、3，3-二甲基丁基、1-乙基-2，2-二甲基-丁基和4，4-二甲基戊基。
本文所用的“低级烷基”一词，无论是单独的或与其它基团联合，都是指含有1到6个碳原子的直链烷基和含有3至6个碳原子的支链烷基，包括甲基、乙基、丙基、丁基、己基、1-甲基乙基、1-甲基丙基、2-甲基丙基和1，1-二甲基乙基。
本文所用的{1-(低级烷基)-(低级环烷基)}一词是指在位置1处带有低级烷基取代基的低级环烷基；例如1-乙基环丙基、1-丙基环戊基和1-丙基环己基。
本文所用的“低级环烷基”一词，无论是单独的或是与其它基团联合，都是指含有3至6个碳原子的饱和环烃基，包括环丙基、环丁基、环戊基和环己基。
本文所用的“低级烷氧基”一词是指含有1至4个碳原子的直链烷氧基和含有3至4个碳原子的支链烷氧基，包括甲氧基、乙氧基、丙氧基、1-甲基乙氧基、丁氧基和1，1-二甲基乙氧基，后一基团即通常所知的叔丁氧基。
本文所用的“可药用载体”或“可兽医用载体”是指无毒的、通常为活性成分的惰性赋形剂，它对该成分不造成不利影响。
本文所用的“生理上可接受的载体”一词是指含一种或多种无毒赋形剂的可接受的化妆品赋形剂，它不与其中所含的有效成分反应，或不会降低有效成分的效能。
本文所用的“可兽医用载体”是指含有一种或多种无毒药用可接受赋形剂、供给家养动物施用药物的生理上可接受的赋形剂，它不与药物反应或不降低药物的效能。
“有效剂量”一词是指预定的抗病毒剂的抗病毒剂量，即足够有效抗御体内病毒有机体的药剂用量。
本文所用的“连接剂”一词是指能够使氨基酸或肽的游离羧基与另一氨基酸或肽的游离氨基的脱水连接，从而在反应物之间形成酰胺键的试剂。同样，这种试剂可使酸和醇连接，从而形成相应的酯。此试剂通过激活羧基来促进脱水连接或使其易于发生。对这种连接剂和激活基团的描述可见于肽化学的一般课本中例如，E.Schroder和K.L.Lubke，“The Peptides”，Vol.l，AcademicPress，New York，N.Y.，1965，pp2-128，和K.D.Kopple，“Peptides and Amino acids”，W.A.Benjamin，Inc.，New York，N.Y.，1966，pp33-51。连接剂的例子有二苯基磷酰基叠氮化物、1，1-羰基二咪唑、二环己基碳化二亚胺、N-羟基丁二酰胺、或者在二环己基碳化二亚胺存在时的1-羟基-苯并三唑。很实用的连接剂是(苯并三唑-1-基氧)三(二甲基氨基)鏻六氟磷酸盐，由B.Castro等人描述，见Tetrahedron Letters，1219(1975)，也可见于D，Hudson，J.Org.Chem.，53，617(1988)，它可独自使用，或也可在1-羟基苯并三唑存在下使用。另一个很实用的连接剂是可购于市场的2-(1H-苯并三唑-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基脲四氟硼酸盐。
制备式1肽的方法可结合普通的肽的合成方法，如传统的液相连接氨基酸残基和/或肽片段的方法。这种方法的描述例见以上提及的教科书系列，E.Schroder和K.Lubke.“The PeptidesAna-lysis，Synthesis，Biology”，E.Gross等人，Eds.，AcademicPress，New York，N.Y.，1979-1987，卷1至8，和J.M.Stewart和J.D.Young“Solid Phase Peptide Synthesis”，2nd ed.，PierceChem.Co.，Rockford，IL，USA，1984。
以上提及的肽的制备方法的普遍特征是用适当的保护基团保护各个氨基酸残基或衍生的氨基酸残基(或者，如有必要，为此肽的非肽片段)的活性侧链基团，此保护基团可避免在此位点发生化学反应直至它最终离开。对氨基酸或片段的α-氨基的保护也很普遍，其时本体在羧基的位置处反应，然后通过选择性地除去α-氨基保护基团以允许此位置处后续反应的进行。另一个普遍的特征是用适当的保护基团最先保护氨基酸残基或肽片段的C-末端羧基，如果它存在即会成为肽的C-末端，保护基团会防止在此位点发生化学反应，直至所需肽的序列被合成完毕后保护基团被除去时。
因此，一般来说，式1的肽可通过逐步连接来制备，并应按照肽的氨基酸或衍生的氨基酸残基序列，以及肽的非肽片段(如主要中间体)的序列次序连接，如有必要需适当地保护，如果此保护存在，在逐步连接完成后还需除去所有的保护基团，然后就可得到式1的肽，在下文的实施例中将阐明更具体的方法。
大多数中间体以及制备它们的方法已被J.Adams等描述，见欧洲专利申请411332，于1991年2月6日公布，J.Adams等，欧洲专利申请411,334，于1991年2月6日公布，以及R.Deziel和Y.Guindon，加拿大专利申请2,033,448，于1992年7月1日公布。
制备本发明肽的N-末端所必需的被苯基或单取代的苯基双取代的低级链烷酸是已知的或可通过已知方法制备。例如，可参阅L.L.Chang等，Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters，21207(1992)，二苯乙酸已被M.R.Dolique描述，Ann.Chim.(Paris)，15(10)，425(1931)，也被F.Krollpfeiffer和A.Rosenberg描述于Chem.Ber.，69 465(1936)。
