专利名称：酶抑制剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及异硫脲衍生物、其制备方法、含这些衍生物的医药制剂，以及它们在疾病治疗方面的应用，特别是它们作为一氧化氮合成酶抑制剂的应用。
自20世纪80年代起，人们已知，乙酰胆碱所致的血管舒张同内皮的存在有关，而这种活性被归因于所谓内皮衍化舒张因子(EDRF)的易变性体液因子。一氧化氮(NO)作为血管舒张药的活性，为人们所知已逾百余年，而且NO还是亚硝酸戊酯、三亚硝酸甘油酯及其它硝基血管舒张药的活性组分。近来鉴别出EDRF为NO，这正好同发现NO由酶即NO合成酶用氨基酸L-精氨酸合成的生物化学途经不谋而合。
NO是可溶性鸟嘌吟核苷酸酯(盐)环化酶的内生刺激素，并参与除了内皮依赖性舒张以外的许多生物作用，包括吞噬细胞的细胞毒性和中枢神经系统细胞之间的交流(见Moncada等，Biochemical Pharmacology，38，1709-1715(1989)，及Moncada等，Pharmacological Review，43，109-142(1991))。现在，人们认为，在许多疾病中，有可能产生过量NO，尤其是涉及系统性低血压(systemic hypotension)如败血(毒)性休克及用某些细胞素来治疗的疾病。
由L-精氨酸合成NO，可为类似于L-N-单甲基精氨酸(L-NMMA)的L-精氨酸所抑制，因而已有人提议(WO 91/04024及GB-A-2240041)用L-NMMA来治疗败血性休克和其它类型的系统性低血压。除L-NMMA之外，某些其它用于同一目的NO合成酶抑制剂在治疗上的应用，也已在WO 91/04024及EP-A-0446699中提出。
最近已搞清楚，NO合成酶至少有以下三类(ⅰ)位于内皮中的一种基本的Ca /调钙蛋白依赖性酶，它在应答受体或物理刺激时释出NO。
(ⅱ)位于脑内的一种基本的Ca /调钙蛋白依赖性酶，它在应答受体或物理刺激时释出NO。
(ⅲ)在血管平滑肌、巨噬细胞内皮细胞及许多其它细胞被内毒素及细胞素活化后所诱导的一种Ca 非依赖性酶。这种可诱导性NO合成酶，一旦被表达，即会长期合成NO。
由各种基本的酶所释出的NO，起着服从转导机理的一些生理应答的作用。由可诱导酶产生的NO，则起着克制肿瘤细胞和入侵微生物的细胞毒素分子作用(Wright等，Card.Res.26，48-57(1992)及Moncada等，Pharmacological Review，43，109-142(1991))。也似乎表明，产生过多NO的不良作用，尤其是病理性血管舒张及组织损伤，有可能主要由可诱导NO的合成酶所合成的NO的作用所引起。
至今，人们所提议供治疗应用的NO合成酶抑制剂，尤其是L-NMMA，不具选择性，它们既抑制基本的NO合成酶，又抑制可诱导的NO合成酶。使用这样一种无选择性的NO合成酶抑制剂，需要非常小心，以免因过度抑制基本的NO合成酶而产生的潜在严重后果，其中包括低血压、血栓形成、CNS毒性及组织损伤。特别是，在将L-NMMA在治疗上应用来医治败血性休克时，已推荐在整个治疗过程中，必须连续监测病人的血压。因此，无选择性NO合成酶抑制剂，在适当注意的前提下具有治疗上的实用性，而在抑制可诱导NO合成酶要比抑制基本的NO合成酶具有大得多的选择性的NO合成酶抑制剂，则在治疗上具有更大的好处，并且大大方便了使用。
异硫脲的制备和生物学性质，已在文献中予以报导(Schroeder，Chem.Revs.，1955，55，181;Doherty等，J.Am.Chem.Soc.，1957，79，5667;以及Brand及Brand，Org.Synth.，1942，22，59;Smirk等，Brit.Med.J.1941，510-11;J.Physiol.，1942，100，474-483;Lancet，1942，301-303;J.Physiol.，1943，101，379-388;Fastier，Brit.J.Pharmacol.，1948，3.198)。我们现已发现，异硫脲是NO合成酶的抑制剂，而且可用于治疗系统性低血压，而且特别可用于治疗败血性休克。除此之外，与基本的NO合成酶相比，这些化合物中的许多化合物都对可诱导NO合成酶具有选择性。
因此，本发明提供了一种对需要抑制一氧化氮合成酶的疾病的治疗方法，该方法包括投给哺乳动物有效量的、对NO合成酶具有抑制作用的异硫脲衍生物或其药理学上可采用的盐。另一方面，本发明提出了对NO合成酶具有抑制作用的异硫脲供制造一种有利于抑制NO合成酶的治疗疾病的药物的应用。
更具体来说，本发明提出了一种治疗系统性低血压及/或败血性休克的方法，该方法包括投给哺乳动物有效量的、对NO合成酶具有抑制作用的异硫脲衍生物或其药理上可采用的盐。另一方面，本发明提出了具有NO合成酶抑制作用的异硫脲衍生物供制造系统性低血压及/或败血性休克的药物的应用。
有利于抑制由L-精氨酸产生NO的另一些情况包括用TNF、IL-1及IL-2之类细胞素进行治疗，或者用细胞素诱导剂如5，6-二甲基吨酮乙酸进行的治疗，以及在移植治疗中作短期免疫抑制辅剂。此外，抑制NO合成的化合物还可用来降低患有过量NO促进疾病理生理学的炎症疾病如成人呼吸窘迫综合症(ARDS)及心肌炎的病人体内的NO浓度。
还有证据表明，NO合成酶可能参与自体免疫及/或炎性疾病如关节炎、类风湿性关节炎、慢性肠道病及系统性红斑狼疮(SLE)中发生的软骨变性。人们还认为，NO合成酶可能参与胰岛素依赖性糖尿病。因此，本发明的再一方面，提供了异硫脲衍生物或其盐，以制造用来进行细胞素或细胞素诱导治疗、在移植治疗中作短期免疫抑制辅剂，供治疗患有过量NO促进病症病理生理学的炎性疾病病人、用于自体免疫及/或炎性适应症及胰岛素依赖性糖尿病的药物。
再有一个方面是，提供了治疗与细胞素治疗相关的不良作用，移植治疗中短期免疫抑制的，治疗患有过量NO促进病症病理生理学的炎性疾病病人的，治疗自体免疫及/或炎性症状疾病及治疗胰岛依赖性糖尿病的方法，该方法包括投给需要的哺乳动物有效量的、对NO合成酶具有抑制作用的异硫脲衍生物或其药理学上可采用的盐。
本文中所用的“治疗”病人，意即包括预防;“哺乳动物”意即包括人或动物。
优选的异硫脲包括式(Ⅰ)
所示的异硫脲或其盐，式中R为(1)一个C1-14烃基;或(2)一个5-节和6节的杂环;或(3)一个9节双杂环系上述各R基团可为一或二个各自分别选自下列基团的基团所取代(a)卤;
(b)-XR1，其中X为氧;C(O)m，式中m为1或2;S(O)n，式中n为0、1或2;或者NR2，式中R2为氢、C1-6烷基或C3-6环烷基，或者R2连到R1上，形成一个C2-6亚烷基;
R1为氢;或C1-6烷基、C2-6链烯基、C3-6环烷基、C7-9芳烷基、C6-10芳基、或者一个5节或6节杂环基团，上述各基团可任选地为一个或二个各自分别选自下列基团的基团所取代C1-3烷基、羟基、C1-3烷氧基团、氨基、C1-3烷基氨基、卤、硝基、或者C(O)m′R2b基团，式中m′为1或2，R2b为氢或C1-4烷基;或者R1为一个NR3R4基团，式中R3和R4可以相同或不同，且各为氢或C1-4烷基，或者R3和R4相连，形成一个C2-6亚烷基;
基团，式中Y为氧;S(O)n，式中n如上所规定;或NR5，式中R5为氢或C1-4烷基;
W为0或1;
Q为C2-4烃基;
或者亚氨基氮连接到R基团或Q基团上，形成一个5节或6节杂环;或者(d)一个基团A，其中A是一个杂环系，它可任选地为如上定义的基团
所取代;或者(e)C1-6烷基、C2-6链烯基或链炔基或者C3-6环烷基;或者R中，碳原子之一连到式(Ⅰ)所示化合物中的亚氨基氮原子上，形成一个5节或6节杂环;条件为R不是甲基。
适宜的R为(1)C1-8烷基;
(2)C2-8链烯基或链炔基;
(3)一个-(CH2)p
CH3基团，其中p为0至4，q为0至3;或者(4)一个5节或6节杂环，上述各基团可被一个或二个相同或不同的下列基团所取代(a)卤素，(b)OR2b，其中R2b如上所定义;
(c)C(O)mR2b，其中m及R2b如上所定义;
(d)S(O)nR6，其中n如上所定义，R6为C1-4烷基，该烷基任选地被一个或二个各自分别选自氨基或如上定义的C(O)mR2b基团所取代;
(e)NR7R8，其中R7及R8及自分别选自氢、C1-4烷基、C2-4链烯基、C1-4烷氧烷基，或者R7及R8相连，形成一个5节或6节杂环;
(f)一个苯环或一个5节或6节杂环，它可任选地被如上所定义的一个OR2b基团所取代，或者被一个
基团所取代，其中Q如上所定义;或者亚氨基氮与基团Q相连，形成一个噻唑或噻唑啉环;或者(g)C1-4烷基，条件是R为一个杂环;或者R中的一个碳原子连到式(Ⅰ)所示化合物中的亚氨基氮上，形成一个噻唑或噻唑啉环。
最适宜的R为(1)C1-4烷基;
(2)C2-4链烯基，(3)一个
CH3基团，其中p为1或2，q为0或1;或者(4)一个5节或6节杂环，其中含有一或二个氮原子;
上述各基团可任选地被一个或二个相同或不同的下列基团所取代(a)卤，优先为溴;
(b)一个OR2b′基团，其中R2b′为氢或甲基;
(c)一个C(O)mR2b′基团，其中m及R2b′如上所定义;
(d)一个SR9基团，其中R9为甲基或乙基;
(e)一个NR7bR8b基团，其中R7b和R8b各自分别选自氢或C1-4烷基，优先为氢、甲基或乙基;
(f)一个可任选地为一个如上所定义的OR2b′或一个
基团取代的苯环;
(g)含有一个或二个各自分别选自氮或氧的杂原子的5节或6节杂环;或者(h)C1-4烷基，优先为甲基;
或者R中的一个碳原子连到式(Ⅰ)所示化合物的亚氨基氮上，形成一个噻唑或噻唑啉环。
式(Ⅰ)包括式(ⅠA)、(ⅠB)、及(ⅠC)所示的异硫脲衍生物。
，式中R′为一个C1-8亚烷基，或者一个C2-8亚烯基或亚炔基，它们含或不含一个苯环、一个5节或6节杂环，或者一个如前所定义的X基团，其中虚线代表一个双键或一个单键。
式Ⅰ还包括式(Ⅱ)
所示的化合物或其盐，式中Ra为一个C1-8烃基，或者5节或6节杂环，或者一个9节双环杂环系，它们各自任选地被卤素或者一个或二个-XaR1a基团所取代，其中R1a为氢、C1-6烷基、C3-6环烷基、C7-9芳烷基、C6-10芳基，或者一个5节或6节杂环基团，该杂环基团任选地被C1-3烷基、C1-3烷氧基、氨基、卤素或硝基所取代，或者R1a为一个NR3aR4a基团，其中R3a和R4a或同或不同，且各为氢或C1-3烷基，或者R3a和R4a相连，形成一个C2-6亚烷基，且Xa为氧;C(O)ma，其中ma为1或2;S(O)na，其中na为0、1或2;或者NR2a，其中R2a为氢、C1-6烷基或C3-6环烷基，或者R2a连到R1a上，形成一个C2-6亚烷基，或者为一个
基团所取代，其中t为0至4，Wa为0或1，Ya为氧、硫及NR7a，其中R7a为氢或C1-4烷基;或者Ra将硫原子连到式(Ⅰ)所示化合物中的一个氮原子上，形成一个5节或6节杂环，条件是Ra不是甲基。
优选的一组化合物，是其中的R不是甲基、乙基、丙基或异丙基的那些化合物。
优选的式(Ⅰ)所示化合物包括S-(2-氨乙基)异硫脲S-(2-(二甲基氨基)丙基)异硫脲S-(2-甲基-2-丙烯基)异硫脲S，S′-亚乙基二(异硫脲)S，S′-1，5-亚戊基二(异硫脲)S-(2-(二甲基氨基)乙基)异硫脲2-氨基-2-噻唑啉S，S′-1，6-亚己基二(异硫脲)S，S′-1，7-亚庚基二(异硫脲)S-苄基异硫脲S-(2-吗啉代乙基)异硫脲S-(6-甲基-2-(甲硫基)-4-嘧啶基)异硫脲S，S′-(1，4亚苯基二(亚甲基)二异硫脲S-叔丁基异硫脲S-(4-乙基苄基)异硫脲S-((甲硫基)甲基)异硫脲S-(3-溴丙基)异硫脲S-(2-溴乙基)异硫脲
S-(3-甲基-2-丁烯基)异硫脲S-烯丙基异硫脲S-(3-氨基丙基)异硫脲S，S′-(1，3-亚苯基二(亚甲基))二异硫脲S，S′-(2-亚甲基-1，3-亚丙基)二异硫脲S，S′-(2-丁炔-1，4-亚基)二异硫脲S，S′-(1，3-亚苯基二(1，2-亚乙基)二异硫脲S，S′-(1，4-亚苯基二(1，2-亚乙基)二异硫脲2-氨基-5-甲基噻唑S-((2-氨基-4-噻唑基)甲基-L-半胱氨酸3-((2-氨基-4-噻唑基)甲基-L-丙氨酸2-氨基-4-甲基噻唑2-氨基-4，5-二甲基噻唑S-(2-(1H-吡咯-1-基)乙基)异硫脲S-(3-羟基丙基)异硫脲S-(2-苯基)乙基)异硫脲S-(2-(3-甲氧基苯基)乙基)异硫脲4-(2-氨基-4-噻唑基)甲基)-L-高丙氨酸N，N-1，3-亚苯基二(亚甲基)二(S-甲基异硫脲)N，N-(1，3-亚苯基二(亚甲基))二(S-乙基异硫脲)S-(2-(5-((脒硫基)甲基)-2-噻吩基)乙基)异硫脲S-(3-(4-((脒硫基)甲基)苯基)丙基)异硫脲S-(3-(5-(2-脒硫基)乙基)-2-噻吩基)丙基)异硫脲
S-(2-(4-氟苯基)乙基)异硫脲S-(2-(4-溴苯基)乙基)异硫脲S-(2-(3-甲氧基苯基)乙基)异硫脲S-(2-(3-甲基苯基)乙基)异硫脲S-(2-(4-乙氧基苯基)乙基)异硫脲S-(2-(4-甲氧基苯基)乙基)异硫脲S-(2-(2-溴苯基)乙基)异硫脲S-(2-(2-氟苯基)乙基)异硫脲S-(2-(3-硝基苯基)乙基)异硫脲S-(3-(1H-吡咯-1-基)丙基)异硫脲S-(2-(2-氯苯基)乙基)异硫脲S-(2-(2，5-二甲基苯基)乙基)异硫脲S-(2-(4-乙氧基-3-甲氧基苯基)乙基)异硫脲，及它们的盐。
特别优选的化合物，包括S，S′-(1，3-亚苯基二(1，2-亚乙基)二异硫脲、S，S′-(1，4-亚苯基二(1，2-亚乙基)二异硫脲、S-(2-(5-脒硫基)甲基)-2-噻吩基)乙基)异硫脲、S-(3-(5-(2-脒硫基)乙基)-2-噻吩基)丙基)异硫脲及S-(2′-(3-甲氧基苯基)乙基)异硫脲。
其它优选用来治疗败血性休克的化合物，为S-乙基异硫脲、S-丙基异硫脲及S-异丙基异硫脲，尤其为S-乙基异硫脲及S-异丙基异硫脲，特别是S-乙基异硫脲。
术语“烃基”基团，意即只含碳原子和氢原子，但可含双键及/或叁键，并且实质上可为环状或芳香族的基团。
术语“杂环”意即含有1至3个选自氧、硫及氮，优选为氮或硫的杂原子的环状化合物。
术语“卤素”意指氟、氯、溴或碘，优选为溴。
式(Ⅰ)所示化合物，包括许多在分子中视各种基团的确切含义而定的不对称中心，而且式(Ⅰ)旨在包括各种可能的异构体。
本发明的另一方面，提供了除苄基异硫脲、S，S(1，4-亚苯基二(亚甲基))二异硫脲及S-(2-(二甲基氨基)乙基)异硫脲之外的、具有抑制NO合成酶作用、用于医药的式(Ⅰ)所示异硫脲或其药物学可接受的盐。
另一方面，本发明提供了如上所定义的式(ⅠA)、(ⅠB)及(ⅠC)所示新化合物。这些化合物包括S，S′-(1，4-亚苯基二(1，2-亚乙基)二异硫脲S-(2-(1H-吡咯-1-基)乙基)异硫脲S-((2-氨基-4-噻唑基)甲基)-L-半胱氨酸γ-(2′-氨基-4-噻唑基)甲基)-L-高丙氨酸S，S′-(1，2-亚苯基二(1，2-亚乙基)二异硫脲β-(2′-氨基-4′-噻唑基)-L-丙氨酸S-(2′氨基-5′-(R，S)-噻唑啉基甲基)-L-半胱氨酸4-((2-氨基-4-噻唑基)甲基)-L-高丙氨酸N，N-(1，3-亚苯基二(亚甲基))二(S-甲基异硫脲)N，N-(1，3-亚苯基二(亚甲基))二(S-乙基异硫脲)S-(3-(4-((脒硫基)甲基)苯基)丙基)异硫脲S-(2-(5-((脒硫基)甲基)-2-噻吩基)乙基)异硫脲S-(3-(5-((2-脒硫基)乙基)-2-噻吩基)丙基)异硫脲S-((2-氨基-4-噻唑基)甲基)-D-半胱氨酸S-((2-氨基-4-噻唑基)甲基)-(D，L)-高半胱氨酸S-(2-(2-氨基-4-噻唑基)乙基)-L-半胱氨酸S-(2-(4-氟苯基)乙基)异硫脲S-(2-(4-溴苯基)乙基)异硫脲S-(2-(3-甲氧基苯基)乙基)异硫脲S-(2-(3-甲基苯基)乙基)异硫脲S-(2-(4-乙氧基苯基)乙基)异硫脲S-(2-(4-甲氧基苯基)乙基)异硫脲S-(2-(2-溴苯基)乙基)异硫脲S-(2-(2-氟苯基)乙基)异硫脲S-(2-(3-硝基苯基)乙基)异硫脲S-(3-(1H-吡咯-1-基)丙基)异硫脲S-(2-(4-乙氧基-3-甲氧基苯基)乙基)异硫脲S-(2-(2，4，6-三甲基苯基)乙基)异硫脲S-(2-(2，6-二甲氧基苯基)乙基)异硫脲及它们的盐。