本发明的式1的肽可以药用可接受盐的形式获得。在一特定的肽中有一残基有碱的功能的情况下，此碱的盐是那些与有机酸，例如乙酸、乳酸、琥珀酸、甲磺酸或P-甲苯磺酸，以及聚合酸，如单宁酸或羧甲基纤维素生成的盐，也有与无机酸如氢卤酸，如氯化氢、或硫酸、或磷酸生成的盐。如有必要，可通过R.A.Boissonnas等，在Helv.Chim.Acta，43，1849(1960)中描述的、经过适当离子交换树脂处理的方法，将特定的酸加成盐转变为另一种酸加成盐，如无毒、可药用的盐。
在一特定的肽具有一个或多个自由羧基的情况下，这种羧基的盐是那些与钠、钾或钙阳离子，或与有机碱如三乙胺或N-甲基吗啉所生成的盐。
可通过生物化学、微生物学和生物学方法证实式1肽对单纯性疱疹病毒1型和2型(HSV-1和HSV-2)，以及其它疱疹病毒，例如水痘带状疱疹病毒(VZV)和Epstein-Barr病毒(EBV)复制的抑制作用。
在下文实施例中，描述了作为范例的式1所示的肽对疱疹病毒核苷酸还原酶的抑制作用。值得注意的是，与对疱疹病毒核苷酸还原酶的特殊抑制有关的是此肽对正常细胞复制所需的细胞核苷酸还原酶活性影响相对较小或不存在影响。
证实式1肽对病毒复制的抑制效果的方法是细胞培养技术；可参阅，如R.Deziel和Y.Guindon，加拿大专利申请2,033,488，于1992年7月1日公布。
此肽的治疗效果可用实验动物证明，例如，可使用C.R.Brandt等在J.Virol.Meth.，36,209(1992)中描述的、基于被单纯性疱疹病毒引发了眼病的鼠模型测定方法来进行。
当本发明的肽或它的可药用盐的一种被当作抗病毒剂使用时，它可以局部地或全身地施用给温血动物，如人、猪或马，其赋形剂含有一种或多种药用可接受载体，它的比例取决于此肽的可溶性和化学性质、所选择的施用途径以及标准的生物学操作。局部施用时，此肽可在含有0.1至5％，优选0.5至2％的活性剂的可药用赋形剂中成形。这种成形的形式可以是溶液、乳剂或洗剂。
全身施用时，式1肽可通过静脉、皮下或肌肉内注射中的任一种施用，其组分中含有可药用赋形剂或载体。当注射施药时，优选使用无菌水溶液载体中的肽，此溶液中还可含有其它溶质，例如缓冲液或防腐剂以及足够量的可药用盐类或葡萄糖以使此溶液等渗。
以上提到的成形所用的适当赋形剂或载体在一般的药学教科书中有所描述，例“Remington′s Pharmaceutical Sciences”，18thed，Mack Publishing Company，Easton，Penn.，1990。
此肽的剂量随施用的方式和所选择的特殊的活性剂的不同而不同，而且还随所治疗的特定宿主的不同而不同。通常治疗以小增量开始直至达到此情况下的最佳效果。一般此肽最合乎需要的施用浓度水平是一般能够保证抗病毒的效果同时不会导致任何有害或有毒的副作用。
至于局部使用，此肽以适当的外用配方施用于体表受感染的皮肤区域，例如皮肤或口腔的一部分或生殖器腔，所用剂量应足以履盖受感染的区域。治疗应该重复进行，例如每四至六小时一次直至损害被治愈。
至于全身施用，式1肽施用的剂量为每公斤体重每天10μg至500μg，尽管上述差异也会存在。然而为了达到效果，最合乎需要的使用剂量水平处于每公斤体重每天约10μg至200μg的范围之中。
本发明的另一方面包括化妆品组合物，它含有疱疹病毒预防剂量的式1肽，或者它的治疗用可接受盐，同时还含有生理上可接受的化妆品载体。配方中还可包括附加成分，例如皮肤软化剂。本发明的化妆品配方被用来预防皮肤疱疹病毒损害的发生。此配方可每晚施用于皮肤的易感区域。通常，化妆品组合物所含的肽比相应的局部使用的药物组合物中的肽要少。化妆品组合物中肽的优选的量的范围是重量的0.01％至0.2％。
尽管上述公开的配方被证明是治疗疱疹病毒感染有效而相对安全的药物，但并不排除这些配方与其它抗病毒药物或试剂一起施用会得到更好效果的可能性。这些其它的抗病毒药物或试剂包括抗病毒的核苷，例如无环鸟苷，以及抗病毒的表面活性剂或抗病毒的干扰素，如由S.S.Asculai和F.Rapp，1985年3月26日公开于美国专利4,507,281中。
有关通过同时施用来治疗疱疹病毒感染的更具体的情况是，已经发现抗病毒的核苷类似物经与式1肽联合施用，其抗疱疹病毒的活性可被协同增强，而没有相伴随的毒作用的增强。因而，本文提供了治疗哺乳动物疱疹病毒感染的药物组合物，它含有可药用或可兽医用的载体以及有效剂量的抗病毒的核苷类似物或其可药用的盐与可抑制核苷酸还原酶的式1肽或其可药用盐。
本文还提供了治疗哺乳动物疱疹病毒感染的方法。此方法包括给哺乳动物施用抗疱疹病毒有效剂量的式1化合物或其可治疗用盐以及抗病毒的核苷类似物或其可治疗用盐。
组合物中的抗病毒核苷类似物可经酶转变成(体内)疱疹病毒DNA聚合酶的病毒DNA聚合酶抑制剂，和/或其可选择的底物。抗病毒的核苷类似物可选自已知的核苷类似物。本发明优选的核苷类似物包括无环鸟苷及其类似物；例如式2的化合物及其可药用盐。 其中R11是氢、羟基或氨基，(当R11是羟基时，式2表示无环鸟苷)。
根据本发明使用的其它优选的抗病毒的核苷类似物包括阿糖腺苷(vidarabine)、碘苷(idoxuridine)、trifluridine、gangciclovir、edoxudine、brovavir、fiacitabine、penciclovir、famciclovir以及rociclovir。
“协同作用”一词用于描述上述定义的核苷类似物和式1肽组合物的抗病毒或抗疱疹病毒活性时，意味着它的抗病毒或抗疱疹病毒的作用比所预料的组合物中两个单独成分相加的作用要大。
当使用本发明的组合物治疗疱疹病毒感染时，该组合物是在含有一种或多种可药用载体的赋形剂中被施用给温血动物，例如人、猪或马，其比例取决于核苷类似物和式1肽的可溶性以及化学特性、所选择的施用途径、标准的生物学操作，以及为提供协同抗病毒效果的两种活性成分的相对量。该组合物最好局部施用，例如两种活性成分(即抗病毒的核苷类似物以及式1肽，或它们的可治疗用盐)可在可药用赋形剂中配制成溶液、乳浊液、乳剂或洗剂。这样的配方可含有占重量0.01％至1.0％的核苷类似物或其可治疗用的盐，以及可含有占重量约0.05％至1％的式1肽或其可药用盐。
在任何情况下，存在于药物组合物的两种活性剂的量要能提供协同的抗疱疹病毒的作用。
以下实施例将进一步阐明本发明，所给温度是摄氏温度，溶液百分含量或比率表示的是体积对体积的关系，除非有特别说明。核磁共振光谱由Bruker200或400MHz分光计来记录(开始时记下了400MHz的光谱)；化学移动(δ)由每百万分之几来表示。实施例中所用的缩写包括Boc叔丁基氧化羰基；Bzl苄基；EtOH乙醇；EtOAc乙酸乙酯；Et2O乙醚；HPLC高效液相色谱；MeOH甲醇；THF四氢呋喃。实施例1连接反应的一般步骤{也见R.Knorr等，Tetrahedron Letters，30，1927(1989)}将第一个反应物，即游离的胺(或其盐酸盐)溶解于CH2Cl2或乙腈中，并将该溶液冷却至4℃。在氮气下加入4当量的N-甲基吗啉于搅拌着的溶液中。20分钟后加入1当量第二反应物，即游离的羧酸以及1.05当量的连接剂。针对此目的的实用而有效的连接试剂是(苯并三唑-1-基氧)三-(二甲基氨基)鏻六氟磷酸盐或优选为2-(1H-苯并三唑-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基脲四氟硼酸盐。反应由TLC监测。反应结束后通过减压蒸发掉CH2Cl2(或乙腈)，将残留物溶于EtOAc，依次用1N柠檬酸水溶液、10％Na2CO3水溶液和盐水洗涤溶液，将有机相干燥(MgSO4)、过滤并通过减压浓缩成干品。根据Still的闪光色谱技术{W.C.Still等，J.Org.Chem.，43，2923(1978)}，将残留物经硅胶(SiO2)纯化。实施例2制备中间体H-Asp(cyPn)(Bzl)-NH-(S)-CH{CH2C(CH3)3}CH2OBzl(a)(S)-α-叠氮基-1-{(苯甲氧基)羰基}-环戊烷乙酸此化合物由M.N.Aboul-Enein等人在Pharm.Acta Helv.，55，50(1980)中描述的2-氧螺[4，4]壬烷-1，3-二酮制备得到，所根据的是使用Evan氏辅助剂的不对称叠氮化法，见D.A.Evans等，J.Amer.Chem.Soc.，112，4011(1990)。
更明确地说，将丁基锂的(469ml，750mmol)1.6M己烷溶液在氩气下滴加至手性辅助剂、4(S)-(1-甲基乙基)-2-噁唑烷酮{96.8g，750mmol，由L.N.Pridgen和J.Prol.描述于J.Org.Chem.，54，3231(1989)}于-40℃下干THF中的溶液里，将混合物在-40℃下搅拌30分钟，然后冷却至-78℃，在冷却的混合物中滴加2-氧螺[4，4]壬烷-1，3-二酮，再将此混合物在0℃下搅拌1小时。然后在混合物中加入20％(W/V)柠檬酸水溶液(600ml)。分离有机相，并用EtOAc抽提水相。结合的有机相经盐水洗涤、干燥(MgSO4)以及在减压下浓缩可得到3-{2-(1-羧基-环戊基)-1-氧代乙基)}-4-(S)-(1-甲基乙基)-2-噁唑烷酮(Oxazolidinone)的粉红色固体(300g)。
将所得到的固体(ca750mmol)溶解于乙腈中(1L)。在此溶液中加入苄基溴(128.3g，89.2ml，750mmol)和1，8-二氮杂双环[5，4，0]-十一碳-7-烯(114g，112ml，75mmol)，在氩气下搅拌此混合物16小时。减压除去挥发性物质，将残留物溶于H2O/EtOAc中。分离有机相，用10％(W/V)柠檬酸水溶液、盐水洗涤，减压干燥(MgSO4)并浓缩为干品可得到一油状物。将此油状物从己烷/EtOAc中结晶可得到相应苄基酯的白色固体(204g，73％)。