本发明包括盐形式，尤其酸加成盐形式的异硫脲。适宜的盐包括那些既用有机酸又用无机酸生成的盐。这样的酸加成盐一般都为药理学所接受，虽然药理学上不接受的盐在制备和提纯所涉及化合物时可加以利用。因此，优选的盐包括由盐酸、氢溴酸、硫酸、柠檬酸、酒石酸、磷酸、乳酸、丙酮酸、乙酸、三氟乙酸、琥珀酸、草酸、富马酸、马来酸、草酰乙酸、甲磺酸、乙磺酸、对-甲基苯磺酸、苯磺酸及羟乙磺酸生成的盐。异硫脲的盐，可使游离碱形式的适宜化合物与相宜的酸作用来制取。
本发明的异硫脲虽然可以原化学物质来投药，但以药物制剂形式给药为佳。根据另一方面，本发明提供了一种药物制剂，其中含有本发明的一种异硫脲或一种异硫脲的药理学可用盐或溶剂化物，以及一种或多种药理学可用的载体和任选的一种或多种其它治疗用组分。例如一种抗生素，及/或一种体液补充液。所说载体必须在与其它制剂成分配伍的意义上“可用”，而不得对其受体有害。
制剂包括那些适于经口、胃肠外(包括皮下、皮内、肌内、静脉内及关节内)、直肠及局部(包括皮、口、舌下及眼内)给药剂型，虽然最适宜的用药方案或许取决于例如受药者的病症和障碍。制剂可方便地以单位剂量形式来提供，并可用药物学领域中众所周知的任何方法来制备。所有方法都包括将式(Ⅰ)化合物或其药理学可用的盐或溶合物(“有效成份”)与构成一种或多种辅助成分的载体相互组合的步骤。一般，制剂是通过将有效成分同液态载体或细分散固态载体或固、液二种载体均匀充分混合，然后在必要时将产品成型为所需剂型。
适于经口给药的本发明制剂，可以按分立单位的形式提供，例如胶囊、扁囊剂或片剂，其中各含有预定量的活性成分;例如粉剂或粒剂;例如含水液体或非水液体中的溶液剂或悬液剂;或例如水包油乳液剂或油包水乳液剂。有效成分也可以按大药丸、糖剂或膏剂的形式提供。
片剂可任选地用一种或多种辅助成分通过压制或模塑来制造。压制的片剂，可以在适当的机器中将任选地混有粘合剂，润滑剂，惰性稀释剂，润滑、表面活性或分散剂的自由流动状态如粉末或颗粒的有效成分加压来制造。模塑的片剂，可在适当的机器中模塑经惰性液态稀释剂润湿的粉状化合物来制造。片剂可任选地被包覆或刻痕，并可制成可缓慢或有控制地释效其中有效成分的剂型，供胃肠外给药的制剂包括含水及非水的灭菌注射液，其中可含有抗氧化剂、缓冲剂、制菌剂及能使制剂与受药者血液等渗的溶质;以及水质或非水质灭菌悬液剂，其中可包括悬浮剂和增稠剂。这些剂型可以装在单次剂量或多次剂量的容器如封焊的安瓿及小药瓶中供使用，并可在冻干(真空冷冻干燥)条件下保存，用前只需添加灭菌液态载体，例如盐水、注射用水。作为选择，这些剂型可供连续输注之用。
临时注射液及悬液，可用上述类型的灭菌粉剂、粒剂及片剂来制备。
供直肠用的剂型，可以含有常用载体如可可脂或聚乙二醇的栓剂形式提供。
供口腔内局部，例如颊、舌下给药的剂型包括锭剂，其中在加有调味剂的基料，如加有蔗糖的阿拉伯树胶或黄蓍胶中含有有效成分，以及软锭剂，其中在诸如明胶加甘油或蔗糖加阿拉伯树胶的基料中含有有效成分。
优选的单次剂量剂型是那些含有如下指定有效剂量或其适当分剂量的有效成分的剂型。
应当理解的是，除了上面特别提及的各成分之外，本发明的各剂型中还可包含本领域中常用的、与所讨论剂型种类有关的其它药剂，例如适于经口给药的剂型可含有调味剂。
对上面提及的各种疾病而言，本发明化合物可以0.1-250mg/kg/d的剂量经口或经注射给药。对成人的剂量范围，一般为5mg-17.5g/d，优选为5mg-2g/d，最优选为10mg-1g/d。片剂或其它以分散单位提供的给药形式，可方便地含有适当量的本发明化合物，它以例如含5mg-500mg，通常约10mg-200mg的一次剂量或多次剂量为有效。
式(Ⅰ)所示化合物优选以经口或注射(静脉内或皮下)方式给药。对病人给与化合物的精确用量，是主治医师的责任。然而，所有的剂量则视诸多因素而定，其中包括病人的年令及性别，待治疗的确切病症及其严重程度。同样，给药方案也可视病症及其严重程度而异。
本发明还提供了相似于本领域中已知制备异硫脲衍生物方法的如上所定义新化合物制备方法。
因此，式(Ⅰ)所示化合物或其带保护基团的衍生物，可通过使硫脲与化合物RL(L′)r(式中R如上所定义，L及L′均为离去基团，例如卤原子如溴，r为0或1)反应，需要时随后脱除保护基团来制备。
更具体地说，(ⅰ)如上所定义的式(ⅠA)
所示化合物，可使硫脲与一种其中L、L′及R如上所定义的化合物LRL′反应来制备。适宜的是，该反应在极性溶剂如乙醇中，在20℃至溶剂回流温度下进行。
式LRL′所示化合物可市购而得，或者可用相应的二醇HO-R′-OH，相宜地通过在极性溶剂如二氯甲烷中，在卤化剂如四溴化碳及三苯基膦存在下进行反应来制取。
式HO-R′-OH所示的化合物可市购而得，或者可用本领域中已知的方法来制备。
(ⅱ)如上所定义的式(ⅠB)所示化合物
可将式(ⅠB1)
所示化合物脱除保护基团来制备，式(ⅠB1)中，R′及虚线的定义如上所述，P及P′或同或不同，二者均为保护基团，例如苄基、苄氧羰基或叔丁氧羰基。该反应可在三氟乙酸中，于-20℃至100℃的非极度的温度例如0℃下，在有清除剂分子，例如苯硫基甲烷及1，2-乙二硫醇存在下进行。
当虚线代表单键且取代基在4-位时，式(ⅠB1)所示化合物可用式(ⅠB2)
所示的化合物来制备。式(ⅠB2)中，R′、P及P′如上所定义。叠氮化物还原成胺，并环化成噻唑啉，可在四氢呋喃中，在三苯基膦存在下进行。
式(ⅠB2)所示的化合物，可用式(ⅠB3)
所示的化合物可通过用叠氮化物阴离子在诸如二甲基甲酰胺之类的极性溶剂中，于-20℃-200℃，例如溶剂回流的温度下置换甲苯磺酸盐来制备，式(ⅠB3)中，R、P及P′如上所定义。
式(ⅠB3)所示的化合物的制备，可用式(ⅠB4)
所示(其中R′、P′及P如上所定义)的化合物，通过添加硫氰酸根阴离子以产生一种开环醇盐，该醇盐可以甲苯磺酰衍生物(ⅠB3)的形式被添加的对甲基苯磺酰氯所捕集。式(ⅠB4)所示化合物可用本领域专业人员所知的方法来制备。
当虚线为单键且取代基在5位上时，式(ⅠB1)所示的化合物可用式(ⅠB5)
所示的化合物来制备，其方法是用硫氰酸根阴离子取代甲苯磺酸盐(Tetrahedron Asymmetry 1992，749-752)，该置换反应可在极性溶剂如乙醇中，于-20℃至200℃，例如溶剂回流温度的非极端温度下进行，随后用相似于用式(ⅠB2)化合物制备式(ⅠB)化合物的方法进行环化。式(ⅠB5)的化合物可用相应的环氧化物，以叠氮化物阴离子将其开环，再在极性溶剂如二甲基甲酰胺中，于-20℃至200℃，例如100℃的非极端温度下，用对甲基苯磺酰氯捕集醇盐来制备(Tetrahedron Lett、1990，31(2)，221)。
当虚线代表双键并且噻唑环上的取代基在5位上时，式(ⅠB1)的化合物可通过式(ⅠB6)所示氯乙缩醛
用硫脲环化来制备，在式(ⅠB6)中，R′、P及P′如上所定义，R10为C1-4烷基。该反应可在极性溶剂如丙酮或乙醇中，于-20℃至200℃的非极端温度下进行(Chem.Abs.5414230d)。
式(ⅠB6)所示化合物，可用硫酰氯和式(ⅠB7)
所示的醛来制备，式(ⅠB7)中，R′、P及P′如上所定义(Proc.Indian.Acad.Sci.1941，14A，630-5;Chem Abs.36∶410z)。式(ⅠB7)所示化合物可市购得到，或者可用本领域专业人员已知的方法来制备。
当虚线代表双键并且噻唑环上的取代基在4位上时，式(ⅠB1)所示的化合物，可用本领域已知的方法来制备，例如α-N-苄氧基羰基-β-(2′-氨基-4′-噻唑基)丙氨酸苄酯(Synthetic Communications 1990，20(30)，3097-3102)。
(ⅲ)式(ⅠC)所示化合物
可按如下方法制备(a)当虚线为单键并且取代基在4位上时，用相似于以式(ⅠB4)所示的那些化合物制备式(ⅠB)所示化合物的方法来制备。
(b)当虚线代表单键并且取代基在噻唑啉环的5位上时，用相似于以式(ⅠB5)所示化合物制备式(ⅠB)所示化合物的方法来制备。
(c)当虚线代表双键并且取代基在噻唑啉环的4位上时，通过式(ⅠC1)所示化合物
与硫脲反应来制备。相宜的是，该环化反应可在极性溶剂如丙酮中，于-20℃至200℃，例如20℃的非极端温度下进行。
式(ⅠC1)所示化合物，可以本领域已知的方法，用通式HO2C-R′-CO2H(其中R′如上所定义)所示化合物来制备(J.Chem.Soc.1940，1304-7;Chem.Abs.35∶1133)。
(d)当虚线为双键并且取代基在噻唑啉环的5位上时，用相似于以式(ⅠB6)所示的化合物制备式(ⅠB)所示化合物的方法来制备。
式(Ⅰ)所示化合物作为离体NO合成酶抑制剂的活性，已对照人体胎盘、脑及细胞素诱导的癌细胞中分离出来的NO合成酶，进行了验证。
下面将仅以举例方式来说明本发明实施例1制备S，S′-(1，4-亚苯基二(1，2-亚乙基))二异硫脲二氢溴酸化物将1，4-亚苯基二乙酸(10.0g，51.5mmol)在四氢呋喃(200ml)，中的溶液于0℃和搅拌下滴加到氢化铝锂(3.91g，103mmol)混于四氢呋喃(30ml)而形成的悬浮液中。将该混合物加热回流3小时，然后冷至0℃。缓缓加入水(4.0ml)、15%氢氧化钠(4.0ml)及水(12ml)，使剩余的氢化铝锂骤冷。将悬浮液同硫酸镁一起搅拌5分钟、过滤并浓缩。用硅胶色谱法(乙酸乙酯/己烷梯度50-100%)提纯粗制的油状物，得到透明、无色油状的中间体二醇(7.38g，86%)。将此油状物溶于二氯甲烷(200ml)，所得溶液在0℃下用四溴化碳(32.4g，97.7mmol)及三苯基膦(25.6g，97.7mmol)处理。在20℃下将该混合物搅拌4小时，然后添加戊烷(500ml)。放置15小时后，将溶液从棕色固体物中滗析出来，加以浓缩并以硅胶色谱法(乙酸乙酯/己烷梯度0-20%)提纯，得到油状1，4-亚苯基二(1，2-亚乙基)二溴化物(8.2g，64%)。将该二溴化物(4.0g，13.7mmol)及硫脲(2.09g，27.4mmol)溶于无水乙醇(100ml)所形成的溶液回流加热2小时，冷却并浓缩至干。使初始油状物在乙醇中再结晶，得到白色晶态固体物1，4-亚苯基二(1，2-亚乙基)二异硫脲二氢溴酸盐(2.89g，47%)，溶点＝234-236℃。
1H NMR(200 MHz，D2O)δ7.26(s，4H)，3.38(t，J＝7.0Hz，4H)，3.01(t，J＝7.0Hz，4H)。
C12H20Br2N4S2的分析计算值C，32.44;H，4.54;Br，35.97;N，12.61;14.43。实测值C，32.45;H，4.59;Br，35.89;N，12.51;S，14.35。
实施例2制备S-(2-氨基-4-噻唑基)甲基)-L-半胱氨酸在由2-氨基-4-氯甲基噻唑(Spraque，J.M.等J.Am.Chem.Soc.1946，68，2155-2159)(1.0g，5.4mmol)及L-半胱氨酸盐酸盐(804mg，5.1mmol)溶于二甲基甲酰胺(10mL)所成的溶液中，添加碳酸钾(2.5g)。在22℃下，将该悬浮液搅拌18小时。将所得混合物浓缩至干，重溶于水，并加到离子交换柱(Dowex 50×8，强酸性)上。产物用具有浓度梯度的氢氧化铵(0.1N-0.5N)洗脱。将汇集起来的产物馏分予以部分浓缩并冷干，得棕褐色带静电的固态物S-(2′-氨基-4′-噻唑基甲基)-L-半胱氨酸(1.04g，87%)。
1H NMR(300 MHz，D2O)δ6.5(s，1H)，3.8(m，1H)，3.6(s，2H)，3.05-2.85(m，2H)。
质谱(CI)234(M 1，71%)。
实施例3制备γ-(2′-氨基-4′-噻唑基)-L-高丙氨酸(3-((2-氨基-4-噻唑基)甲基-L-丙氨酸)γ-(2′-氨基-4′-噻唑基)-L-高丙氨酸，按实施例6的方法，用α-N-叔丁氧基羰基-γ-(2′-氨基-4′-噻唑基)-L-高丙氨酸苄酯来制备(Patt等，Synth.Commun.1990，20(20)，3097-3102)，收率为9.6%。
1H NMR(D2O)δ6.5(s，1H)，3.9(t，J＝6.4Hz)，2.75(m，2H)，2.2(m，2H)。
C7H11N3O2S·C2HF3O2·0.3H2O的分析计算值C，29.31;H，2.89;N，8.54;S，6.52。
实测值C，29.37;H，3.02;N，8.53;S，6.63。
实施例4制备S，S′-(1，3-亚苯基二(1，2-亚乙基))二异硫脲二氢溴酸盐按实施例1的方法，用1，3-亚苯基二乙酸(Aldrich)制备S，S′-(1，3-亚苯基二(1，2-亚乙基))二异硫脲二氢溴酸盐。在乙醇中再结晶后，得到白色晶态固体物(熔点 194-190℃)。
1H NMR(200 MHz，D2O)δ7.4-7.2(m，4H)，3.39(t，J＝6.9Hz，4H)，3.02(t，J＝6.9Hz，4H)。
C12H20Br2N4S2的分析计算值C，32.44;H，4.54;Br，35.97;N，12.61;S，14.43。
实测值C，32.52;H，4.49;Br，36.04;N，12.61;S，14.35。
实施例5制备S，S′-(1，2-亚苯基二(1，2-亚乙基))二异硫脲二氢溴酸盐按实施例1的方法，用1，2-亚苯基二乙酸(Aldrich)来制备S，S′-(1，2-亚苯基二(1，2-亚乙基))二异硫脲二氢溴酸盐，产率为30%，产物为黄色泡沫状物。
1H NMR(300 MHz，D2O)δ7.29(s，4H)，3.38(t，J＝7.0Hz，4H)，3.09(t，J＝7.0Hz)。在乙醇中再结晶，得分析用样品，熔点＝205-207℃。
C12H20Br2N4S2的分析计算值C，32.44;H，4.54;Br，35.97;N，12.61;S，14.43。
实测值C，32.47;H，4.58;Br，35.92;N，12.58;S，14.43。
实施例6制备β-(2′-氨基-4′-噻唑基)丙氨酸(3-(2-氨基-4-噻唑基)-L-丙氨酸)在氮气氛和-88℃下，搅拌由α-N-叔丁氧基羰基-β-(2′-氨基-4′-噻唑基)丙氨酸苄酯(1.47g)(Patt等，Synth.Commun.1990，20(20)，2097-3102)溶于二氯甲烷(15ml)所成的溶液，往其中加入三乙基硅烷(3ml)，再加入三氟乙酸(3ml)。将所得溶液在1小时内加热到室温，然后加以浓缩。残留物用乙酸(30ml)、20% Pd/C(2.0g)及1，4-环己二烯(20ml)处理。在2小时内，将上述混合物加以声处理使其从室温升至33℃，并滤过硅藻土，用水洗涤。将滤液浓缩，再溶入30ml乙酸中，并用2.0g新鲜20% Pd/C和2ml 1，4-环己二烯处理。在经声处理2小时后，用硅藻土过滤悬浮液。重复添加新鲜催化剂三次，然后用重复半制备性逆相色谱法(C-18，以10%甲醇/含0.1%三氟乙酸的水进行洗脱)提纯粗产物。冻干产物馏分，得337mg(18%)粘稠玻璃态固体物β-(2′-氨基-4′-噻唑基)-L-丙氨酸。
1H NMR(D2O)δ 6.6(s，1H)，4.0(t，J＝7.6Hz，1H)，3.15(m，2H)。质谱(CI)188(M 1)。
C12H12N3F9O8S的分析计算值C，27.23;H，2.29;N，7.94;S，6.06。
实测值C，27.22;H，2.42;N，7.8;S，5.67。
实施例7S，S′-(2，6-亚吡啶基二(亚甲基))二异硫脲在0℃，向由2，6-吡啶二甲醇(5.0g，35.9mmol)溶于二氯甲烷(200ml)所成的溶液中添加四溴化碳(23.83g，71.9mmol)及三苯基膦(18.85g，71.9mmol)。搅拌溶液，并在6小时内加热至20℃。加入戊烷(300ml)。令溶液在20℃下静置16小时，然后过滤，以除去固体杂质。浓缩滤液至油状物，并以硅胶色谱法(己烷，然后10%乙酸乙酯/己烷)提纯，得灰白色粉未状固体物2，6-吡啶二溴化物(4.47g，47%)。在由2，6-吡啶二溴化物(3.94g，14.87mmol)溶于乙醇(100ml)所成的溶液中，加入硫脲(2.26g，29.74mmol)，在回流条件下，将所成悬浮液搅拌2小时，将所得溶液浓缩至干，得白色粉未状S，S′-(2，6-亚吡啶基二(亚甲基)二异硫脲(5.3g，83.9%)。
1H NMR(200 MHz，DMSO)δ7.95(t，J＝7.6Hz，1H)，7.51(d，J＝7.8Hz，2H)，4.65(s，4H)。
C9H15N5S2Br2·0.6H2O分析计算值C，25.26;H，3.81;N，16.36;S，14.98;Br，37.34。
实测值C，25.3;H，3.78;N，16.25;S，14.94;Br，37.38。