将所得化合物(70g，187mmol)于干THF(200ml)中的溶液冷却至-78℃。在15分钟的期间内在冷却的溶液中加入含有6％(W/V)异丙基苯的0.66M钾1，1，1，3，3，3-六甲基二硅氮烷(286ml，189mmol)的THF溶液。将该混合物在-78℃下搅拌45分钟。在冷的混合物中加入一份于干THF(100ml)中的2，4，6-三异丙基苯磺酰叠氮化物(67g，216mmol)溶液，2分钟后再加入冰醋酸(50ml，860mmol)。将该混合物在35-45℃下保温并搅拌1小时。减压除去挥发性物质。用己烷/EtOH(4∶1，1.7L)研制黄色残留物。用滤膜收集所得白色固体。将滤过液与SiO2混合(230-240目)。减压除去挥发性物质，将残留固体在35℃下减压干燥以除去异丙基苯。然后再将残留固体置于SiO2柱上。用己烷-EtOAc(9∶1)洗脱残留的固体和SiO2，浓缩洗脱液即可得到3-{{2(S)-叠氮基-1-氧代-2-{1-{(苯甲氧基)-羰基}环戊基}-乙基}-4(S)-(1-甲基乙基)-2-噁唑烷酮(66g，86％)。
将所得化合物(13.42g，32.4mmol)于THF/H2O(3∶1，608ml)中的溶液冷却至0℃。在冷却的溶液中加入过氧化氢/H2O(3∶7，16.3ml，518mmol的H2O2)，再加入LiOH·H2O(2.86g，68.2mmol)。
将混合物在0℃搅拌45分钟，再用10％(W/V)的亚硫酸钠水溶液(400ml)使之骤冷。加入NaHCO3(1.93g)后，减压浓缩此混合物。通过持续抽提(NaHCO3水溶液/氯仿)20小时可得到手性辅助剂。然后将水相冷却至0℃，通过加入浓HCl使之变为酸性，再用EtOAc抽提。
将抽提物用盐水洗涤，干燥(MgSO4)并减压浓缩就能得到所需化合物的白色固体(8.2g，84％)。该化合物的1H NMR(CDCl3)显示δ1.6-1.8(m，5H)，1.95-2.05(m，2H)，2.20-2.30(m，1H)，4.55(s，1H)，5.12(s，2H)和7.4(m，5H)。
该化合物用于本实施例的(C)部分。(b)NH2-(S)-CH{CH2C(CH3)3}CH2OBzL根据A.Gian-nis和K.Sandhoff，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.，28，218(1989)中的方法，用LiBH4/Me3SiCl还原H-γMeLeu-OH可得氨基醇NH2-(S)-CH{CH2C(CH3)3}CH2OH。将所得化合物(812mg，6.2mmol)与三乙胺(659mg，6.51mmol)及二叔丁基碳酸氢盐(1.42g，6.51mmol)于干THF(15ml)中的混合物在氮气下、4℃时搅拌15分钟，再于室温下搅拌4小时。减压使THF挥发。将残留物溶于EtOAc。将该溶液用10％柠檬酸水溶液、5％NaHCO3水溶液及盐水洗涤。将有机相干燥(MgSO4)，并在减压下浓缩成干品。残留物用闪光色谱法纯化(SiO2，洗脱剂己烷-EtOAc，2∶1)可得到Boc-NH-(S)-CH{CH2C(CH3)3}CH2OH(1.23g，86％)。
将四丁铵亚硫酸盐(106mg)和50％NaOH水溶液(3ml)依次加入Boc-NH-(S)-CH{CH2C(CH3)3}CH2OH(1.23g，5.35mmol)于苄基氯(13ml)的溶液中。将所得混合物在35-40℃下搅拌90分钟，用EtOAc稀释，用H2O和盐水洗涤，干燥(MgSO4)有机相并通过减压除去挥发性物质。将残留物溶于己烷。把该溶液倒在SiO2柱上。用己烷洗脱柱子以除去苄基氯，再用己烷-EtOAc(2∶1)洗脱可得到Boc-NH-(S)-CH{CH2C(CH3)3}CH2OBzl。所得化合物的1H NMR(CDCl3)显示δ0.95(s，9H)、1.42(s，9H)、1.30-1.55(m，2H)、3.42(d.J＝4Hz，2H)、3.88(broad，1H)、4.54(m，3H)、7.23-7.4(m，5H)。将所得化合物(1.28g，3.99mmol)溶于6N HCl/二烷中(10ml)。
将该溶液在氮气下、4℃时搅拌45分钟。将溶剂挥发可得到所需化合物的盐酸盐(1.05g)。此化合物在本实施例的下一步骤中不需进一步纯化即可使用。(c)本实施例的标题化合物按照实施例1的连接步骤，使用上一部分的NH2-(S)-CH{CH2C(CH3)3}CH2OBzl的盐酸盐作为第一反应物，本实施例(a)部分的(S)-α-叠氮基-1-{(苯甲氧基)羰基}-环戊烷乙酸作为第二反应物即可得到N-{(S)-1-苄氧甲基-3，3-二甲基-丁基}-(S)-α-叠氮基-1-{(苯甲氧基)羰基}-环戊烷乙酰胺。根据N.Maiti等、Tetrahedron Letters，27，1423(1986)中的方法，用溶于MeOH中的氯化锡(II)还原所得化合物即可得到本实施例的标题化合物。该化合物的1H NMR(CDCl3)显示δ0.98(s，9H)、1.22-2.25(m，12H)、3.4(d.J＝4Hz，2H)、3.64(s，1H)、4.18(broad m，1H)、4.52(s，2H)、5.12(s，2H)、7.18(d，J＝7Hz，1H)、7.22-7.38(broad m，10H)。实施例3制备(PhCH2)2CHC(O)-(N-Me)-Val-Tbg-Asp(1-吡咯烷基)-Asp(cyPn)-γMeleucinol(式1，A＝2-(苯甲基)-3-苯丙酰基，B＝N-Me-Val，D＝Tbg，R1＝1-吡咯烷基，R2和R3和与它们结合的碳原子一起形成环戊基，而E＝NHCH(R9)-Z其中R9是2，2-二甲基丙基，Z＝CH2OH)(a)制备中间体Boc-(N-Me)-Val-Tbg-Asp(1-吡咯烷基)-Asp(cyPn)(Bzl)-NH-(S)-CH{CH2C(CH3)3}CH2OBzl根据P.L.Beaulieu等在1991年12月18日的欧洲专利申请461,546中的描述，按照实施例1中的连接步骤，将实施例2的标题化合物(第一反应物)与Boc-Asp(1-吡咯烷基)-OH(第二反应物)相连接可得到Boc-Asp(1-吡咯烷基)-Asp(cyPn)-NH-(S)-CH{CH2C(CH3)3}CH2OBzl。依次将所得化合物脱保护(6N HCl/二噁烷，45分钟，4℃)并在类似条件下与Boc-Tbg-OH相连接可得到Boc-Tbg-Asp(1-吡咯烷基)-Asp(cyPn)-NH-(S)-CH{CH2C(CH3)3}CH2OBzl。随后将所得化合物除去Boc保护基团(6N HCl/二噁烷，4℃，45分钟)可得到以其相应盐酸加成盐形式存在的相应的游离N-末端氨基衍生物。然后将所得氨基衍生物在类似条件下与Boc-(N-Me)-Val-OH相连接可得到所需的中间体。(b)制备标题化合物将上述(a)部分的产物在6N HCl/二噁烷(4℃，45分钟)中转化成其相应的游离N-末端氨基衍生物。将该氨基衍生物的盐酸加成盐(447mg，0.490mmol)溶解于CH2Cl2(1.5ml)中。在氮气下向溶液中加入N-甲基吗啉(200μl，1.83mmol)和二苄基乙酰基氯(269mg，1.04mmol)。将混合物在室温下搅拌7小时，然后减压蒸发掉挥发性物质。将残留物溶于EtOAc中。依次用1N HCl水溶液、NaHCO3的饱和水溶液以及盐水洗涤此溶液，干燥(MgSo4)并减压浓缩。将残留物溶于EtOH(5ml)中。在氢气下(1大气压)，10％(W/V)Pd(OH)2/C(100mg)存在时，将溶液搅拌(磁力搅拌)22小时。在滤膜上收集催化剂，将滤过液浓缩成干品。将残留物通过C-18反相柱HPLC纯化，所使用的是乙腈和H2O的梯度，每种溶剂含有0.06％三氟乙酸，最终可得标题化合物的白色固体(220mg)；1HNMR(DMSO-d6，400MHz，需说明此化合物在DMSO中存在方式为4∶1的旋转异构体混合物)δ0.16(d，J＝6.5Hz，0.6H)、0.22(d，J＝6.5Hz，2.4H)、0.71(d，J＝6.5Hz，2.4H)、0.75(d，J＝6.5Hz，0.6H)、0.80(s，1.8H)、0.82(s，7.2H)、0.87(s，9H)、1.40-1.55(m，7H)、1.65-2.00(m，8H)、2.52-3.90(m，13H)、2.70(s，2.4H)、2.89(s，0.6H)、4.21(d，J＝9.5Hz，0.8H)、4.34(d，J＝9.5Hz，0.2H)、4.43(d，J＝11Hz，与来自较少的旋转异构体的信号相重叠，1H)，4.65-4.73(m，1H)、4.82(d，J＝10Hz，与来自较少的旋转异构体的信号相重叠，1H)、7.04-7.40(m，10.8H)、7.57(d，J＝8.5Hz，1H)、8.01(d，J＝10Hz，与来自较少的旋转异构体的信号相重叠，1H)、8.25(d，J＝9.5Hz，0.2H)、8.30(d，J＝7.5Hz，0.8H)、8.51(d，J＝7.5Hz，0.2H)；FAB质谱m/z939(M＋Na) 。实施例4制备一些典型的中间体以详细描述式1肽的C-末端(a)NH2-(R)-CH(C2H5)C(CH3)3在4，4-二甲基-3-戊酮(106g，0.928mol)、三乙胺(513ml，3.68mol)和(R)-α-甲苄胺(114g，0.940mol)于干苯(1L)的冷却溶液内加入苯(200ml)溶液中的TiCl4(50.5ml，0.459mol)，加入的速率应使混合物的温度低于10℃。然后将混合物在40℃机械搅拌3小时，冷却至室温并用硅藻土过滤。用Et2O洗涤硅藻土。浓缩合并的滤过液及洗液。将残留物溶于无水MeOH(2L)中。将溶液冷却至0℃。分批加入NaBH4(20g，0.53mol)，同时将混合物的温度保持在5℃以下。加入约2ml10％HCl水溶液并蒸发掉MeOH。将残留物溶于Et2O中。将溶液用盐水洗涤，干燥(MgSO4)并蒸发至干品可得到带红色的油状物(由NMR显示出它为18∶1的非对映异构体混合物)。用闪光色谱法纯化此油状物(SiO2、洗脱液EtOAc/己烷、7∶93)可得到N-(1(R)-苯乙基)-1(R)-乙基-2，2-二甲基丙基胺的液体(110g，54％)。将此物质溶于己烷(1.5L)中。在15分钟的期间内向溶液中加入于二噁烷中的6N HCl(90ml)。将所得白色固体收集在滤膜上，然后用己烷洗涤即可得到N-(1(R)-苯乙基)-1(R)-乙基-2，2-二甲基丙基氯化氢(125g，97％)。1H NMR(CDCl3)δ0.55(t，J＝7.5Hz，3H)、1.14(s，9H)、1.54-1.95(m，2H)、2.23(d，J＝6.5Hz，3H)、2.36-2.44(m，1H)、4.31-4.49(m，1H)、7.30-7.48(m，3H)、7.74-7.79(m，2H)。