实施例8制备S-(2′-氨基-5′-(R，S)-噻唑啉基甲基)-L-半胱氨酸在由2-氨基-5-碘甲基噻唑啉(4.44g，12mmol)(Creeke & Mellor，Tet.Lett.1989，30(33)，4435-4438)及L-盐酸半胱氨酸(1.76g，10.0mmol)溶于二甲基甲酰胺(75ml)所成的溶液中，添加碳酸钾(5.0g，36mmol)。在22℃下，将悬浮液搅拌72小时，并回流30分钟。加入乙腈并过滤混合物。用温热的甲醇反复洗涤所得的固体物。用乙醇稀释甲醇溶液，产生白色沉淀，并以过滤法除去之。将浓缩后的滤液(油状物)溶入甲醇/乙醇中，并用乙醇盐酸处理，直至再也观察不到沉淀为止，然后过滤混合物。把浓缩滤液所得的油状物用离子交换色谱法(Dowex 50×8，强酸性)处理，用0.1N氢氧化铵洗脱，从而将其提纯。汇集茚三酮正馏分并冻干，得0.453g混杂有二甲基甲酰胺的浅棕褐色固体物。该固体物以制备性HPLC(高压液相色谱法)(C18逆相，甲醇∶水∶三氟乙酸/5∶95∶0.1)提纯，得0.36g三氟乙酸盐形式的S-(2′-氨基-5′-(R，S)-噻唑啉基甲基)-L-半胱氨酸。TLC(氢氧化铵∶甲醇/1∶50)Rf＝0.5。
1H NMR(200 MHz，D2O)δ 4.37-4.24(m，1H)，4.11-3.87(m，3H)，3.27-3.13(m，2H)，3.05-2.97(m，2H)。质谱(FAB)236.0(M 1，48%)。
C7H13N3O2S2·3(C2HF3O2)的分析计算值C，27.04;H，2.79;N，7.28;S，11.11。
实测值C，27.32;H，2.91;N，7.41;S，11.17。
实施例9制备4-((2-氨基-4-噻唑基)甲基)-L-高丙氨酸以Patt等(Synth，Commun.1990，20(20)，3097-3102)的方法，用N-t-Boc-L-2-氨基己二酸1-叔丁酯(Ramsamy等，Synthesis，1982，42-43)制备4-((2-氨基-4-噻唑基)甲基)-Nα-t-Boc-L-高丙氨酸叔丁酯，总产率为45%(1.3g)。
t-Boc及叔丁酯保护基团除去的方法如下在1.68g 4-((2-氨基-4-噻唑基)甲基)-Nα-t-Boc-L-高丙氨酸叔丁酯溶于35ml二噁烷所成的溶液中，加入1.1ml三乙基硅烷及8ml 4N盐酸二噁烷溶液。过滤混合物，将固体物先在22℃下搅拌16小时，再用二噁烷冲洗。对粗样品的核磁共振，表明反应不完全。将粗制固体物重溶于20ml二噁烷中，用4N盐酸(5ml)处理4小时。以过滤法分离出固体物，将其溶于水中，并冻干，得1.23g白色收湿性固体物4-((2-氨基-4-噻唑基)甲基)-L-高丙氨酸(二盐酸盐，水合1.4%(mol)水，并溶合0.3%(mol)二噁烷)。分析性HPLC;Phenomenex C18，水/甲醇/三氟乙酸(95/5/0.1)，k′＝0.34。
1H NMR(300 MHz，DMSO-d6)δ9.25(brs，2H)，8.5(br s 2H)，6.55(s，1H)，3.93(m，1H)，2.6(m，2H)，1.8(m，4H)。
C8H13N3O2S·2HCl·1.4H2O·0.3二噁烷的分析计算值C，32.51;H，5.99;N，12.36;S，9.43;Cl，20.86。
实测值C，32.28;H，5.72;N，12.71;S，9.60;Cl，20.86。
实施例10制备N，N′-(1，3-亚苯基二(亚甲基))二(S-甲基异硫脲)在0℃下搅拌由3.30g(25mmol)间苯二甲基二胺(Aldrich Chemical产)溶于100ml二氯甲烷所成的溶液，向其中添加7.0ml(52mmol)苯甲酰异硫氰酸酯。在20℃下，将混合物搅拌18小时，并减压除去溶剂。将粗制固体物(淡黄色)悬浮于100ml 10%氢氧化钠溶液中，并回流5分钟。趁热用浓盐酸将混合物酸化，冷却后添加氢氧化铵，使之呈碱性。收集沉淀出来的白色固体物，并于60℃下减压干燥至恒重，得4.82g灰白色固态二硫脲中间产物。
C10H14N4S2的分析计算值C，47.22;H，5.55;N，22.03;S，25.10。实测值C，47.49;H，5.50;N，21.81;S，25.01。
向2.54g(10mmol)二硫脲中间产物溶于25ml二甲基甲酰胺所成的溶液中，添加5.0ml(80mmol)碘代甲烷。在20℃下，将该溶液搅拌65小时，减压除去溶剂，并在热乙醇中使残留物重结晶。在60℃下，减压干燥淡黄色结晶，得4.28g(81%)N，N′-(1，3-亚苯基二(亚甲基))二(S-甲基异硫脲)。熔点＝164-167℃。TLC(用1%氢氧化铵甲醇溶液在硅胶上产生一个色斑，Rf＝0.48)。
1H NMR(300 MHz，DMSO/D2O)δ7.5-7.4(m，1H)，7.35-7.2(m，3H)，4.59(s，4H)，2.65(s，6H)。
C12H18N4S2·1.9HI的分析计算值C，27.43;H，3.82;N，10.66;S，12.20;1，45.89。
实测值C，27.30;H，3.91;N，10.57;S，12.19;1，45.92。
实施例11制备N，N′-(1，3-亚苯基二(亚甲基))二(S-乙基异硫脲)在由1.0g(3.93mmol)于实施例10中制得的二硫脲溶于20ml乙醇所得的溶液中，加入6.29g(78.62mmol)碘代乙烷。将该混合物加热至回流温度，历时8小时，并减压浓缩成泡沫状物。粗产物以硅胶色谱法用甲醇二氯甲烷溶液(10%至20%)提纯，得1.66g(74%)N，N′-(1，3-亚苯基二(亚甲基))二(S-乙基硫脲)。TLC(Rf＝0.3-0.48，20%甲醇二氯甲烷溶液)。质谱(FAB)311.2(M 1)。
1H NMR(200 MHz，DMSO-d6)δ 7.5-7.4(m，1H)，7.31-7.22(m，3H)，4.58(s，4H)，3.20(q，J＝7.4Hz，4H)，1.28(t，J＝7.4Hz，6H)。
C14H24N4S2·2HI的分析计算值C，29.69;H，4.27;N，9.89;S，11.32;1，44.82。
实测值C，29.44;H，4.25;N，9.64;S，11.50;1，44.65。
实施例12制备S-(3(4-((脒硫基)甲基)苯基)丙基)异硫脲以实施例1中的方法，用3-(4-羧基苯基)丙基(Lancaster Synthesis)制备(3-(4-((脒硫基)甲基)苯基)丙基)异硫脲白色固体物(2.95g，熔点＝190-195℃)。质谱(FAB)283(M 1)。
1H NMR(200 MHz，D2O)δ7.38(d，J＝8.1Hz，2H)，7.26(d，J＝8.1，Hz，2H)，4.36(s，2H)，3.06(t，J＝7.2Hz，2H)，2.74(t，J＝7.4Hz，2H)，2.1-1.9(m，2H)。
C12H18N4S2·2HBr的分析计算值C，32.44;H，4.54;N，12.61;S，14.43;Br，35.97。
实测值C，32.53;H，4.58;N，12.56;S，14.34;Br，35.85。
实施例13制备S-(2-(5-((脒硫基)甲基)-2-噻吩基)乙基)异硫脲在0℃下，向由21.48g(0.19mol)，α，α-二氯甲基·甲基醚(Fluka公司产)溶于300ml二氯甲烷所成的溶液中，添加44.76g(0.172mol)四氯化锡(Aldrich公司产)。15分钟后，在数分钟时间内滴加由24.01g(0.14mol)2-噻吩乙酸乙酯(Aldrich)溶于50ml二氯甲烷所成的溶液。1小时后将混合物倾入冰水中，并搅拌30分钟。二氯甲烷层用水洗涤、用硫酸钠脱水，并加以浓缩。粗产物用10%乙酸乙酯的己烷溶液进行硅胶色谱提纯，得22.85g(82%)5-甲酰基-2-噻吩乙酸乙酯中间产物。
在0℃下搅拌0.77g(20.29mmol)氢化铝锂在200ml四氢呋喃中所成的悬浮液，向其中加入由2.0g(10.09mmol)上述所制备的中间产物溶于50ml四氢呋喃所成的溶液。在20℃下，将该悬浮液搅拌16小时，冷至0℃，并小心地加入0.8ml水、0.8ml 1N氢氧化钠溶液及2.4ml水，以使剩余的氢化物停止反应。将悬浮液同硫酸镁一起搅拌，过滤，浓缩，并用50%乙酸乙酯的己烷溶液至100%乙酸乙酯进行硅胶色谱提纯。分离得到1.07g(67%)二醇中间产物，再将其按如下所述直接转化成二溴化物。
将上述二醇中间产物(1.07g，6.76mmol)溶于50ml二氯甲烷，在0℃下用3.90g(14.87mmol)三苯基膦及4.93g(14.87mmol)四溴化碳处理。将溶液搅拌1小时，然后往其中添加200ml戊烷，滗析出上清液，使之与油状残留物分离，浓缩所滗出的上清液，并用己烷进行硅胶色谱提纯，得1.10g(57%)二溴化物中间产物。将二溴化物产物(1.10g，3.87mmol)溶于50ml乙醇中，并用0.59g(7.75mmol)硫脲处理。在回流条件下，将溶液搅拌2小时。溶液经浓缩后，用制备性HPLC(Waters C18 Bondapak PrepPak cartridge)，以甲醇/水/三氟乙酸浓度梯度法(5/95/0.1至90/10/0.1)进行提纯。将汇集后产物馏分浓缩，用水稀释，并冻干，得306g二(三氟乙酸)盐形式并水合0.1mol水的S-(2-(5-((脒硫基)甲基)-2-噻吩基)乙基)异硫脲(溶点＝186-190℃)1H NMR(200 MHz，D2O)δ 6.98(d，J＝3.5Hz，1H)，4.57(s，2H)，3.38(t，J＝6.5Hz，2H)，3.2(t，J＝6.5Hz，2H)。
C9H14N4S3·2.0C2HF3O2·0.1H2O的分析计算值C，30.96;H，3.24;N，11.11;S，19.08。
实测值C，31.02;H，3.19;N，11.00;S，18.97。
实施例14制备S-(3-(5-(2-(脒硫基)乙基)-2-噻吩基)丙基)异硫脲按实施例13所述，制备5-甲酰基-2-噻吩乙酸乙酯。在由2.0g(10.09mmol)所说的酯溶于100ml四氢呋喃所成的溶液中，添加3.87g(11.10mmol)乙酯基亚甲基三苯基正磷(Carbethoxymethylenetriphenylphosphorane)。将该溶液回流过夜并浓缩之。将粗产物与2.0g第二种用10.54g(30.27mmol)乙酯基亚甲基三苯基正磷在100ml四氢呋喃中回流3小时所得的反应物混合。混合后的粗产物用硅胶色谱法(10%乙酸乙酯/己烷)提纯，得2.39g(44%)烯二酯(enediester)中间产物。向由1.0g(3.73mmol)所说烯二酯溶于50ml乙醇所成的溶液中，添加1.0g 10%披钯碳。在20℃及50psi氢气氛下，将混合物摇振14小时。用硅藻土滤除催化剂，并浓缩溶液，得1.0g粗二酯中间产物。对该中间产物进行的最终三种反应，其中包括氢化铝锂还原(82%)、对所成二醇进行溴化(78%)及用硫脲(88%)使二溴化物烷基化，相似于实施例13中所述的那些反应。烷基化反应的粗产物，用制备性HPLC(Waters，C18 BondaPak PrePak cartridge)法，以甲醇/水浓度梯度法10%至90%甲醇在40min内提纯(溶液以0.1%三氟乙酸缓冲)。冻干产物馏分，得1.53g S-((3-(5-(2-(脒硫基)乙基)-2-噻吩基)丙基)异硫脲，其形式为混合盐(1.0HBr，1.1TFA)并溶合0.5mol甲醇。熔点＝146-151℃。
质谱(FAB)303。(M 1)。1H NMR(200 MHz，D2O)δ6.77(d，J＝3.3，Hz，1H)，6.73(d，J＝3.3Hz，1H)，3.37(t，J＝6.6Hz，2H)，3.21-3.03(m，2H)，2.91(t，J＝7.2Hz，2H)，2.1-1.95(m，2H)。C11H18N4S3·1.0HBr·1.1C2HF3O2·0.5H2O的分析计算值C，31.35;H，4.24;Br，15.22;N，10.68;S，18.05。
实测值C，31.59;H，4.01;Br，14.94;N，10.45;S，18.05。
实施例15-17重复实施例2的方法。粗产物用制备性HPLC(Waters，C18 BondaPak Prepak cartridge)提纯。用甲醇/水/三氟乙酸(5/95/0.1至90/10/1.0)浓度梯度法洗脱，再冻干，得所需的氨基酸，其形式为三氟乙酸加成盐。
实施例15S-((2-氨基-4-噻唑基)甲基)-D-半胱氨酸用D-半胱氨酸和2-氨基-4-氯代甲基噻唑(Spraque，J.M.等，J.Am.Chem Soc.1946，68，2155-2159)来制备。分析性HPLC-phenomenex C18，水/甲醇/七氟丁酸(80/20/1.7)，一个峰，k′＝1.9。UV(pH7.0缓冲剂)λmax 254nm(logε3.73)。1H NMR(200MHz，DMSO-d6)δ8.1(br，2H)，8.1-7.5(br，2H)，6.5(s，1H)，4.25(m，1H)，3.65(d，J＝6Hz，2H)，3.0(m，2H)。
C7H11N3O2S·2.3C2HF3O2·0.1H2O的分析计算值C，27.92;H，2.72;N，8.43;S，12.85。
实测值C，28.00;H，2.89;N，8.74;S，12.62。
实施例16S-((2-氨基-4-噻唑基)甲基)-(D，L)-高半胱氨酸用(D，L)-高半胱氨酸及2-氨基-4-氯代甲基噻唑来制备(Spraque，J.M.等，J.Am.Chem Soc.1946，68，2155-2159)。分析性HPLC-phenomenex C18，水/甲醇/三氟乙酸(95/5/0.1)，一个峰，k′＝2.3。UV(pH7.0缓冲剂)λmax 254nm(logε3.73)。
1H NMR(200 MHz，DMSO-d6)δ 8.5-8.0(br，2H)，7.2-7.0(br，2H)，6.35(s，1H)，4.0(t，J＝4Hz，1H)，3.55(s，2H)，2.6(m，2H)，2.0(m，2H)。
C8H13N3O2S·1.1C2HF3O2·1.0H2O的分析计算值C，31.35;H，4.15;N，10.75;S，16.41。
实测值C，31.30;H，4.07;N，10.73;S，16.31。
实施例17S-(2-(2-氨基-4-噻唑基)乙基)-L-半胱氨酸用L-半胱氨酸及2-氨基-4-(2-溴代乙基)噻唑(用1，5-二溴-2-丁酮作原料，以Spraque等人的方法制得，J.Am.Chem.Soc.1946，68，2155-2159)作原料来制备。分析性HPLC-phenomenex C18，水/甲醇/三氟乙酸(95/5/0.1)，一个峰，k′＝2.6。UV(pH7.0缓冲剂)λmax 256nm(logε3.71)。1H NMR(200 MHz，DMSO-d6)δ9.2-8.8(br，2H)，8.6-8.2(br，2H)，6.6(s，1H)，4.2(m，1H)，3.0(m，2H)，2.8(m，2H)。
C8H13N3O2S2·2.0C2HF3O2·2.4H2O的分析计算值C，27.79;H，3.85;N，8.10;S，12.37。
实测值C，27.65;H，3.69;N，8.02;S，12.38。
实施例18制备S-(2-(4-溴代苯基)乙基)异硫脲氢溴酸盐在0℃下，向由4-溴代苯乙醇(720mg，0.5ml，3.58mmol)及三苯基膦(1.13g，4.30mmol)溶于二氯甲烷(7.0ml)所成的溶液中，添加四溴化碳(1.42g，4.30mmol)。将反应混合物搅拌30min，同时加热至室温。将溶液倾入己烷(100ml)，并滤过硅藻土。真空蒸除溶剂，添加己烷，并使溶液滤过硅藻土。在真空除去溶剂后，对粗料进行球管蒸馏(120℃/70μm Hg)，得透明油状物。
将该透明油状物溶于95%乙醇(7.0ml)，并加入硫脲(300mg，3.94mmol)。加热反应混合物至回流温度，并回流16h，冷至室温，并真空除去溶剂，得白色固体物。将该固体物悬浮于热丙酮中并过滤之，得832mg(68% 收率)的标题化合物。
1H NMR(300 MHz，d6-DMSO)δ9.02(s，4H)，7.52(d，J＝8.3Hz，2H)，7.26(d，J＝8.3Hz，2H)，3.43(t，J＝7.6Hz，2H)，291(t，J＝7.4Hz，2H)。C9H12N2SBr2的M.S.(CI)，m/z(相对强度)259(M -Br，100)，183(68)，77(92)。
C9H12N2SBr2的元素分析计算值C，31.79;H，3.56;N，8.24;S，9.43;Br，46.99。
实测值C，31.84;H，3.59;N，8.19;S，9.34;Br，46.92。
实施例19制备S-(2-(4-氟代苯基)乙基)异硫脲氢溴酸盐按实施例18的方法，用4-氟苯乙醇来制备。使标题化合物在无水乙醇中重结晶而将其提纯。
1H NMR(300 MHz，d6-DMSO)δ 9.10(br，s，2H)，8.96(br.s，2H)，7.32(m，2H)，7.14(m，2H)，3.43(t，J＝6.8Hz，2H)，2.91(t，J＝6.8Hz，2H)。
C9H12N2SFBr的M.S.(CI)，m/z(相对强度)199(M -Br，42)，77(100)。
(C9H12N2SF)(CH4N2S)0.63(HBr)1.06的元素分析计算值C，34.84;H，4.43;N，13.75;S，15.74;Br，25.51。
实测值C，35.31;H，4.41;N，13.62;S，15.51;Br，25.92。
实施例20制备S-(2-(4-(乙氧基-3-甲氧基苯基)乙基)异硫脲氢溴酸盐按实施例18的方法，用4-乙氧基-3-甲氧基苯乙醇来制备。使标题化合物在无水乙醇中重结晶而将其提纯。
1H NMR(300 MHz，d6-DMSO);δ 8.95(br，s，4H)，6.87(s，1H)，6.84(d，J＝8.1Hz，1H)，6.73(d，J＝8.2Hz，1H)，3.94(q，J＝7.0Hz，2H)，3.73(s，3H)，3.39(t，J＝7.3Hz，2H)，2.83(t，J＝7.4Hz，2H)，1.28(t，J＝7.0Hz，3H)。
C12H19N2O2SBr的M.S.(CI)，m/z(相对强度)255(M -Br，56)，179(100)。
C12H19N2O2SBr的元素分析计算值C，42.99;H，5.71;N，8.36;S，9.56;Br，23.83。
实测值C，43.09;H，5.73;N，8.42;S，9.61;Br，23.89。
实施例21制备S-(2-(4-(乙氧基苯基)乙基)异硫脲盐酸盐按实施例18的方法，用4-乙氧基苯乙醇来制备。将粗产物溶于水，并添加2摩尔当量的含水苦味酸钠。以过滤法分离出浅黄色沉淀物，并在AG1-X2阴离子交换树脂(200-400目，氯化物状态，10∶1的水∶甲醇洗脱液)上进行色谱分离，得盐酸盐。
1H NMR(300 MHz，d6-DMSO)δ9.19(br.s，4H)，7.19(d，J＝8.1Hz，2H)，6.82(d，J＝8.1Hz，2H)，3.94(q，J＝7.0Hz，2H)，3.39(t，J＝7.3Hz，2H)，2.83(t，J＝7.4Hz，2H)，1.28(t，J＝7.0Hz，3H)。
C11H17N2OSCl的M.S.(CI)，m/z(相对强度)225(M -Cl，37)，149(100)。
(C11H16N2OS)(HCl)1.08(CH4N2S)0.08(H2O)0.16的元素分析计算值C，48.81;H，6.55;N，11.10;S，12.70;Cl，14.04。
实测值C，48.91;H，6.41;N，11.12;S，12.55;Cl，14.20。
实施例22制备S-(2-(2，6-二甲氧基苯基)乙基)异硫脲盐酸盐按实施例21的方法，用2，6-二甲氧基苯乙醇来制备。
1H NMR(300 MHz，d6-DMSO)δ 9.14(br，s，4H)，7.18(t，J＝8.2Hz，1H)，6.07(d，J＝8.2Hz，2H)，3.73(s，6H)，3.39(t，J＝7.3Hz，2H)，2.83(t，J＝7.4Hz，2H)。
C11H17N2O2SCl的元素分析计算值C，47.74;H，6.19;N，10.12;S，11.48;Cl，12.81。
实测值C，47.77;H，6.19;N，10.07;S，11.48;Cl，12.87。
实施例23制备S-(2-(4-甲氧基苯基)乙基)异硫脲盐酸盐按实施例21的方法，用4-甲氧基苯乙醇来制备。
1H NMR(300 MHz，d6-DMSO)δ 9.19(br，s，4H)，7.19(d，J＝8.0Hz，2H)，6.82(d，J＝8.1Hz，2H)，3.73(s，3H)，3.39(t，J＝7.3Hz，2H)，2.83(t，J＝7.2Hz，2H)。
C11H17N2OSCl的M.S.(CI)，m/z(相对强度)211(M -Cl，22)，135(100)。
(C10H15N2OSCl)的元素分析计算值C，48.68;H，6.13;N，11.36;S，12.89;Cl，14.45。
实测值C，48.70;H，6.10;N，11.36;S，12.89;Cl，14.45。
实施例24制备2-(2-(3-甲氧基苯基)乙基)异硫脲盐酸盐按实施例21的方法，用3-甲氧基苯乙醇来制备。
1H NMR(300 MHz，d6-DMSO)δ 9.00(br，s，4H)，7.21(t，J＝7.9Hz，1H)，6.80(m，3H)，3.72(s，3H)，3.43(t，J＝7.0Hz，2H)，2.88(t，J＝7.4Hz，2H)。
C10H17N2OSCl的M.S.(CI)，m/z(相对强度)211(M -Cl，100)，135(10)，77(70)。
(C10H15N2OS)(HCl)1.05(CH4N2S)0.20(H2O)0.05的元素分析计算值C，45.39;H，6.13;N，12.62;S，14.45;Cl，13.61。
实测值C，45.28;H，6.18;N，12.54;S，14.43;Cl，13.65。
实施例25制备S-(2-(2，4，6-三甲基苯基)乙基)异硫脲氢溴酸盐按实施例18的方法，用2，4，6-三甲氧基苯乙基醇来制备。使标题化合物在无水乙醇中重结晶而将其提纯。
1H NMR(300 MHz，d6-DMSO)δ 9.00(s，4H)，6.80(s，2H)，3.24(t，J＝6.8Hz，2H)，2.84(t，J＝6.7Hz，2H)，2.49(s，3H)，2.28(s，6H)。
C12H19N2SBr的M.S.(CI)，m/z(相对强度)223(M -Br，50)，147(100)。
C12H19N2SBr的元素分析计算值C，47.53;H，6.32;N，9.24;S，10.57;Br，26.53。
实测值C，47.26;H，6.30;N，9.34;S，10.49;Br，26.48。
实施例26制备S-(2-(3-甲基苯基)乙基)异硫脲氢溴酸盐按实施例18的方法，用3-甲基苯乙醇来制备。使标题化合物在无水乙醇中重结晶而将其提纯。
1H NMR(300MHz，d6-DMSO)δ9.08(br，s，2H)，9.03(br，s，2H)，7.20(t，J＝7.5Hz，1H)，7.08(m，3H)3.43(t，J＝7.8Hz，2H)，2.88(t，J＝7.6Hz，2H)，2.28(s，3H)。
C10H15N2SBr的M.S.(CI)，m/z(相对强度)195(M -Br，100)，119(56)，77(42)。
(C10H15N2SBr)(CH4N2S)0.14的元素分析计算值C，42.60;H，5.49;N，11.17;S，12.79;Br，27.95。
实测值C，42.66;H，5.50;N，11.20;S，12.57;Br，27.79。
实施例27制备S-(2-(2-氟苯基)乙基)异硫脲盐酸盐按实施例21的方法，用2-氟代苯乙醇来制备。
1H NMR(300MHz，d6-DMSO)δ9.21(br，s，4H)，7.39(m，1H)，7.28(m，1H)，7.17(m，2H)，3.43(t，J＝7.7Hz，2H)，2.92(t，J＝7.8Hz，2H)。
C9H12N2SFCl的M.S.(CI)，m/z(相对强度)199(M -Cl，100)，123(39)。
C9H12N2SFCl的元素分析计算值C，46.05;H，5.15;N，11.93;S，13.66;Cl，15.10。
实测值C，45.93;H，5.11;N，11.83;S，13.59;Cl，15.14。
实施例28制备S-(2-(3-硝基苯基)乙基)异硫脲氢溴酸盐在0℃下，向由3-硝基苯乙醇(500mg，2.99mmol)及吡啶(35.6mg，36μl，0.45mmol)溶于THF(10ml)所成的溶液中，添加三溴化磷(298mg，0.10ml，1.10mmol)。即刻形成白色沉淀物。将反应混合物加热至室温，并搅拌1h。加入水和乙醚，并将二相分离。有机相用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤，并用无水硫酸镁脱水。过滤混合物，并真空除去溶剂，得棕色油状物。
将粗制溴化物溶于95%乙醇(10ml)，并向其中加入硫脲(251mg，3.30mmol)。将反应混合物加热回流16h，冷至室温，真空除去溶剂。将粗制黄色固体物悬浮于丙酮中，并将该混合物加热回流10min。过滤热溶液，得白色固体物。
1H NMR(300MHz，d6-DMSO)δ9.12(br，s，2H)，8.96(br，s，2H)，8.22(s，1H)，8.14(d，J＝7.9Hz，1H)，7.78(d，J＝7.6Hz，1H)，7.64(t，J＝8.0Hz，1H)，3.50(t，J＝7.0Hz，2H)，3.10(t，J＝7.2Hz，2H)。
C9H12N3O2SBr的M.S.(CI)，m/z(相对强度)226(M -Br，26)，136(36)，76(81)。
C9H12N2O2SBr的元素分析计算值C，35.31;H，3.95;N，13.72;S，10.47;Br，26.10。
实测值C，35.22;H，3.88;N，13.62;S，10.36;Br，26.18。
实施例29制备S-(2-(1H-吡咯-1-基)乙基)异硫脲在室温下，向由新蒸馏过的N-(2-溴代乙基)吡咯(1.00g，5.74mmol)溶于95%乙醇(12ml)所成的溶液中，添加硫脲(415mg，5.74mmol)。在回流下，搅拌溶液22h，冷至室温，并真空浓缩该混合物，得稠密的浅米黄色渍状物。令该油状物在室温下结晶16h以上，过滤晶体并以氯仿(10ml)冲洗，得1.078g标题所述化合物，其形态为浅米黄色针状结晶(收率75%)。
1H NMR(300 MHz，d6-DMSO)δ 9.06(br，s，4H)，6.80(t，J＝2.10Hz，2H)，5.99(t，J＝2.10Hz，2H)，4.12(t，J＝6.50Hz，2H)，3.52(t，J＝6.50Hz，2H)。
C7H12N3SBr的元素分析计算值C，33.61;H，4.84;N，16.80;S，12.82;Br，31.94。
实测值C，33.68;H，4.84;N，16.74;S，12.74;Br，31.99。
熔点94.6-95.0℃。
实施例30用下列方法测定了对NO合成酶的抑制作用由人胎盘提纯NOS
从新鲜胎盘中除去羊膜及绒毛膜，然后用0.9% NaCl冲洗胎盘。在一台Waring搅切机中，以3体积HEDS缓冲液(20mM HEPES pH7.8，0.1mM EDTA，5mM DTT，0.2M蔗糖)加0.1mM PMSF使组织匀浆化。使匀浆滤过干酐包布，再以1000g离心20min。将上清液以27，500g在离心30min。在上清液中加入固体硫酸铵，使饱和度达到32%。把沉淀出来的蛋白质以25，000g制成团粒，再将其重溶于最小体积的HEDS缓冲液加0.1mM PMSF、10μg/ml抑酶醛肽及大豆胰蛋白酶抑剂制、以及1μg/ml抑胃肽的混合液中。重溶后的丸粒以15，000g离心10min。向上清液中加入1/20体积的2.5′ADP琼脂糖树脂(Sigma)，并将浆料缓慢混合过夜。第二天一早，将浆料装入柱中。依次用HEDS、0.5M NaCl(溶于HEDS)、HEDS洗涤树脂，再用10mM NADPH(溶于HEDS)洗脱NOS。该酶可用超滤及速冻法来浓缩，并在-70℃下贮存至少3个月而不失活。
人胎盘NOS的测定按Schmidt等人的方法(PNAS，88，365-369，1991)来观察瓜氨酸的形成，以测定NOS，该方法的改变如下20mM Hepes，PH7.4，10μg/ml调钙蛋白，2.5mM CaCl2，2.5mM DTT，125μm HADPH，10μm四氢生物喋呤，0.5mg/ml BSA，以及1μML-[14C]精氨酸(New England Nuclear产)。在使用单时间点测定速度来对动力学进行研究之前，先确定NOS催化速度的线性。
从细胞诱导的人体结肠直肠腺癌DLD-1细胞中提纯NOS在37℃下，使DLD-1(ATCC编号CCL221)在补充以L-谷氨酰胺、青霉素、链霉素、以及10%热灭活胎牛血清的，5% CO2溶于RPMI 1640所成的培养基中生长。使细胞生长至融合，然后加入下列细胞素合剂100单位/ml干扰素-γ，200单位/ml白细胞介素-6(interleukin-6)，10ng/ml肿瘤坏死因子，以及0.5ng/ml白细胞素-1β(interleukin-1β)。在18-24h诱导后，刮收细胞，并以磷酸盐缓冲的盐水洗涤。将成困粒的细胞贮存在-70℃下。在4℃下，对已诱导过的NOS进行提纯。将置于TDGB(20mM tris pH7.5，10%甘油，1mM DTT，2μM四氢生物喋吟)的细胞冷冻/解冻三次，以此来制备粗浸出液。将浸出液直接加到2′，5′ADP琼脂糖(Pharmacia)柱上。顺次用TDGB、0.5M NaCl的TDGB溶液、TDGB来洗涤树脂。用2mM NADPH(溶于TDGB)来洗脱NOS。接着，加入BSA，将1mg/ml的最终浓度。NOS可予以速冻，并可在-70℃下贮存至少2月而不失活。
可诱导人体NOS的测定按上所述来测定瓜氨酸的形成，但使用10μM FAD，并从测定混合物中除去调钙蛋白和CaCl2。
从人脑中提纯NOS人脑NOS用Schmidt等人(PNAS88，365-369，1991)、Mayer等人(Fed.Eur.Biochem.Soc.288 187-191，1991)及Bredt与Snyder(PNAS 87 682-685，1990)提出的各种方法来制备。简而言之，将新鲜的整脑(3个，分离掉有髓组织，1050g)在冷缓冲液A(50mM HEPES，pH7.5(室温pH值)及0.5mM EDTA，10mM DTT，总体积3.6L)中，用多聚酯来匀浆。混合物以13，000g离心1h，并取出上清液(约2050ml)。在上清液中添加固态硫酸铵(365g，约30%饱和)，并缓慢搅拌总计30min。
沉淀物以13，000g造粒30min，并将这些团粒重新悬浮于约400ml含4μM四氢生物喋呤、1μM FAD(Sigma)及1μM FMN(Sigma)的缓冲液A中。将悬浮液以41，000g离心60min。取出上清液，倾入液氮中予以冷冻，并在-70℃下保存过夜。将混合物解冻，并使之以4ml/min流过2′，5′ADP-琼脂糖柱(0.4g，膨胀于缓冲液A中)。以100ML缓冲液A、200ml含500mM NaCl的缓冲液A、100ml缓冲液A，以及30ml含5mM NADPH的缓冲液A洗涤该柱。向酶溶液中添加四氢生物喋呤至10μM，FAD及FMN至1μM，以及加吐温(Tween)至0.1%。用Centriprep-30将该溶液浓缩至体积约为500μl。按Schmidt等于1991年所述的方法测定酶活性，但在测定时使用了10μM四氢生物喋呤。
抑制的结果示如表1。
数值为抑制常数(Ki)，该常数是通过在三种或三种以上抑制剂浓度下测量百分抑制率，并估计相对于精氨酸的竞争抑制率后而获得的。
权利要求
1.具有NO合成酶抑制作用的异硫脲衍生物供制造有利于抑制NO合成酶的疾病治疗药物的应用。
2.权利要求1所述的应用，其中异硫脲衍生物是通式(Ⅰ)
所示的化合物或其盐，式中R为(1)一个C1-14烃基;或(2)一个5-节和6节的杂环;或(3)一个9节双杂环系上述各R基团可为一或二个各自分别选自下列基团的基团所取代(a)卤;(b)-XR1，其中X为氧，C(O)m，式中m为1或2;S(O)n，式中n为0、1或2;或者NR2，式中R2为氢、C1-6烷基或C3-6环烷基，或者R2连到R1上，形成一个C2-6亚烷基;R1为氢;或C1-6烷基、C2-6链烯基、C3-6环烷基、C7-9芳烷基、C6-10芳基、或者一个5节或6节杂环基团，上述各基团可任选地为一个或二个各自分别选自下列基团的基团所取代C1-3烷基、羟基、C1-3烷氧基团、氨基、C1-3烷基氨基、卤、硝基、或者C(O)m′R2b基团，式中m′为1或2，R2b为氢或C1-4烷基;或者R1为一个NR3R4基团，式中R3和R4可相同或不同，且各为氢或C1-4烷基，或者R3和R4相连，形成一个C2-6亚烷基;(c)一个