将溶于MeOH(120ml)中的所得化合物(41.5g)溶液与10％(W/W)Pd/C(4.0g)相混合，将混合物置于帕尔氢气发生器上，在室温下，50psi的氢气中振荡48小时。过滤混合物并浓缩滤过液即可得到所需NH2-(R)-CH(C2H5)C-(CH3)3的盐酸加成盐形式的白色固体(25g，100％)。1H NMR(CDCl3δ1.10(s，9H)、1.22(t，J＝7Hz，2H)、1.58-1.90(m，2H)、2.70-2.85(m，1H)、8.10-8.40(broad s，3H)。
在上述步骤中，以同样的方式，只是用3，3-二甲基-2-丁酮取代4，4-二甲基-3-戊酮即可得到NH2-(R)-CH(CH3)C(CH3)3·HCl。实施例5对单纯性疱疹病毒1型(HSV-1)的核苷酸还原酶的抑制作用(a)酶的制备根据E.A.Cohen等，J.Gen.Virol.，66，733(1985)的描述从被HSV-1F品系病毒感染的静止期的BHK-21/C13细胞中可得到HSV-1核苷酸还原酶(部分被纯化)，感染率为每个细胸10个噬菌斑形成单位。(b)测定P.Gaudreau等在J.Biol.Chem.，262，12413(1987)中描述的测定法被用来评价本发明化合物抑制HSV-1核苷酸还原酶的活力。结果表示为引起酶活性最大抑制50％(IC50)时的化合物浓度，根据酶制品的特殊活性，在每次测定中所用酶制品的单位数是不变的。该结果是相对于没有待测化合物的对照实验中所得活性来说的，代表它们之间相差不到10％的四次测定的平均值。
当根据上述测定法评价实施例3中的(PhCH2)2CHC(O)-(N-Me)-Val-Tbg-Asp(1-吡咯烷基)-Asp(cyPn)-γMeLeucinol时，导致HSV-1核苷酸还原酶活性降低50％的化合物浓度，即IC50，为0.17μm。实施例6对单纯性疱疹病毒2型(HSV-2)在细胞培养中复制的抑制测检将BHK-21/C13细胞(ATCC CCL 10)在150cm2三角锥瓶(1.5×106个细胞/瓶)中培育两天，所用培养基为加有8％(V/V)小牛血清(FBS.Gibco Canada Inc.)的α-MEM培养基(Gibco Canada Inc.，Burlington，Ontario，Canada)。细胞经胰酶消化再转移到24孔培养板的新鲜培养基中以使每孔750μl的培养基中有2.5×105个细胞。将细胞在37℃下培养6小时以使它们附着在培养板上。然后，用500μl加有0.5％(V/V)FBS的α-MEM将细胞洗涤一次，再用750μl同样的培养基(低血清)培养3天。血清饥饿期过后，除去低血清培养基，将细胞在500μl BBMT中培养2至3小时{BBMT培养基由P.Brazeau等描述于Prac.Natl.Acad.Sci.USA，79，7909(1982)}。然后，在100μl BBMT培养基中用HSV-2感染细胞(感染复数＝0.02空斑形成单位/细胞)(注所用HSV-2为HG-52品系，见Y.Lange-lier和G.Buttin，J.Gen.Virol.，57，21(1981)；该病毒被保存于-80℃下。)在37℃下进行病毒吸收1小时后，除去培养基，用BBMT(3×250μl)洗涤细胞。每孔中的细胞与或不与(对照)溶于200μl BBMT培养基中的适当浓度的待检测剂一起温育。在37℃下培养29小时后，通过先在-80℃下冷冻培养板，再解冻来收获被感染的细胞。由于融化的冰晶的作用，可将孔中的细胞从孔表面刮下来。解冻完成后，收集细胞悬浮液，用150μl BBMT培养基冲洗每个孔。将病毒样品(悬浮液加上洗涤液)在4℃下轻微超声处理4分钟。通过离心(1000g，4℃，10分钟)除去细胞碎片。收集上清液，保存于-80℃下直至测定病毒效价。
病毒的滴定是通过R.Deziel和Y.Guindon(前述文献)详细描述的经修改的比色测定法进行的，比色测定法是经M.Langlois等人描述于Journal of Biological Standardization，14，201(1986)。
因而，可测定不同浓度待检测剂对病毒生长抑制的百分率，并可计算出能达到病毒复制50％抑制的待检测剂(即式1肽)的浓度，即EC50。
当根据本实施例的细胞培养测定法来测定实施例3中的(PhCH2)2CHC(O)-(N-Me)-Val-Tbg-Asp(1-吡咯烷基)-Asp(cyPn)-γMeLeucinol时，发现能达到HSV-1病毒复制的50％抑制的浓度，即EC50，为3μM。
根据本发明所用的式1化合物的其它特别的例子为(PhCH2)2CHC(O)-(N-Me)-Val-Tbg-Asp(1-吡咯烷基)-Asp-(cyPn)-γMeLeu-OH，(PhCH2)2CHC(O)-(N-Me)-Val-Tbg-Asp(1-吡咯烷基)-Asp-(cyPn)-NHCH2C(CH3)3以及(PhCH2)2CHC(O)-(N-Me)-Val-Tbg-Asp(1-吡咯烷基)-Asp-(cyPn)-NH-(R)-CH(C2H5)C(CH3)3。
权利要求