基团，式中Y为氧;S(O)n，式中n如上所规定;或NH5，式中R5为氢或C1-4烷基;W为0或1;Q为C2-4烃基;或者亚氨基氮连接到R基团或Q基团上，形成一个5节或6节杂环;或者(d)一个基团A，其中A是一个杂环系，它可优选地为如上定义的基团
所取代;或者(e)C1-6烷基、C2-6链烯基或链炔基或者C3-6环烷基;或者R中各碳原子之一连到式(Ⅰ)所示化合物中的亚氨基氮原子上，形成一个5节或6节杂环;条件为R不是甲基。
3.权利要求2所述的应用，其中R为(1)C1-4烷基;(2)C2-4链烯基，(3)一个
基团，其中p为1至2，q为0至1;或者(4)一个5节或六节杂环，其中含有一或二个氮原子;上述各基团可任选地为一个或二个相同或不同的下列基团所取代(a)卤素，优先为溴;(b)一个OR2b′，其中R2b′为氢或甲基;(c)一个C(O)mR2b′，其中m及R2b′如上所定义;(d)一个SR9基团，其中R9为甲基或乙基;(e)一个NR7bRab基团，其中R7b和R8b各自分别选自氢或C1-4烷基，优先为氢、甲基或乙基;(f)一个可任选地为如上所定义的一个OR2b′，或
基团所取代的苯环;(g)含有一个或二个各自分别选自氮或氧的杂原子的5节或6节杂环，或者(h)C1-4烷基，优先为甲基;或者R中的一个碳原子连到式(Ⅰ)所示化合物的亚氨基氮上，形成一个噻唑或噻唑啉环。
4.权利要求2或3所述的应用，条件为R不是乙基、丙基或异丙基。
5.权利要求1或2所述的应用，其中异硫脲衍生物是式(ⅠA)、(ⅠB)或(ⅠC)所示的化合物。
式中R′为一个C1-8亚烷基，C2-8亚烯基或亚炔基，它们含或不含一个苯环、一个5节或6节杂环，或者一个如前所定义的X基团，其中虚线代表一个双键或一个单键。
6.权利要求1所述的应用，其中异硫脲衍生物为式(Ⅱ)
所示的化合物或其盐，式中Ra为一个C1-8炔基，或者5节或6节杂环，或者一个9节双环杂环系，它们各自任选地被卤素或者一个或二个-XaR1a所取代，其中R1a为氢、C1-6烷基、C3-6环烷基、C7-9芳烷基、C5-10芳基，或者一个5节或6节杂环基团，该杂环基团任选地被C1-3烷基、C1-3烷氧基、氨基、卤素或硝基所取代，或者R1a为一个NR3aR4a基团，其中R3a和R4a或同或不同，且各为氢或C1-3烷基，或者R3a和R4a相连，形成一个C2-6亚烷基，且Xa为氧;C(O)ma，其中ma为1或2;S(O)na，其中na为0、1或2;或者NR2a，其中R2a为氢、C1-6烷基或C3-6环烷基，或者R2a连到R1a上，形成一个C2-6亚烷基，或者为一个
基团所取代，其中t为0至4，Wa为0或1，Ya为氧、硫及NR7a，其中R7a为氢或C1-4烷基;或者Ra将硫原子连到式(Ⅰ)所示化合物中的一个氮原子上，形成一个5节或6节杂环，条件是Ra不是甲基。
7.权利要求1至6所述的应用，其中所述异硫脲衍生物选自S-(2-氨乙基)异硫脲S-(2-(二甲基氨基)丙基)异硫脲S-(2-甲基-2-丙烯基)异硫脲S，S′-亚乙基二(异硫脲)S，S′-1，5-亚戊基二(异硫脲)S-(2-(二甲基氨基)乙基)异硫脲2-氨基-2-噻唑啉S，S′-1，6-亚己基二(异硫脲)S，S′-1，7-亚庚基二(异硫脲)S-苄基异硫脲S-(2-吗啉代乙基)异硫脲S-(6-甲基-2-(甲硫基)-4-嘧啶基)异硫脲S，S′-(1，4亚苯基二(亚甲基)二异硫脲S-叔丁基异硫脲S-(4-乙基苄基)异硫脲S-((甲硫基)甲基)异硫脲S-(3-溴丙基)异硫脲S-(2-溴乙基)异硫脲S-(3-甲基-2-丁烯基)异硫脲S-烯丙基异硫脲S-(3-氨基丙基)异硫脲S，S′-(1，3-亚苯基二(亚甲基))二异硫脲S，S′-(2-亚甲基-1，3-亚丙基)二异硫脲S，S′-(2-丁炔-1，4-亚基)二异硫脲S，S′-(1，3亚苯基二(1，2-亚乙基)二异硫脲S，S′-(1，4-亚苯基二(1，2-亚乙基)二异硫脲2-氨基-5-甲基噻唑S-((2-氨基-4-噻唑基)甲基-L-半胱氨酸3-((2-氨基-4-噻唑基)甲基-L-丙氨酸2-氨基-4-甲基噻唑2-氨基-4，5-二甲基噻唑S-(2-(1H-吡咯-1-基)乙基)异硫脲S-(3-羟基丙基)异硫脲S-(2-苯基)乙基)异硫脲S-(2-(3-甲氧基苯基)乙基)异硫脲4-(2-氨基-4-噻唑基)甲基)-L-高丙氨酸N，N-(1，3-亚苯基二(亚甲基))二(S-甲基异硫脲)N，N-(1，3-亚苯基二(亚甲基))二(S-乙基异硫脲)S-(2-(5-((脒硫基)甲基)-2-噻吩基)乙基)异硫脲S-(3-(4-((脒硫基)甲基)苯基)丙基)异硫脲S-(3-(5-(2-脒硫基)乙基)-2-噻吩基)丙基)异硫脲S-(2-(4-氟苯基)乙基)异硫脲S-(2-(4-溴苯基)乙基)异硫脲S-(2-(3-甲氧基苯基)乙基)异硫脲S-(2-(3-甲基苯基)乙基)异硫脲S-(2-(4-乙氧基苯基)乙基)异硫脲S-(2-(4-甲氧基苯基)乙基)异硫脲S-(2-(2-溴苯基)乙基)异硫脲S-(2-(2-氟苯基)乙基)异硫脲S-(2-(3-硝基苯基)乙基)异硫脲S-(3-(1H-吡咯-1-基)丙基)异硫脲S-(2-(2-氯苯基)乙基)异硫脲S-(2-(2，5-二甲基苯基)乙基)异硫脲S-(2-(4-乙氧基-3-甲氧基苯基)乙基)异硫脲或它们的盐。
8.权利要求1至3或6中任何一项所述的应用，其中所述异硫脲衍生物选自S-乙基异硫脲、S-丙基异硫脲、S-异丙基异硫脲。
9.权利要求1所述异硫脲作治疗系统性低血压的应用。
10.权利要求1或2所述异硫脲作治疗败血性休克的应用。
11.权利要求9所述异硫脲的应用，其中系统性低血压因细胞素或细胞素诱导疗法所致。
12.权利要求1所述异硫脲作短期免疫抑制治疗的应用。
13.权利要求1所述异硫脲作自体免疫疾病治疗的应用。
14.权利要求1所述异硫脲作炎性疾病治疗的应用。
15.除了S-乙基异硫脲、S-丙基异硫脲、S-异丙基异硫脲、苄基异硫脲、S，S-(1，4-亚苯基二(亚甲基)二异硫脲及S-(2-(二甲基氨基)乙基)异硫脲之外，供药用的式(Ⅰ)所示异硫脲衍生物。
16.前列权利要求中所定义式(ⅠA)、(ⅠB)或(ⅠC)的新异硫脲衍生物。
17.权利要求16所述的异硫脲衍生物，该衍生物选自S，S′-(1，4-亚苯基二(1，2-亚乙基)二异硫脲S-(2-(1H-吡咯-1-基)乙基)二异硫脲S-((2-氨基-4-噻唑基)甲基)-L-半胱氨酸γ-(2′-氨基-4-噻唑基)-L-高丙氨酸S，S′-(1，2-亚苯基二(1，2-亚乙基)二异硫脲β-(2′-氨基-4′-噻唑基)-L-丙氨酸S-(2′氨基-5′-(R，S)-噻唑啉基甲基)-L-半胱氨酸4-((2-氨基-4-噻唑基)甲基)-L-高丙氨酸N，N-(1，3-亚苯基二(亚甲基))二(S-甲基异硫脲)N，N-(1，3-亚苯基二(亚甲基))二(S-乙基异硫脲)S-(3-(4-((脒硫基)甲基)苯基)丙基)异硫脲S-(2-(5-((脒硫基)甲基)-2-噻吩基)乙基)异硫脲S-(3-(5-((2-脒硫基)乙基)-2-噻吩基)丙基)异硫脲S-((2-氨基-4-噻唑基)甲基)-D-半胱氨酸S-((2-氨基-4-噻唑基)甲基)-(D，L)-高半胱氨酸S-(2-(2-氨基-4-噻唑基)乙基)-L-半胱氨酸S-(2-(4-氟苯基)乙基)异硫脲S-(2-(4-溴苯基)乙基)异硫脲S-(2-(3-甲氧基苯基)乙基)异硫脲S-(2-(3-甲基苯基)乙基)异硫脲S-(2-(4-乙氧基苯基)乙基)异硫脲S-(2-(4-甲氧基苯基)乙基)异硫脲S-(2-(2-溴苯基)乙基)异硫脲S-(2-(2-氟苯基)乙基)异硫脲S-(2-(3-硝基苯基)乙基)异硫脲S-(3-(1H-吡咯-1-基)丙基)异硫脲S-(2-(4-乙氧基-3-甲氧基苯基)乙基)异硫脲S-(2-(2，4，6-三甲基苯基)乙基)异硫脲S-(2-(2，6-二甲氧基苯基)乙基)异硫脲及其盐。
18.权利要求16所述异硫脲衍生物的制备方法，该方法包括a)硫脲与化合物RL(L′)r的反应，式中R如前所定义，L及L′均为离去基团，r为0或1，需要时，在反应后除去保护基团;或者b)除去式(IB1)所示化合物的保护基团，
式中R′及虚线的定义如前所述，P及P′或同或不同，均为保护基团。
19.一种医药制剂，该制剂包括除S-乙基异硫脲、S-丙基异硫脲、S-异丙基异硫脲、S-苄基异硫脲、S，S-(1，4-亚苯基二亚甲基二异硫脲及S-(2-(二甲基氨基)乙基)异硫脲之外，如前所定义的一种异硫脲衍生物，或其任一种药理学可接受的盐或其溶剂化物，以及一种或多种药理学可配伍的载体，以及可含或不含一种或多种其它治疗性成分。
20.一种有利于NO合成酶抑制的疾病治疗方法，该方法包括投给治疗有效的量的、具有对NO合成酶抑制作用的异硫脲衍生物。
全文摘要
公开了异硫脲衍生物及其在医学，尤其在有利于抑制一氧化氮合成酶的疾病治疗方面的应用，还公开了含该类衍生物的药物制剂及其制造方法。
文档编号C07D207/36GK1095710SQ9312164
公开日1994年11月30日 申请日期1993年11月26日 优先权日1992年11月27日
发明者E·P·加维, G·J·塔努力, J·A·奥普林格, E·S·富法恩 申请人:惠尔康基金会集团公司
技术领域：
本发明涉及异硫脲衍生物、其制备方法、含这些衍生物的医药制剂，以及它们在疾病治疗方面的应用，特别是它们作为一氧化氮合成酶抑制剂的应用。
自20世纪80年代起，人们已知，乙酰胆碱所致的血管舒张同内皮的存在有关，而这种活性被归因于所谓内皮衍化舒张因子(EDRF)的易变性体液因子。一氧化氮(NO)作为血管舒张药的活性，为人们所知已逾百余年，而且NO还是亚硝酸戊酯、三亚硝酸甘油酯及其它硝基血管舒张药的活性组分。近来鉴别出EDRF为NO，这正好同发现NO由酶即NO合成酶用氨基酸L-精氨酸合成的生物化学途经不谋而合。
NO是可溶性鸟嘌吟核苷酸酯(盐)环化酶的内生刺激素，并参与除了内皮依赖性舒张以外的许多生物作用，包括吞噬细胞的细胞毒性和中枢神经系统细胞之间的交流(见Moncada等，Biochemical Pharmacology，38，1709-1715(1989)，及Moncada等，Pharmacological Review，43，109-142(1991))。现在，人们认为，在许多疾病中，有可能产生过量NO，尤其是涉及系统性低血压(systemic hypotension)如败血(毒)性休克及用某些细胞素来治疗的疾病。
由L-精氨酸合成NO，可为类似于L-N-单甲基精氨酸(L-NMMA)的L-精氨酸所抑制，因而已有人提议(WO 91/04024及GB-A-2240041)用L-NMMA来治疗败血性休克和其它类型的系统性低血压。除L-NMMA之外，某些其它用于同一目的NO合成酶抑制剂在治疗上的应用，也已在WO 91/04024及EP-A-0446699中提出。
最近已搞清楚，NO合成酶至少有以下三类(ⅰ)位于内皮中的一种基本的Ca /调钙蛋白依赖性酶，它在应答受体或物理刺激时释出NO。
(ⅱ)位于脑内的一种基本的Ca /调钙蛋白依赖性酶，它在应答受体或物理刺激时释出NO。
(ⅲ)在血管平滑肌、巨噬细胞内皮细胞及许多其它细胞被内毒素及细胞素活化后所诱导的一种Ca 非依赖性酶。这种可诱导性NO合成酶，一旦被表达，即会长期合成NO。
由各种基本的酶所释出的NO，起着服从转导机理的一些生理应答的作用。由可诱导酶产生的NO，则起着克制肿瘤细胞和入侵微生物的细胞毒素分子作用(Wright等，Card.Res.26，48-57(1992)及Moncada等，Pharmacological Review，43，109-142(1991))。也似乎表明，产生过多NO的不良作用，尤其是病理性血管舒张及组织损伤，有可能主要由可诱导NO的合成酶所合成的NO的作用所引起。
至今，人们所提议供治疗应用的NO合成酶抑制剂，尤其是L-NMMA，不具选择性，它们既抑制基本的NO合成酶，又抑制可诱导的NO合成酶。使用这样一种无选择性的NO合成酶抑制剂，需要非常小心，以免因过度抑制基本的NO合成酶而产生的潜在严重后果，其中包括低血压、血栓形成、CNS毒性及组织损伤。特别是，在将L-NMMA在治疗上应用来医治败血性休克时，已推荐在整个治疗过程中，必须连续监测病人的血压。因此，无选择性NO合成酶抑制剂，在适当注意的前提下具有治疗上的实用性，而在抑制可诱导NO合成酶要比抑制基本的NO合成酶具有大得多的选择性的NO合成酶抑制剂，则在治疗上具有更大的好处，并且大大方便了使用。
异硫脲的制备和生物学性质，已在文献中予以报导(Schroeder，Chem.Revs.，1955，55，181;Doherty等，J.Am.Chem.Soc.，1957，79，5667;以及Brand及Brand，Org.Synth.，1942，22，59;Smirk等，Brit.Med.J.1941，510-11;J.Physiol.，1942，100，474-483;Lancet，1942，301-303;J.Physiol.，1943，101，379-388;Fastier，Brit.J.Pharmacol.，1948，3.198)。我们现已发现，异硫脲是NO合成酶的抑制剂，而且可用于治疗系统性低血压，而且特别可用于治疗败血性休克。除此之外，与基本的NO合成酶相比，这些化合物中的许多化合物都对可诱导NO合成酶具有选择性。
因此，本发明提供了一种对需要抑制一氧化氮合成酶的疾病的治疗方法，该方法包括投给哺乳动物有效量的、对NO合成酶具有抑制作用的异硫脲衍生物或其药理学上可采用的盐。另一方面，本发明提出了对NO合成酶具有抑制作用的异硫脲供制造一种有利于抑制NO合成酶的治疗疾病的药物的应用。
更具体来说，本发明提出了一种治疗系统性低血压及/或败血性休克的方法，该方法包括投给哺乳动物有效量的、对NO合成酶具有抑制作用的异硫脲衍生物或其药理上可采用的盐。另一方面，本发明提出了具有NO合成酶抑制作用的异硫脲衍生物供制造系统性低血压及/或败血性休克的药物的应用。
有利于抑制由L-精氨酸产生NO的另一些情况包括用TNF、IL-1及IL-2之类细胞素进行治疗，或者用细胞素诱导剂如5，6-二甲基吨酮乙酸进行的治疗，以及在移植治疗中作短期免疫抑制辅剂。此外，抑制NO合成的化合物还可用来降低患有过量NO促进疾病理生理学的炎症疾病如成人呼吸窘迫综合症(ARDS)及心肌炎的病人体内的NO浓度。
还有证据表明，NO合成酶可能参与自体免疫及/或炎性疾病如关节炎、类风湿性关节炎、慢性肠道病及系统性红斑狼疮(SLE)中发生的软骨变性。人们还认为，NO合成酶可能参与胰岛素依赖性糖尿病。因此，本发明的再一方面，提供了异硫脲衍生物或其盐，以制造用来进行细胞素或细胞素诱导治疗、在移植治疗中作短期免疫抑制辅剂，供治疗患有过量NO促进病症病理生理学的炎性疾病病人、用于自体免疫及/或炎性适应症及胰岛素依赖性糖尿病的药物。
再有一个方面是，提供了治疗与细胞素治疗相关的不良作用，移植治疗中短期免疫抑制的，治疗患有过量NO促进病症病理生理学的炎性疾病病人的，治疗自体免疫及/或炎性症状疾病及治疗胰岛依赖性糖尿病的方法，该方法包括投给需要的哺乳动物有效量的、对NO合成酶具有抑制作用的异硫脲衍生物或其药理学上可采用的盐。
本文中所用的“治疗”病人，意即包括预防;“哺乳动物”意即包括人或动物。
优选的异硫脲包括式(Ⅰ)
所示的异硫脲或其盐，式中R为(1)一个C1-14烃基;或(2)一个5-节和6节的杂环;或(3)一个9节双杂环系上述各R基团可为一或二个各自分别选自下列基团的基团所取代(a)卤;
(b)-XR1，其中X为氧;C(O)m，式中m为1或2;S(O)n，式中n为0、1或2;或者NR2，式中R2为氢、C1-6烷基或C3-6环烷基，或者R2连到R1上，形成一个C2-6亚烷基;
R1为氢;或C1-6烷基、C2-6链烯基、C3-6环烷基、C7-9芳烷基、C6-10芳基、或者一个5节或6节杂环基团，上述各基团可任选地为一个或二个各自分别选自下列基团的基团所取代C1-3烷基、羟基、C1-3烷氧基团、氨基、C1-3烷基氨基、卤、硝基、或者C(O)m′R2b基团，式中m′为1或2，R2b为氢或C1-4烷基;或者R1为一个NR3R4基团，式中R3和R4可以相同或不同，且各为氢或C1-4烷基，或者R3和R4相连，形成一个C2-6亚烷基;
基团，式中Y为氧;S(O)n，式中n如上所规定;或NR5，式中R5为氢或C1-4烷基;
W为0或1;
Q为C2-4烃基;
或者亚氨基氮连接到R基团或Q基团上，形成一个5节或6节杂环;或者(d)一个基团A，其中A是一个杂环系，它可任选地为如上定义的基团
所取代;或者(e)C1-6烷基、C2-6链烯基或链炔基或者C3-6环烷基;或者R中，碳原子之一连到式(Ⅰ)所示化合物中的亚氨基氮原子上，形成一个5节或6节杂环;条件为R不是甲基。
适宜的R为(1)C1-8烷基;
(2)C2-8链烯基或链炔基;
(3)一个-(CH2)p
CH3基团，其中p为0至4，q为0至3;或者(4)一个5节或6节杂环，上述各基团可被一个或二个相同或不同的下列基团所取代(a)卤素，(b)OR2b，其中R2b如上所定义;
(c)C(O)mR2b，其中m及R2b如上所定义;
(d)S(O)nR6，其中n如上所定义，R6为C1-4烷基，该烷基任选地被一个或二个各自分别选自氨基或如上定义的C(O)mR2b基团所取代;
(e)NR7R8，其中R7及R8及自分别选自氢、C1-4烷基、C2-4链烯基、C1-4烷氧烷基，或者R7及R8相连，形成一个5节或6节杂环;
(f)一个苯环或一个5节或6节杂环，它可任选地被如上所定义的一个OR2b基团所取代，或者被一个
基团所取代，其中Q如上所定义;或者亚氨基氮与基团Q相连，形成一个噻唑或噻唑啉环;或者(g)C1-4烷基，条件是R为一个杂环;或者R中的一个碳原子连到式(Ⅰ)所示化合物中的亚氨基氮上，形成一个噻唑或噻唑啉环。
最适宜的R为(1)C1-4烷基;
(2)C2-4链烯基，(3)一个
CH3基团，其中p为1或2，q为0或1;或者(4)一个5节或6节杂环，其中含有一或二个氮原子;
上述各基团可任选地被一个或二个相同或不同的下列基团所取代(a)卤，优先为溴;
(b)一个OR2b′基团，其中R2b′为氢或甲基;
(c)一个C(O)mR2b′基团，其中m及R2b′如上所定义;
(d)一个SR9基团，其中R9为甲基或乙基;
(e)一个NR7bR8b基团，其中R7b和R8b各自分别选自氢或C1-4烷基，优先为氢、甲基或乙基;
(f)一个可任选地为一个如上所定义的OR2b′或一个
基团取代的苯环;
(g)含有一个或二个各自分别选自氮或氧的杂原子的5节或6节杂环;或者(h)C1-4烷基，优先为甲基;
或者R中的一个碳原子连到式(Ⅰ)所示化合物的亚氨基氮上，形成一个噻唑或噻唑啉环。
式(Ⅰ)包括式(ⅠA)、(ⅠB)、及(ⅠC)所示的异硫脲衍生物。
，式中R′为一个C1-8亚烷基，或者一个C2-8亚烯基或亚炔基，它们含或不含一个苯环、一个5节或6节杂环，或者一个如前所定义的X基团，其中虚线代表一个双键或一个单键。
式Ⅰ还包括式(Ⅱ)
所示的化合物或其盐，式中Ra为一个C1-8烃基，或者5节或6节杂环，或者一个9节双环杂环系，它们各自任选地被卤素或者一个或二个-XaR1a基团所取代，其中R1a为氢、C1-6烷基、C3-6环烷基、C7-9芳烷基、C6-10芳基，或者一个5节或6节杂环基团，该杂环基团任选地被C1-3烷基、C1-3烷氧基、氨基、卤素或硝基所取代，或者R1a为一个NR3aR4a基团，其中R3a和R4a或同或不同，且各为氢或C1-3烷基，或者R3a和R4a相连，形成一个C2-6亚烷基，且Xa为氧;C(O)ma，其中ma为1或2;S(O)na，其中na为0、1或2;或者NR2a，其中R2a为氢、C1-6烷基或C3-6环烷基，或者R2a连到R1a上，形成一个C2-6亚烷基，或者为一个
基团所取代，其中t为0至4，Wa为0或1，Ya为氧、硫及NR7a，其中R7a为氢或C1-4烷基;或者Ra将硫原子连到式(Ⅰ)所示化合物中的一个氮原子上，形成一个5节或6节杂环，条件是Ra不是甲基。
优选的一组化合物，是其中的R不是甲基、乙基、丙基或异丙基的那些化合物。
优选的式(Ⅰ)所示化合物包括S-(2-氨乙基)异硫脲S-(2-(二甲基氨基)丙基)异硫脲S-(2-甲基-2-丙烯基)异硫脲S，S′-亚乙基二(异硫脲)S，S′-1，5-亚戊基二(异硫脲)S-(2-(二甲基氨基)乙基)异硫脲2-氨基-2-噻唑啉S，S′-1，6-亚己基二(异硫脲)S，S′-1，7-亚庚基二(异硫脲)S-苄基异硫脲S-(2-吗啉代乙基)异硫脲S-(6-甲基-2-(甲硫基)-4-嘧啶基)异硫脲S，S′-(1，4亚苯基二(亚甲基)二异硫脲S-叔丁基异硫脲S-(4-乙基苄基)异硫脲S-((甲硫基)甲基)异硫脲S-(3-溴丙基)异硫脲S-(2-溴乙基)异硫脲
S-(3-甲基-2-丁烯基)异硫脲S-烯丙基异硫脲S-(3-氨基丙基)异硫脲S，S′-(1，3-亚苯基二(亚甲基))二异硫脲S，S′-(2-亚甲基-1，3-亚丙基)二异硫脲S，S′-(2-丁炔-1，4-亚基)二异硫脲S，S′-(1，3-亚苯基二(1，2-亚乙基)二异硫脲S，S′-(1，4-亚苯基二(1，2-亚乙基)二异硫脲2-氨基-5-甲基噻唑S-((2-氨基-4-噻唑基)甲基-L-半胱氨酸3-((2-氨基-4-噻唑基)甲基-L-丙氨酸2-氨基-4-甲基噻唑2-氨基-4，5-二甲基噻唑S-(2-(1H-吡咯-1-基)乙基)异硫脲S-(3-羟基丙基)异硫脲S-(2-苯基)乙基)异硫脲S-(2-(3-甲氧基苯基)乙基)异硫脲4-(2-氨基-4-噻唑基)甲基)-L-高丙氨酸N，N-1，3-亚苯基二(亚甲基)二(S-甲基异硫脲)N，N-(1，3-亚苯基二(亚甲基))二(S-乙基异硫脲)S-(2-(5-((脒硫基)甲基)-2-噻吩基)乙基)异硫脲S-(3-(4-((脒硫基)甲基)苯基)丙基)异硫脲S-(3-(5-(2-脒硫基)乙基)-2-噻吩基)丙基)异硫脲
S-(2-(4-氟苯基)乙基)异硫脲S-(2-(4-溴苯基)乙基)异硫脲S-(2-(3-甲氧基苯基)乙基)异硫脲S-(2-(3-甲基苯基)乙基)异硫脲S-(2-(4-乙氧基苯基)乙基)异硫脲S-(2-(4-甲氧基苯基)乙基)异硫脲S-(2-(2-溴苯基)乙基)异硫脲S-(2-(2-氟苯基)乙基)异硫脲S-(2-(3-硝基苯基)乙基)异硫脲S-(3-(1H-吡咯-1-基)丙基)异硫脲S-(2-(2-氯苯基)乙基)异硫脲S-(2-(2，5-二甲基苯基)乙基)异硫脲S-(2-(4-乙氧基-3-甲氧基苯基)乙基)异硫脲，及它们的盐。
特别优选的化合物，包括S，S′-(1，3-亚苯基二(1，2-亚乙基)二异硫脲、S，S′-(1，4-亚苯基二(1，2-亚乙基)二异硫脲、S-(2-(5-脒硫基)甲基)-2-噻吩基)乙基)异硫脲、S-(3-(5-(2-脒硫基)乙基)-2-噻吩基)丙基)异硫脲及S-(2′-(3-甲氧基苯基)乙基)异硫脲。
其它优选用来治疗败血性休克的化合物，为S-乙基异硫脲、S-丙基异硫脲及S-异丙基异硫脲，尤其为S-乙基异硫脲及S-异丙基异硫脲，特别是S-乙基异硫脲。
术语“烃基”基团，意即只含碳原子和氢原子，但可含双键及/或叁键，并且实质上可为环状或芳香族的基团。
术语“杂环”意即含有1至3个选自氧、硫及氮，优选为氮或硫的杂原子的环状化合物。
术语“卤素”意指氟、氯、溴或碘，优选为溴。
式(Ⅰ)所示化合物，包括许多在分子中视各种基团的确切含义而定的不对称中心，而且式(Ⅰ)旨在包括各种可能的异构体。
本发明的另一方面，提供了除苄基异硫脲、S，S(1，4-亚苯基二(亚甲基))二异硫脲及S-(2-(二甲基氨基)乙基)异硫脲之外的、具有抑制NO合成酶作用、用于医药的式(Ⅰ)所示异硫脲或其药物学可接受的盐。
另一方面，本发明提供了如上所定义的式(ⅠA)、(ⅠB)及(ⅠC)所示新化合物。这些化合物包括S，S′-(1，4-亚苯基二(1，2-亚乙基)二异硫脲S-(2-(1H-吡咯-1-基)乙基)异硫脲S-((2-氨基-4-噻唑基)甲基)-L-半胱氨酸γ-(2′-氨基-4-噻唑基)甲基)-L-高丙氨酸S，S′-(1，2-亚苯基二(1，2-亚乙基)二异硫脲β-(2′-氨基-4′-噻唑基)-L-丙氨酸S-(2′氨基-5′-(R，S)-噻唑啉基甲基)-L-半胱氨酸4-((2-氨基-4-噻唑基)甲基)-L-高丙氨酸N，N-(1，3-亚苯基二(亚甲基))二(S-甲基异硫脲)N，N-(1，3-亚苯基二(亚甲基))二(S-乙基异硫脲)S-(3-(4-((脒硫基)甲基)苯基)丙基)异硫脲S-(2-(5-((脒硫基)甲基)-2-噻吩基)乙基)异硫脲S-(3-(5-((2-脒硫基)乙基)-2-噻吩基)丙基)异硫脲S-((2-氨基-4-噻唑基)甲基)-D-半胱氨酸S-((2-氨基-4-噻唑基)甲基)-(D，L)-高半胱氨酸S-(2-(2-氨基-4-噻唑基)乙基)-L-半胱氨酸S-(2-(4-氟苯基)乙基)异硫脲S-(2-(4-溴苯基)乙基)异硫脲S-(2-(3-甲氧基苯基)乙基)异硫脲S-(2-(3-甲基苯基)乙基)异硫脲S-(2-(4-乙氧基苯基)乙基)异硫脲S-(2-(4-甲氧基苯基)乙基)异硫脲S-(2-(2-溴苯基)乙基)异硫脲S-(2-(2-氟苯基)乙基)异硫脲S-(2-(3-硝基苯基)乙基)异硫脲S-(3-(1H-吡咯-1-基)丙基)异硫脲S-(2-(4-乙氧基-3-甲氧基苯基)乙基)异硫脲S-(2-(2，4，6-三甲基苯基)乙基)异硫脲S-(2-(2，6-二甲氧基苯基)乙基)异硫脲及它们的盐。
本发明包括盐形式，尤其酸加成盐形式的异硫脲。适宜的盐包括那些既用有机酸又用无机酸生成的盐。这样的酸加成盐一般都为药理学所接受，虽然药理学上不接受的盐在制备和提纯所涉及化合物时可加以利用。因此，优选的盐包括由盐酸、氢溴酸、硫酸、柠檬酸、酒石酸、磷酸、乳酸、丙酮酸、乙酸、三氟乙酸、琥珀酸、草酸、富马酸、马来酸、草酰乙酸、甲磺酸、乙磺酸、对-甲基苯磺酸、苯磺酸及羟乙磺酸生成的盐。异硫脲的盐，可使游离碱形式的适宜化合物与相宜的酸作用来制取。
本发明的异硫脲虽然可以原化学物质来投药，但以药物制剂形式给药为佳。根据另一方面，本发明提供了一种药物制剂，其中含有本发明的一种异硫脲或一种异硫脲的药理学可用盐或溶剂化物，以及一种或多种药理学可用的载体和任选的一种或多种其它治疗用组分。例如一种抗生素，及/或一种体液补充液。所说载体必须在与其它制剂成分配伍的意义上“可用”，而不得对其受体有害。
制剂包括那些适于经口、胃肠外(包括皮下、皮内、肌内、静脉内及关节内)、直肠及局部(包括皮、口、舌下及眼内)给药剂型，虽然最适宜的用药方案或许取决于例如受药者的病症和障碍。制剂可方便地以单位剂量形式来提供，并可用药物学领域中众所周知的任何方法来制备。所有方法都包括将式(Ⅰ)化合物或其药理学可用的盐或溶合物(“有效成份”)与构成一种或多种辅助成分的载体相互组合的步骤。一般，制剂是通过将有效成分同液态载体或细分散固态载体或固、液二种载体均匀充分混合，然后在必要时将产品成型为所需剂型。
适于经口给药的本发明制剂，可以按分立单位的形式提供，例如胶囊、扁囊剂或片剂，其中各含有预定量的活性成分;例如粉剂或粒剂;例如含水液体或非水液体中的溶液剂或悬液剂;或例如水包油乳液剂或油包水乳液剂。有效成分也可以按大药丸、糖剂或膏剂的形式提供。
片剂可任选地用一种或多种辅助成分通过压制或模塑来制造。压制的片剂，可以在适当的机器中将任选地混有粘合剂，润滑剂，惰性稀释剂，润滑、表面活性或分散剂的自由流动状态如粉末或颗粒的有效成分加压来制造。模塑的片剂，可在适当的机器中模塑经惰性液态稀释剂润湿的粉状化合物来制造。片剂可任选地被包覆或刻痕，并可制成可缓慢或有控制地释效其中有效成分的剂型，供胃肠外给药的制剂包括含水及非水的灭菌注射液，其中可含有抗氧化剂、缓冲剂、制菌剂及能使制剂与受药者血液等渗的溶质;以及水质或非水质灭菌悬液剂，其中可包括悬浮剂和增稠剂。这些剂型可以装在单次剂量或多次剂量的容器如封焊的安瓿及小药瓶中供使用，并可在冻干(真空冷冻干燥)条件下保存，用前只需添加灭菌液态载体，例如盐水、注射用水。作为选择，这些剂型可供连续输注之用。
临时注射液及悬液，可用上述类型的灭菌粉剂、粒剂及片剂来制备。
供直肠用的剂型，可以含有常用载体如可可脂或聚乙二醇的栓剂形式提供。
供口腔内局部，例如颊、舌下给药的剂型包括锭剂，其中在加有调味剂的基料，如加有蔗糖的阿拉伯树胶或黄蓍胶中含有有效成分，以及软锭剂，其中在诸如明胶加甘油或蔗糖加阿拉伯树胶的基料中含有有效成分。
优选的单次剂量剂型是那些含有如下指定有效剂量或其适当分剂量的有效成分的剂型。
应当理解的是，除了上面特别提及的各成分之外，本发明的各剂型中还可包含本领域中常用的、与所讨论剂型种类有关的其它药剂，例如适于经口给药的剂型可含有调味剂。
对上面提及的各种疾病而言，本发明化合物可以0.1-250mg/kg/d的剂量经口或经注射给药。对成人的剂量范围，一般为5mg-17.5g/d，优选为5mg-2g/d，最优选为10mg-1g/d。片剂或其它以分散单位提供的给药形式，可方便地含有适当量的本发明化合物，它以例如含5mg-500mg，通常约10mg-200mg的一次剂量或多次剂量为有效。
式(Ⅰ)所示化合物优选以经口或注射(静脉内或皮下)方式给药。对病人给与化合物的精确用量，是主治医师的责任。然而，所有的剂量则视诸多因素而定，其中包括病人的年令及性别，待治疗的确切病症及其严重程度。同样，给药方案也可视病症及其严重程度而异。
本发明还提供了相似于本领域中已知制备异硫脲衍生物方法的如上所定义新化合物制备方法。
因此，式(Ⅰ)所示化合物或其带保护基团的衍生物，可通过使硫脲与化合物RL(L′)r(式中R如上所定义，L及L′均为离去基团，例如卤原子如溴，r为0或1)反应，需要时随后脱除保护基团来制备。
更具体地说，(ⅰ)如上所定义的式(ⅠA)
所示化合物，可使硫脲与一种其中L、L′及R如上所定义的化合物LRL′反应来制备。适宜的是，该反应在极性溶剂如乙醇中，在20℃至溶剂回流温度下进行。
式LRL′所示化合物可市购而得，或者可用相应的二醇HO-R′-OH，相宜地通过在极性溶剂如二氯甲烷中，在卤化剂如四溴化碳及三苯基膦存在下进行反应来制取。
式HO-R′-OH所示的化合物可市购而得，或者可用本领域中已知的方法来制备。
(ⅱ)如上所定义的式(ⅠB)所示化合物
可将式(ⅠB1)
所示化合物脱除保护基团来制备，式(ⅠB1)中，R′及虚线的定义如上所述，P及P′或同或不同，二者均为保护基团，例如苄基、苄氧羰基或叔丁氧羰基。该反应可在三氟乙酸中，于-20℃至100℃的非极度的温度例如0℃下，在有清除剂分子，例如苯硫基甲烷及1，2-乙二硫醇存在下进行。
当虚线代表单键且取代基在4-位时，式(ⅠB1)所示化合物可用式(ⅠB2)
所示的化合物来制备。式(ⅠB2)中，R′、P及P′如上所定义。叠氮化物还原成胺，并环化成噻唑啉，可在四氢呋喃中，在三苯基膦存在下进行。
式(ⅠB2)所示的化合物，可用式(ⅠB3)
所示的化合物可通过用叠氮化物阴离子在诸如二甲基甲酰胺之类的极性溶剂中，于-20℃-200℃，例如溶剂回流的温度下置换甲苯磺酸盐来制备，式(ⅠB3)中，R、P及P′如上所定义。
式(ⅠB3)所示的化合物的制备，可用式(ⅠB4)
所示(其中R′、P′及P如上所定义)的化合物，通过添加硫氰酸根阴离子以产生一种开环醇盐，该醇盐可以甲苯磺酰衍生物(ⅠB3)的形式被添加的对甲基苯磺酰氯所捕集。式(ⅠB4)所示化合物可用本领域专业人员所知的方法来制备。
当虚线为单键且取代基在5位上时，式(ⅠB1)所示的化合物可用式(ⅠB5)
所示的化合物来制备，其方法是用硫氰酸根阴离子取代甲苯磺酸盐(Tetrahedron Asymmetry 1992，749-752)，该置换反应可在极性溶剂如乙醇中，于-20℃至200℃，例如溶剂回流温度的非极端温度下进行，随后用相似于用式(ⅠB2)化合物制备式(ⅠB)化合物的方法进行环化。式(ⅠB5)的化合物可用相应的环氧化物，以叠氮化物阴离子将其开环，再在极性溶剂如二甲基甲酰胺中，于-20℃至200℃，例如100℃的非极端温度下，用对甲基苯磺酰氯捕集醇盐来制备(Tetrahedron Lett、1990，31(2)，221)。
当虚线代表双键并且噻唑环上的取代基在5位上时，式(ⅠB1)的化合物可通过式(ⅠB6)所示氯乙缩醛
用硫脲环化来制备，在式(ⅠB6)中，R′、P及P′如上所定义，R10为C1-4烷基。该反应可在极性溶剂如丙酮或乙醇中，于-20℃至200℃的非极端温度下进行(Chem.Abs.5414230d)。
式(ⅠB6)所示化合物，可用硫酰氯和式(ⅠB7)
所示的醛来制备，式(ⅠB7)中，R′、P及P′如上所定义(Proc.Indian.Acad.Sci.1941，14A，630-5;Chem Abs.36∶410z)。式(ⅠB7)所示化合物可市购得到，或者可用本领域专业人员已知的方法来制备。
当虚线代表双键并且噻唑环上的取代基在4位上时，式(ⅠB1)所示的化合物，可用本领域已知的方法来制备，例如α-N-苄氧基羰基-β-(2′-氨基-4′-噻唑基)丙氨酸苄酯(Synthetic Communications 1990，20(30)，3097-3102)。