1.式1肽或其可用于治疗的盐，A-B-D-NHCH{CH2C(O)R1}C(O)-NHCH{CR2(R3)C(O)OH}C(O)-E1其中A是双取代的低级烷酰基，其中该每个取代基分别选自含有苯基和单取代苯基的一组基团，其中该单取代基选自含有低级烷基、卤基、羟基和低级烷氧基的一组基团；B是N(CH3)CHR4C(O)其中R4是低级烷基；D是NH-CHR5C(O)其中R5是低级烷基或被羧基、羟基、巯基或苄氧基单取代的低级烷基；R1是低级烷基、低级环烷基、{1-(低级烷基)-(低级环烷基)}，或NR6R7其中R6是氢或低级烷基而R7是低级烷基，或者R6和R7与它们共用的氮原子一起形成1-吡咯烷基、哌啶子基、吗啉代或4-甲基1-哌嗪基；R2是氢或低级烷基而R3是低级烷基，或R2和R3与它们共用的碳原子一起形成低级环烷基；而E是NHR8其中R8是(4-9C)烷基；低级环烷基；被低级烷基或(低级烷基)-(低级环烷基)单取代或双取代的低级环烷基；或E是NHCH(R9)-Z其中R9是(4-9C)烷基、低级环烷基或(低级环烷基)-(低级烷基)而Z是CH2OH、C(O)OH、C(O)NH2或C(O)OR10其中R10是低级烷基。
2.一种如权利要求1所述的肽或其可用于治疗的盐，其中A是被苯基、4-(低级烷基)苯基、4-卤苯基或4-(低级烷氧基)苯基双取代的低级烷酰基；B是(N-Me)Val、(N-Me)Ile、(N-Me)Tbg；D是(S)-2-氨基-3-羟基-3-甲基丁酸或(R)-2-氨基-3-巯基-3-甲基丁酸的氨基酸残基或者是选自Val、Ile和Tbg的氨基酸残基；R1是低级烷基、低级环烷基、{1-(低级烷基)-(低级环烷基)}、N，N-二甲基氨基、N，N-二乙基氨基、1-吡咯烷基或吗啉代；R2和R3如权利要求1中所述；而E是NHR8其中R8是(4-9C)烷基；低级环烷基；被低级烷基单取代或双取代的低级环烷基；或(低级烷基)-(低级环烷基)；或者E是NHCH(R9)-Z其中R9是(4-9C)烷基或(低级环烷基)甲基而Z如权利要求1中所述。
3.一种如权利要求2中所述的肽或其可用于治疗的盐，其中A是2-(苯甲基)-3-苯丙酰基、2-{(4-氟苯基)甲基}-3-(4-氟苯基)丙酰基、2-{(4-甲氧苯基)甲基}-3-苯丙酰基或2-{(4-甲氧苯基)甲基}-3-(4-甲氧苯基)丙酰基；B是(N-Me)-Val或(N-Me)-Ile；D是Val，Ile或Tbg；R1是1-甲基乙基、1，1-二甲基乙基、1，1-二甲基丙基、环丁基、环戊基、环己基、1-甲基环戊基、N，N-二甲基氨基、N，N-二乙基氨基、1-吡咯烷基或吗啉代；R2是氢而R3是甲基、乙基、1-甲基乙基、1，1-二甲基乙基或丙基，承载R2和R3的碳原子是(R)-构型，或者R2和R3各自独立地是甲基或乙基，或者R2和R3与它们共用的碳原子一起形成环丁基、环戊基或环己基；而E是NHR8其中R8是2，2-二甲基丙基、1(R)2，2-三甲基丙基、1(R)-乙基-2，2-二甲基丙基、2，2-二甲基丁基、3，3-二甲基丁基、1(R)，2，2-三甲基丁基、1(R)，3，3-三甲基丁基、1(R)-乙基-3，3-二甲基或环己基甲基；或者E是NHCH(R9)-Z，其中承载R9的碳原子是(S)-构型，R9是1，1-二甲基乙基、1-甲基丙基、2-甲基丙基、2，2-二甲基丙基或环己基甲基而Z是CH2OH、C(O)OH、C(O)NH2或C(O)OR10其中R10是甲基、乙基或丙基。
4.一种如权利要求3所述的肽或其可用于治疗的盐，其中A是2-(苯甲基)-3-苯丙酰基；B是(N-Me)Val；D是Tbg；R1是1-甲基乙基、1，1-二甲基乙基、1-甲基丙基、1，1-二甲基丙基、2，2-二甲基丙基、环丁基、环戊基、环己基、1-甲基环戊基、1-吡咯烷基或吗啉代；R2是氢而R3是甲基、乙基、1-甲基乙基或丙基，承载R2和R3的碳原子是(R)-构型，或者R2和R3各自独立地是甲基或乙基，或者R2和R3与它们的共用碳原子一起形成环丁基、环戊基或环己基；而E是NHR8其中R8是2，2-二甲基丙基、1(R)，2，2-三甲基丙基、1(R)-乙基-2，2-二甲基丙基、2，2-二甲基丁基或1(R)-乙基-3，3-二甲基丁基，或者E是NHCH(R9)-Z，其中承载R9的碳原子是(S)-构型，R9是2，2-二甲基丙基而Z是CH2OH、C(O)OH、C(O)NH2或C(O)OR10其中R10是甲基、乙基或丙基。
5.一种如权利要求1所述的肽选自(PhCH2)2CHC(O)-(N-Me)-Val-Tbg-Asp(1-吡咯烷基)-Asp-(cyPn)-γMeLeucinol，(PhCH2)2CHC(O)-(N-Me)-Val-Tbg-Asp(1-吡咯烷基)-Asp-(cyPn)-γMeLeu-OH，(PhCH2)2CHC(O)-(N-Me)-Val-Tbg-Asp(1-吡咯烷基)-Asp-(cyPn)-NHCH2C(CH3)3，以及(PhCH2)2CHC(O)-(N-Me)-Val-Tbg-Asp(1-吡咯烷基)-Asp-(cyPn)-NH-(R)-CH(C2H5)C(CH3)3。
6.一种药物组合物，包含抗疱疹病毒有效剂量的如权利要求1所述的肽或其可用于治疗的盐和可药用或可兽医用的载体。