(ⅲ)式(ⅠC)所示化合物
可按如下方法制备(a)当虚线为单键并且取代基在4位上时，用相似于以式(ⅠB4)所示的那些化合物制备式(ⅠB)所示化合物的方法来制备。
(b)当虚线代表单键并且取代基在噻唑啉环的5位上时，用相似于以式(ⅠB5)所示化合物制备式(ⅠB)所示化合物的方法来制备。
(c)当虚线代表双键并且取代基在噻唑啉环的4位上时，通过式(ⅠC1)所示化合物
与硫脲反应来制备。相宜的是，该环化反应可在极性溶剂如丙酮中，于-20℃至200℃，例如20℃的非极端温度下进行。
式(ⅠC1)所示化合物，可以本领域已知的方法，用通式HO2C-R′-CO2H(其中R′如上所定义)所示化合物来制备(J.Chem.Soc.1940，1304-7;Chem.Abs.35∶1133)。
(d)当虚线为双键并且取代基在噻唑啉环的5位上时，用相似于以式(ⅠB6)所示的化合物制备式(ⅠB)所示化合物的方法来制备。
式(Ⅰ)所示化合物作为离体NO合成酶抑制剂的活性，已对照人体胎盘、脑及细胞素诱导的癌细胞中分离出来的NO合成酶，进行了验证。
下面将仅以举例方式来说明本发明实施例1制备S，S′-(1，4-亚苯基二(1，2-亚乙基))二异硫脲二氢溴酸化物将1，4-亚苯基二乙酸(10.0g，51.5mmol)在四氢呋喃(200ml)，中的溶液于0℃和搅拌下滴加到氢化铝锂(3.91g，103mmol)混于四氢呋喃(30ml)而形成的悬浮液中。将该混合物加热回流3小时，然后冷至0℃。缓缓加入水(4.0ml)、15%氢氧化钠(4.0ml)及水(12ml)，使剩余的氢化铝锂骤冷。将悬浮液同硫酸镁一起搅拌5分钟、过滤并浓缩。用硅胶色谱法(乙酸乙酯/己烷梯度50-100%)提纯粗制的油状物，得到透明、无色油状的中间体二醇(7.38g，86%)。将此油状物溶于二氯甲烷(200ml)，所得溶液在0℃下用四溴化碳(32.4g，97.7mmol)及三苯基膦(25.6g，97.7mmol)处理。在20℃下将该混合物搅拌4小时，然后添加戊烷(500ml)。放置15小时后，将溶液从棕色固体物中滗析出来，加以浓缩并以硅胶色谱法(乙酸乙酯/己烷梯度0-20%)提纯，得到油状1，4-亚苯基二(1，2-亚乙基)二溴化物(8.2g，64%)。将该二溴化物(4.0g，13.7mmol)及硫脲(2.09g，27.4mmol)溶于无水乙醇(100ml)所形成的溶液回流加热2小时，冷却并浓缩至干。使初始油状物在乙醇中再结晶，得到白色晶态固体物1，4-亚苯基二(1，2-亚乙基)二异硫脲二氢溴酸盐(2.89g，47%)，溶点＝234-236℃。
1H NMR(200 MHz，D2O)δ7.26(s，4H)，3.38(t，J＝7.0Hz，4H)，3.01(t，J＝7.0Hz，4H)。
C12H20Br2N4S2的分析计算值C，32.44;H，4.54;Br，35.97;N，12.61;14.43。实测值C，32.45;H，4.59;Br，35.89;N，12.51;S，14.35。
实施例2制备S-(2-氨基-4-噻唑基)甲基)-L-半胱氨酸在由2-氨基-4-氯甲基噻唑(Spraque，J.M.等J.Am.Chem.Soc.1946，68，2155-2159)(1.0g，5.4mmol)及L-半胱氨酸盐酸盐(804mg，5.1mmol)溶于二甲基甲酰胺(10mL)所成的溶液中，添加碳酸钾(2.5g)。在22℃下，将该悬浮液搅拌18小时。将所得混合物浓缩至干，重溶于水，并加到离子交换柱(Dowex 50×8，强酸性)上。产物用具有浓度梯度的氢氧化铵(0.1N-0.5N)洗脱。将汇集起来的产物馏分予以部分浓缩并冷干，得棕褐色带静电的固态物S-(2′-氨基-4′-噻唑基甲基)-L-半胱氨酸(1.04g，87%)。
1H NMR(300 MHz，D2O)δ6.5(s，1H)，3.8(m，1H)，3.6(s，2H)，3.05-2.85(m，2H)。
质谱(CI)234(M 1，71%)。
实施例3制备γ-(2′-氨基-4′-噻唑基)-L-高丙氨酸(3-((2-氨基-4-噻唑基)甲基-L-丙氨酸)γ-(2′-氨基-4′-噻唑基)-L-高丙氨酸，按实施例6的方法，用α-N-叔丁氧基羰基-γ-(2′-氨基-4′-噻唑基)-L-高丙氨酸苄酯来制备(Patt等，Synth.Commun.1990，20(20)，3097-3102)，收率为9.6%。
1H NMR(D2O)δ6.5(s，1H)，3.9(t，J＝6.4Hz)，2.75(m，2H)，2.2(m，2H)。
C7H11N3O2S·C2HF3O2·0.3H2O的分析计算值C，29.31;H，2.89;N，8.54;S，6.52。
实测值C，29.37;H，3.02;N，8.53;S，6.63。
实施例4制备S，S′-(1，3-亚苯基二(1，2-亚乙基))二异硫脲二氢溴酸盐按实施例1的方法，用1，3-亚苯基二乙酸(Aldrich)制备S，S′-(1，3-亚苯基二(1，2-亚乙基))二异硫脲二氢溴酸盐。在乙醇中再结晶后，得到白色晶态固体物(熔点 194-190℃)。
1H NMR(200 MHz，D2O)δ7.4-7.2(m，4H)，3.39(t，J＝6.9Hz，4H)，3.02(t，J＝6.9Hz，4H)。
C12H20Br2N4S2的分析计算值C，32.44;H，4.54;Br，35.97;N，12.61;S，14.43。
实测值C，32.52;H，4.49;Br，36.04;N，12.61;S，14.35。
实施例5制备S，S′-(1，2-亚苯基二(1，2-亚乙基))二异硫脲二氢溴酸盐按实施例1的方法，用1，2-亚苯基二乙酸(Aldrich)来制备S，S′-(1，2-亚苯基二(1，2-亚乙基))二异硫脲二氢溴酸盐，产率为30%，产物为黄色泡沫状物。
1H NMR(300 MHz，D2O)δ7.29(s，4H)，3.38(t，J＝7.0Hz，4H)，3.09(t，J＝7.0Hz)。在乙醇中再结晶，得分析用样品，熔点＝205-207℃。
C12H20Br2N4S2的分析计算值C，32.44;H，4.54;Br，35.97;N，12.61;S，14.43。
实测值C，32.47;H，4.58;Br，35.92;N，12.58;S，14.43。
实施例6制备β-(2′-氨基-4′-噻唑基)丙氨酸(3-(2-氨基-4-噻唑基)-L-丙氨酸)在氮气氛和-88℃下，搅拌由α-N-叔丁氧基羰基-β-(2′-氨基-4′-噻唑基)丙氨酸苄酯(1.47g)(Patt等，Synth.Commun.1990，20(20)，2097-3102)溶于二氯甲烷(15ml)所成的溶液，往其中加入三乙基硅烷(3ml)，再加入三氟乙酸(3ml)。将所得溶液在1小时内加热到室温，然后加以浓缩。残留物用乙酸(30ml)、20% Pd/C(2.0g)及1，4-环己二烯(20ml)处理。在2小时内，将上述混合物加以声处理使其从室温升至33℃，并滤过硅藻土，用水洗涤。将滤液浓缩，再溶入30ml乙酸中，并用2.0g新鲜20% Pd/C和2ml 1，4-环己二烯处理。在经声处理2小时后，用硅藻土过滤悬浮液。重复添加新鲜催化剂三次，然后用重复半制备性逆相色谱法(C-18，以10%甲醇/含0.1%三氟乙酸的水进行洗脱)提纯粗产物。冻干产物馏分，得337mg(18%)粘稠玻璃态固体物β-(2′-氨基-4′-噻唑基)-L-丙氨酸。
1H NMR(D2O)δ 6.6(s，1H)，4.0(t，J＝7.6Hz，1H)，3.15(m，2H)。质谱(CI)188(M 1)。
C12H12N3F9O8S的分析计算值C，27.23;H，2.29;N，7.94;S，6.06。
实测值C，27.22;H，2.42;N，7.8;S，5.67。
实施例7S，S′-(2，6-亚吡啶基二(亚甲基))二异硫脲在0℃，向由2，6-吡啶二甲醇(5.0g，35.9mmol)溶于二氯甲烷(200ml)所成的溶液中添加四溴化碳(23.83g，71.9mmol)及三苯基膦(18.85g，71.9mmol)。搅拌溶液，并在6小时内加热至20℃。加入戊烷(300ml)。令溶液在20℃下静置16小时，然后过滤，以除去固体杂质。浓缩滤液至油状物，并以硅胶色谱法(己烷，然后10%乙酸乙酯/己烷)提纯，得灰白色粉未状固体物2，6-吡啶二溴化物(4.47g，47%)。在由2，6-吡啶二溴化物(3.94g，14.87mmol)溶于乙醇(100ml)所成的溶液中，加入硫脲(2.26g，29.74mmol)，在回流条件下，将所成悬浮液搅拌2小时，将所得溶液浓缩至干，得白色粉未状S，S′-(2，6-亚吡啶基二(亚甲基)二异硫脲(5.3g，83.9%)。
1H NMR(200 MHz，DMSO)δ7.95(t，J＝7.6Hz，1H)，7.51(d，J＝7.8Hz，2H)，4.65(s，4H)。
C9H15N5S2Br2·0.6H2O分析计算值C，25.26;H，3.81;N，16.36;S，14.98;Br，37.34。
实测值C，25.3;H，3.78;N，16.25;S，14.94;Br，37.38。
实施例8制备S-(2′-氨基-5′-(R，S)-噻唑啉基甲基)-L-半胱氨酸在由2-氨基-5-碘甲基噻唑啉(4.44g，12mmol)(Creeke & Mellor，Tet.Lett.1989，30(33)，4435-4438)及L-盐酸半胱氨酸(1.76g，10.0mmol)溶于二甲基甲酰胺(75ml)所成的溶液中，添加碳酸钾(5.0g，36mmol)。在22℃下，将悬浮液搅拌72小时，并回流30分钟。加入乙腈并过滤混合物。用温热的甲醇反复洗涤所得的固体物。用乙醇稀释甲醇溶液，产生白色沉淀，并以过滤法除去之。将浓缩后的滤液(油状物)溶入甲醇/乙醇中，并用乙醇盐酸处理，直至再也观察不到沉淀为止，然后过滤混合物。把浓缩滤液所得的油状物用离子交换色谱法(Dowex 50×8，强酸性)处理，用0.1N氢氧化铵洗脱，从而将其提纯。汇集茚三酮正馏分并冻干，得0.453g混杂有二甲基甲酰胺的浅棕褐色固体物。该固体物以制备性HPLC(高压液相色谱法)(C18逆相，甲醇∶水∶三氟乙酸/5∶95∶0.1)提纯，得0.36g三氟乙酸盐形式的S-(2′-氨基-5′-(R，S)-噻唑啉基甲基)-L-半胱氨酸。TLC(氢氧化铵∶甲醇/1∶50)Rf＝0.5。
1H NMR(200 MHz，D2O)δ 4.37-4.24(m，1H)，4.11-3.87(m，3H)，3.27-3.13(m，2H)，3.05-2.97(m，2H)。质谱(FAB)236.0(M 1，48%)。
C7H13N3O2S2·3(C2HF3O2)的分析计算值C，27.04;H，2.79;N，7.28;S，11.11。
实测值C，27.32;H，2.91;N，7.41;S，11.17。
实施例9制备4-((2-氨基-4-噻唑基)甲基)-L-高丙氨酸以Patt等(Synth，Commun.1990，20(20)，3097-3102)的方法，用N-t-Boc-L-2-氨基己二酸1-叔丁酯(Ramsamy等，Synthesis，1982，42-43)制备4-((2-氨基-4-噻唑基)甲基)-Nα-t-Boc-L-高丙氨酸叔丁酯，总产率为45%(1.3g)。
t-Boc及叔丁酯保护基团除去的方法如下在1.68g 4-((2-氨基-4-噻唑基)甲基)-Nα-t-Boc-L-高丙氨酸叔丁酯溶于35ml二噁烷所成的溶液中，加入1.1ml三乙基硅烷及8ml 4N盐酸二噁烷溶液。过滤混合物，将固体物先在22℃下搅拌16小时，再用二噁烷冲洗。对粗样品的核磁共振，表明反应不完全。将粗制固体物重溶于20ml二噁烷中，用4N盐酸(5ml)处理4小时。以过滤法分离出固体物，将其溶于水中，并冻干，得1.23g白色收湿性固体物4-((2-氨基-4-噻唑基)甲基)-L-高丙氨酸(二盐酸盐，水合1.4%(mol)水，并溶合0.3%(mol)二噁烷)。分析性HPLC;Phenomenex C18，水/甲醇/三氟乙酸(95/5/0.1)，k′＝0.34。
1H NMR(300 MHz，DMSO-d6)δ9.25(brs，2H)，8.5(br s 2H)，6.55(s，1H)，3.93(m，1H)，2.6(m，2H)，1.8(m，4H)。
C8H13N3O2S·2HCl·1.4H2O·0.3二噁烷的分析计算值C，32.51;H，5.99;N，12.36;S，9.43;Cl，20.86。
实测值C，32.28;H，5.72;N，12.71;S，9.60;Cl，20.86。
实施例10制备N，N′-(1，3-亚苯基二(亚甲基))二(S-甲基异硫脲)在0℃下搅拌由3.30g(25mmol)间苯二甲基二胺(Aldrich Chemical产)溶于100ml二氯甲烷所成的溶液，向其中添加7.0ml(52mmol)苯甲酰异硫氰酸酯。在20℃下，将混合物搅拌18小时，并减压除去溶剂。将粗制固体物(淡黄色)悬浮于100ml 10%氢氧化钠溶液中，并回流5分钟。趁热用浓盐酸将混合物酸化，冷却后添加氢氧化铵，使之呈碱性。收集沉淀出来的白色固体物，并于60℃下减压干燥至恒重，得4.82g灰白色固态二硫脲中间产物。
C10H14N4S2的分析计算值C，47.22;H，5.55;N，22.03;S，25.10。实测值C，47.49;H，5.50;N，21.81;S，25.01。
向2.54g(10mmol)二硫脲中间产物溶于25ml二甲基甲酰胺所成的溶液中，添加5.0ml(80mmol)碘代甲烷。在20℃下，将该溶液搅拌65小时，减压除去溶剂，并在热乙醇中使残留物重结晶。在60℃下，减压干燥淡黄色结晶，得4.28g(81%)N，N′-(1，3-亚苯基二(亚甲基))二(S-甲基异硫脲)。熔点＝164-167℃。TLC(用1%氢氧化铵甲醇溶液在硅胶上产生一个色斑，Rf＝0.48)。
1H NMR(300 MHz，DMSO/D2O)δ7.5-7.4(m，1H)，7.35-7.2(m，3H)，4.59(s，4H)，2.65(s，6H)。
C12H18N4S2·1.9HI的分析计算值C，27.43;H，3.82;N，10.66;S，12.20;1，45.89。
实测值C，27.30;H，3.91;N，10.57;S，12.19;1，45.92。
实施例11制备N，N′-(1，3-亚苯基二(亚甲基))二(S-乙基异硫脲)在由1.0g(3.93mmol)于实施例10中制得的二硫脲溶于20ml乙醇所得的溶液中，加入6.29g(78.62mmol)碘代乙烷。将该混合物加热至回流温度，历时8小时，并减压浓缩成泡沫状物。粗产物以硅胶色谱法用甲醇二氯甲烷溶液(10%至20%)提纯，得1.66g(74%)N，N′-(1，3-亚苯基二(亚甲基))二(S-乙基硫脲)。TLC(Rf＝0.3-0.48，20%甲醇二氯甲烷溶液)。质谱(FAB)311.2(M 1)。
1H NMR(200 MHz，DMSO-d6)δ 7.5-7.4(m，1H)，7.31-7.22(m，3H)，4.58(s，4H)，3.20(q，J＝7.4Hz，4H)，1.28(t，J＝7.4Hz，6H)。
C14H24N4S2·2HI的分析计算值C，29.69;H，4.27;N，9.89;S，11.32;1，44.82。
实测值C，29.44;H，4.25;N，9.64;S，11.50;1，44.65。
实施例12制备S-(3(4-((脒硫基)甲基)苯基)丙基)异硫脲以实施例1中的方法，用3-(4-羧基苯基)丙基(Lancaster Synthesis)制备(3-(4-((脒硫基)甲基)苯基)丙基)异硫脲白色固体物(2.95g，熔点＝190-195℃)。质谱(FAB)283(M 1)。
1H NMR(200 MHz，D2O)δ7.38(d，J＝8.1Hz，2H)，7.26(d，J＝8.1，Hz，2H)，4.36(s，2H)，3.06(t，J＝7.2Hz，2H)，2.74(t，J＝7.4Hz，2H)，2.1-1.9(m，2H)。
C12H18N4S2·2HBr的分析计算值C，32.44;H，4.54;N，12.61;S，14.43;Br，35.97。
实测值C，32.53;H，4.58;N，12.56;S，14.34;Br，35.85。
实施例13制备S-(2-(5-((脒硫基)甲基)-2-噻吩基)乙基)异硫脲在0℃下，向由21.48g(0.19mol)，α，α-二氯甲基·甲基醚(Fluka公司产)溶于300ml二氯甲烷所成的溶液中，添加44.76g(0.172mol)四氯化锡(Aldrich公司产)。15分钟后，在数分钟时间内滴加由24.01g(0.14mol)2-噻吩乙酸乙酯(Aldrich)溶于50ml二氯甲烷所成的溶液。1小时后将混合物倾入冰水中，并搅拌30分钟。二氯甲烷层用水洗涤、用硫酸钠脱水，并加以浓缩。粗产物用10%乙酸乙酯的己烷溶液进行硅胶色谱提纯，得22.85g(82%)5-甲酰基-2-噻吩乙酸乙酯中间产物。