7.一种如权利要求6所述的药物组合物，其中该肽选自(PhCH2)2CHC(O)-(N-Me)-Val-Tbg-Asp(1-吡咯烷基)-Asp-(cyPn)-γMeLeucinol，(PhCH2)2CHC(O)-(N-Me)-Val-Tbg-Asp(1-吡咯烷基)-Asp-(cyPn)-γMeLeu-OH，(PhCH2)2CHC(O)-(N-Me)-Val-Tbg-Asp(1-吡咯烷基)-Asp-(cyPn)-NHCH2C(CH3)3，以及(PhCH2)2CHC(O)-(N-Me)-Val-Tbg-Asp(1-吡咯烷基)-Asp-(cyPn)-NH-(R)-CH(C2H5)C(CH3)3。
8.一种化妆品组合物，包含权利要求1所述肽或其可用于治疗的盐以及适于局部施用的生理上可接受的载体。
9.一种治疗哺乳动物疱疹病毒感染的方法，包括给哺乳动物施用抗疱疹病毒有效剂量的如权利要求1所述的肽或其可用于治疗的盐。
10.一种如权利要求9的方法，其中该肽选自(PhCH2)2CHC(O)-(N-Me)-Val-Tbg-Asp(1-吡咯烷基)-Asp-(cyPn)-γMeLeucinol，(PhCH2)2CHC(O)-(N-Me)-Val-Tbg-Asp(1-吡咯烷基)-Asp-(cyPn)-γMeLeu-OH，(PhCH2)2CHC(O)-(N-Me)-Val-Tbg-Asp(1-吡咯烷基)-Asp-(cyPn)-NHCH2C(CH3)3，以及(PhCH2)2CHC(O)-(N-Me)-Val-Tbg-Asp(1-吡咯烷基)-Asp-(cyPn)-NH-(R)-CH(C2H5)C(CH3)3。
11.一种抑制疱疹病毒复制的方法，通过将病毒与疱疹病毒核苷酸还原酶抑制剂量的权利要求1所述肽或其可用于治疗的盐相接触来实现。
12.一种如权利要求11的方法，其中肽选自(PhCH2)2CHC(O)-(N-Me)-Val-Tbg-Asp(1-吡咯烷基)-Asp-(cyPn)-γMeLeucinol，(PhCH2)2CHC(O)-(N-Me)-Val-Tbg-Asp(1-吡咯烷基)-Asp-(cyPn)-γMeLeu-OH，(PhCH2)2CHC(O)-(N-Me)-Val-Tbg-Asp(1-吡咯烷基)-Asp-(cyPn)-NHCH2C(CH3)3，以及(PhCH2)2CHC(O)-(N-Me)-Val-Tbg-Asp(1-吡咯烷基)-Asp-(cyPn)-NH-(R)-CH(C2H5)C(CH3)3。
13.一种药物组合物，包含可药用或可兽医用载体，以及有效剂量的抗病毒的核苷类似物或其可用于治疗的盐与可抑制核苷酸还原酶的如权利要求1所述的肽或其可用于治疗的盐。
14.一种如权利要求13所述的药物组合物，其中该核苷类似物是式2所示的化合物或其可用于治疗的盐 其中R11是氢、羟基或氨基。
15.一种如权利要求13的药物组合物，其中该抗病毒核苷类似物是选自阿糖腺苷、碘苷、trifluridine、ganciclovir、edoxudine、brovavir、fiacitabine、penciclovir、famciclovir以及rociclovir。
16.一种治疗哺乳动物中疱疹病毒感染的方法，包括施用有效剂量的抗病毒核苷类似物或其可用于治疗的盐与可抑制核苷酸还原酶的如权利要求1的式1肽或其可用于治疗的盐的联合。
17.一种如权利要求16的方法，其中该核苷类似物以及式1肽可依次施用或同时施用。
18.一种如权利要求16的方法，其中该组合物被局部施用。
19.一种如权利要求16的方法，其中抗病毒的核苷类似物选自无环鸟苷、6-脱氧无环鸟苷、2，6-二氨基-9-{(2-羟基乙氧基)甲基}嘌呤、阿糖腺苷、碘苷、trifluridine、gangciclovir、edoxudine、brovavir、fiacitabine、penciclovir、famciclovir以及rociclovir。
20.一种治疗哺乳动物中单纯性疱疹病毒1型或2型感染的方法，包括施用有效剂量的如权利要求6的药物组合物，其中该组合物中的肽是(PhCH2)2CHC(O)-(N-Me)-Val-Tbg-Asp(1-吡咯烷基)-Asp-(cyPn)-γMeLeucinol。
21.一种制备如权利要求1所述肽或其可用于治疗的盐的方法，包括a)按照肽的序列逐步连接氨基酸或衍生的氨基酸残基以及此肽的非肽片段，其中i)将残基或片段的活性侧链基团用适当的保护基团保护以防止该位点化学反应的发生，直至逐步连接完成后保护基团最终被除去；ii)将连接反应物的α-氨基基团用α-氨基保护基团保护，而该反应物的游离羧基与第二反应物的游离α-氨基基团相连接；该α-氨基保护基团为一个可被选择性地除去的保护基，以使随后的连接步骤可在此α-氨基基团处发生；以及iii)将要成为被保护肽的C-末端的氨基酸残基或肽片段的C-末端羧基，如果存在，需用适当的保护基团保护以防止此位点化学反应的发生，直至此肽合乎需要的氨基酸序列被组装完毕；以及b)连接完成后，除去任何保护基团以及，如有必要，使之进行常规转化以得到如权利要求1所述的肽；以及如有必要将此肽转变为其可用于治疗的盐。
全文摘要
此处公开了如式A-B-D-NHCH{CH
文档编号C07K7/06GK1118601SQ94191343
公开日1996年3月13日 申请日期1994年2月28日 优先权日1993年3月3日
发明者罗伯特·德兹伊尔, 尼尔·莫斯 申请人:比奥-梅加/贝林格尔·英格海姆研究公司
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