在0℃下搅拌0.77g(20.29mmol)氢化铝锂在200ml四氢呋喃中所成的悬浮液，向其中加入由2.0g(10.09mmol)上述所制备的中间产物溶于50ml四氢呋喃所成的溶液。在20℃下，将该悬浮液搅拌16小时，冷至0℃，并小心地加入0.8ml水、0.8ml 1N氢氧化钠溶液及2.4ml水，以使剩余的氢化物停止反应。将悬浮液同硫酸镁一起搅拌，过滤，浓缩，并用50%乙酸乙酯的己烷溶液至100%乙酸乙酯进行硅胶色谱提纯。分离得到1.07g(67%)二醇中间产物，再将其按如下所述直接转化成二溴化物。
将上述二醇中间产物(1.07g，6.76mmol)溶于50ml二氯甲烷，在0℃下用3.90g(14.87mmol)三苯基膦及4.93g(14.87mmol)四溴化碳处理。将溶液搅拌1小时，然后往其中添加200ml戊烷，滗析出上清液，使之与油状残留物分离，浓缩所滗出的上清液，并用己烷进行硅胶色谱提纯，得1.10g(57%)二溴化物中间产物。将二溴化物产物(1.10g，3.87mmol)溶于50ml乙醇中，并用0.59g(7.75mmol)硫脲处理。在回流条件下，将溶液搅拌2小时。溶液经浓缩后，用制备性HPLC(Waters C18 Bondapak PrepPak cartridge)，以甲醇/水/三氟乙酸浓度梯度法(5/95/0.1至90/10/0.1)进行提纯。将汇集后产物馏分浓缩，用水稀释，并冻干，得306g二(三氟乙酸)盐形式并水合0.1mol水的S-(2-(5-((脒硫基)甲基)-2-噻吩基)乙基)异硫脲(溶点＝186-190℃)1H NMR(200 MHz，D2O)δ 6.98(d，J＝3.5Hz，1H)，4.57(s，2H)，3.38(t，J＝6.5Hz，2H)，3.2(t，J＝6.5Hz，2H)。
C9H14N4S3·2.0C2HF3O2·0.1H2O的分析计算值C，30.96;H，3.24;N，11.11;S，19.08。
实测值C，31.02;H，3.19;N，11.00;S，18.97。
实施例14制备S-(3-(5-(2-(脒硫基)乙基)-2-噻吩基)丙基)异硫脲按实施例13所述，制备5-甲酰基-2-噻吩乙酸乙酯。在由2.0g(10.09mmol)所说的酯溶于100ml四氢呋喃所成的溶液中，添加3.87g(11.10mmol)乙酯基亚甲基三苯基正磷(Carbethoxymethylenetriphenylphosphorane)。将该溶液回流过夜并浓缩之。将粗产物与2.0g第二种用10.54g(30.27mmol)乙酯基亚甲基三苯基正磷在100ml四氢呋喃中回流3小时所得的反应物混合。混合后的粗产物用硅胶色谱法(10%乙酸乙酯/己烷)提纯，得2.39g(44%)烯二酯(enediester)中间产物。向由1.0g(3.73mmol)所说烯二酯溶于50ml乙醇所成的溶液中，添加1.0g 10%披钯碳。在20℃及50psi氢气氛下，将混合物摇振14小时。用硅藻土滤除催化剂，并浓缩溶液，得1.0g粗二酯中间产物。对该中间产物进行的最终三种反应，其中包括氢化铝锂还原(82%)、对所成二醇进行溴化(78%)及用硫脲(88%)使二溴化物烷基化，相似于实施例13中所述的那些反应。烷基化反应的粗产物，用制备性HPLC(Waters，C18 BondaPak PrePak cartridge)法，以甲醇/水浓度梯度法10%至90%甲醇在40min内提纯(溶液以0.1%三氟乙酸缓冲)。冻干产物馏分，得1.53g S-((3-(5-(2-(脒硫基)乙基)-2-噻吩基)丙基)异硫脲，其形式为混合盐(1.0HBr，1.1TFA)并溶合0.5mol甲醇。熔点＝146-151℃。
质谱(FAB)303。(M 1)。1H NMR(200 MHz，D2O)δ6.77(d，J＝3.3，Hz，1H)，6.73(d，J＝3.3Hz，1H)，3.37(t，J＝6.6Hz，2H)，3.21-3.03(m，2H)，2.91(t，J＝7.2Hz，2H)，2.1-1.95(m，2H)。C11H18N4S3·1.0HBr·1.1C2HF3O2·0.5H2O的分析计算值C，31.35;H，4.24;Br，15.22;N，10.68;S，18.05。
实测值C，31.59;H，4.01;Br，14.94;N，10.45;S，18.05。
实施例15-17重复实施例2的方法。粗产物用制备性HPLC(Waters，C18 BondaPak Prepak cartridge)提纯。用甲醇/水/三氟乙酸(5/95/0.1至90/10/1.0)浓度梯度法洗脱，再冻干，得所需的氨基酸，其形式为三氟乙酸加成盐。
实施例15S-((2-氨基-4-噻唑基)甲基)-D-半胱氨酸用D-半胱氨酸和2-氨基-4-氯代甲基噻唑(Spraque，J.M.等，J.Am.Chem Soc.1946，68，2155-2159)来制备。分析性HPLC-phenomenex C18，水/甲醇/七氟丁酸(80/20/1.7)，一个峰，k′＝1.9。UV(pH7.0缓冲剂)λmax 254nm(logε3.73)。1H NMR(200MHz，DMSO-d6)δ8.1(br，2H)，8.1-7.5(br，2H)，6.5(s，1H)，4.25(m，1H)，3.65(d，J＝6Hz，2H)，3.0(m，2H)。
C7H11N3O2S·2.3C2HF3O2·0.1H2O的分析计算值C，27.92;H，2.72;N，8.43;S，12.85。
实测值C，28.00;H，2.89;N，8.74;S，12.62。
实施例16S-((2-氨基-4-噻唑基)甲基)-(D，L)-高半胱氨酸用(D，L)-高半胱氨酸及2-氨基-4-氯代甲基噻唑来制备(Spraque，J.M.等，J.Am.Chem Soc.1946，68，2155-2159)。分析性HPLC-phenomenex C18，水/甲醇/三氟乙酸(95/5/0.1)，一个峰，k′＝2.3。UV(pH7.0缓冲剂)λmax 254nm(logε3.73)。
1H NMR(200 MHz，DMSO-d6)δ 8.5-8.0(br，2H)，7.2-7.0(br，2H)，6.35(s，1H)，4.0(t，J＝4Hz，1H)，3.55(s，2H)，2.6(m，2H)，2.0(m，2H)。
C8H13N3O2S·1.1C2HF3O2·1.0H2O的分析计算值C，31.35;H，4.15;N，10.75;S，16.41。
实测值C，31.30;H，4.07;N，10.73;S，16.31。
实施例17S-(2-(2-氨基-4-噻唑基)乙基)-L-半胱氨酸用L-半胱氨酸及2-氨基-4-(2-溴代乙基)噻唑(用1，5-二溴-2-丁酮作原料，以Spraque等人的方法制得，J.Am.Chem.Soc.1946，68，2155-2159)作原料来制备。分析性HPLC-phenomenex C18，水/甲醇/三氟乙酸(95/5/0.1)，一个峰，k′＝2.6。UV(pH7.0缓冲剂)λmax 256nm(logε3.71)。1H NMR(200 MHz，DMSO-d6)δ9.2-8.8(br，2H)，8.6-8.2(br，2H)，6.6(s，1H)，4.2(m，1H)，3.0(m，2H)，2.8(m，2H)。
C8H13N3O2S2·2.0C2HF3O2·2.4H2O的分析计算值C，27.79;H，3.85;N，8.10;S，12.37。
实测值C，27.65;H，3.69;N，8.02;S，12.38。
实施例18制备S-(2-(4-溴代苯基)乙基)异硫脲氢溴酸盐在0℃下，向由4-溴代苯乙醇(720mg，0.5ml，3.58mmol)及三苯基膦(1.13g，4.30mmol)溶于二氯甲烷(7.0ml)所成的溶液中，添加四溴化碳(1.42g，4.30mmol)。将反应混合物搅拌30min，同时加热至室温。将溶液倾入己烷(100ml)，并滤过硅藻土。真空蒸除溶剂，添加己烷，并使溶液滤过硅藻土。在真空除去溶剂后，对粗料进行球管蒸馏(120℃/70μm Hg)，得透明油状物。
将该透明油状物溶于95%乙醇(7.0ml)，并加入硫脲(300mg，3.94mmol)。加热反应混合物至回流温度，并回流16h，冷至室温，并真空除去溶剂，得白色固体物。将该固体物悬浮于热丙酮中并过滤之，得832mg(68% 收率)的标题化合物。
1H NMR(300 MHz，d6-DMSO)δ9.02(s，4H)，7.52(d，J＝8.3Hz，2H)，7.26(d，J＝8.3Hz，2H)，3.43(t，J＝7.6Hz，2H)，291(t，J＝7.4Hz，2H)。C9H12N2SBr2的M.S.(CI)，m/z(相对强度)259(M -Br，100)，183(68)，77(92)。
C9H12N2SBr2的元素分析计算值C，31.79;H，3.56;N，8.24;S，9.43;Br，46.99。
实测值C，31.84;H，3.59;N，8.19;S，9.34;Br，46.92。
实施例19制备S-(2-(4-氟代苯基)乙基)异硫脲氢溴酸盐按实施例18的方法，用4-氟苯乙醇来制备。使标题化合物在无水乙醇中重结晶而将其提纯。
1H NMR(300 MHz，d6-DMSO)δ 9.10(br，s，2H)，8.96(br.s，2H)，7.32(m，2H)，7.14(m，2H)，3.43(t，J＝6.8Hz，2H)，2.91(t，J＝6.8Hz，2H)。
C9H12N2SFBr的M.S.(CI)，m/z(相对强度)199(M -Br，42)，77(100)。
(C9H12N2SF)(CH4N2S)0.63(HBr)1.06的元素分析计算值C，34.84;H，4.43;N，13.75;S，15.74;Br，25.51。
实测值C，35.31;H，4.41;N，13.62;S，15.51;Br，25.92。
实施例20制备S-(2-(4-(乙氧基-3-甲氧基苯基)乙基)异硫脲氢溴酸盐按实施例18的方法，用4-乙氧基-3-甲氧基苯乙醇来制备。使标题化合物在无水乙醇中重结晶而将其提纯。
1H NMR(300 MHz，d6-DMSO);δ 8.95(br，s，4H)，6.87(s，1H)，6.84(d，J＝8.1Hz，1H)，6.73(d，J＝8.2Hz，1H)，3.94(q，J＝7.0Hz，2H)，3.73(s，3H)，3.39(t，J＝7.3Hz，2H)，2.83(t，J＝7.4Hz，2H)，1.28(t，J＝7.0Hz，3H)。
C12H19N2O2SBr的M.S.(CI)，m/z(相对强度)255(M -Br，56)，179(100)。
C12H19N2O2SBr的元素分析计算值C，42.99;H，5.71;N，8.36;S，9.56;Br，23.83。
实测值C，43.09;H，5.73;N，8.42;S，9.61;Br，23.89。
实施例21制备S-(2-(4-(乙氧基苯基)乙基)异硫脲盐酸盐按实施例18的方法，用4-乙氧基苯乙醇来制备。将粗产物溶于水，并添加2摩尔当量的含水苦味酸钠。以过滤法分离出浅黄色沉淀物，并在AG1-X2阴离子交换树脂(200-400目，氯化物状态，10∶1的水∶甲醇洗脱液)上进行色谱分离，得盐酸盐。
1H NMR(300 MHz，d6-DMSO)δ9.19(br.s，4H)，7.19(d，J＝8.1Hz，2H)，6.82(d，J＝8.1Hz，2H)，3.94(q，J＝7.0Hz，2H)，3.39(t，J＝7.3Hz，2H)，2.83(t，J＝7.4Hz，2H)，1.28(t，J＝7.0Hz，3H)。
C11H17N2OSCl的M.S.(CI)，m/z(相对强度)225(M -Cl，37)，149(100)。
(C11H16N2OS)(HCl)1.08(CH4N2S)0.08(H2O)0.16的元素分析计算值C，48.81;H，6.55;N，11.10;S，12.70;Cl，14.04。
实测值C，48.91;H，6.41;N，11.12;S，12.55;Cl，14.20。
实施例22制备S-(2-(2，6-二甲氧基苯基)乙基)异硫脲盐酸盐按实施例21的方法，用2，6-二甲氧基苯乙醇来制备。
1H NMR(300 MHz，d6-DMSO)δ 9.14(br，s，4H)，7.18(t，J＝8.2Hz，1H)，6.07(d，J＝8.2Hz，2H)，3.73(s，6H)，3.39(t，J＝7.3Hz，2H)，2.83(t，J＝7.4Hz，2H)。
C11H17N2O2SCl的元素分析计算值C，47.74;H，6.19;N，10.12;S，11.48;Cl，12.81。
实测值C，47.77;H，6.19;N，10.07;S，11.48;Cl，12.87。
实施例23制备S-(2-(4-甲氧基苯基)乙基)异硫脲盐酸盐按实施例21的方法，用4-甲氧基苯乙醇来制备。
1H NMR(300 MHz，d6-DMSO)δ 9.19(br，s，4H)，7.19(d，J＝8.0Hz，2H)，6.82(d，J＝8.1Hz，2H)，3.73(s，3H)，3.39(t，J＝7.3Hz，2H)，2.83(t，J＝7.2Hz，2H)。
C11H17N2OSCl的M.S.(CI)，m/z(相对强度)211(M -Cl，22)，135(100)。
(C10H15N2OSCl)的元素分析计算值C，48.68;H，6.13;N，11.36;S，12.89;Cl，14.45。
实测值C，48.70;H，6.10;N，11.36;S，12.89;Cl，14.45。
实施例24制备2-(2-(3-甲氧基苯基)乙基)异硫脲盐酸盐按实施例21的方法，用3-甲氧基苯乙醇来制备。
1H NMR(300 MHz，d6-DMSO)δ 9.00(br，s，4H)，7.21(t，J＝7.9Hz，1H)，6.80(m，3H)，3.72(s，3H)，3.43(t，J＝7.0Hz，2H)，2.88(t，J＝7.4Hz，2H)。
C10H17N2OSCl的M.S.(CI)，m/z(相对强度)211(M -Cl，100)，135(10)，77(70)。
(C10H15N2OS)(HCl)1.05(CH4N2S)0.20(H2O)0.05的元素分析计算值C，45.39;H，6.13;N，12.62;S，14.45;Cl，13.61。
实测值C，45.28;H，6.18;N，12.54;S，14.43;Cl，13.65。
实施例25制备S-(2-(2，4，6-三甲基苯基)乙基)异硫脲氢溴酸盐按实施例18的方法，用2，4，6-三甲氧基苯乙基醇来制备。使标题化合物在无水乙醇中重结晶而将其提纯。
1H NMR(300 MHz，d6-DMSO)δ 9.00(s，4H)，6.80(s，2H)，3.24(t，J＝6.8Hz，2H)，2.84(t，J＝6.7Hz，2H)，2.49(s，3H)，2.28(s，6H)。
C12H19N2SBr的M.S.(CI)，m/z(相对强度)223(M -Br，50)，147(100)。
C12H19N2SBr的元素分析计算值C，47.53;H，6.32;N，9.24;S，10.57;Br，26.53。
实测值C，47.26;H，6.30;N，9.34;S，10.49;Br，26.48。
实施例26制备S-(2-(3-甲基苯基)乙基)异硫脲氢溴酸盐按实施例18的方法，用3-甲基苯乙醇来制备。使标题化合物在无水乙醇中重结晶而将其提纯。
1H NMR(300MHz，d6-DMSO)δ9.08(br，s，2H)，9.03(br，s，2H)，7.20(t，J＝7.5Hz，1H)，7.08(m，3H)3.43(t，J＝7.8Hz，2H)，2.88(t，J＝7.6Hz，2H)，2.28(s，3H)。
C10H15N2SBr的M.S.(CI)，m/z(相对强度)195(M -Br，100)，119(56)，77(42)。
(C10H15N2SBr)(CH4N2S)0.14的元素分析计算值C，42.60;H，5.49;N，11.17;S，12.79;Br，27.95。
实测值C，42.66;H，5.50;N，11.20;S，12.57;Br，27.79。
实施例27制备S-(2-(2-氟苯基)乙基)异硫脲盐酸盐按实施例21的方法，用2-氟代苯乙醇来制备。
1H NMR(300MHz，d6-DMSO)δ9.21(br，s，4H)，7.39(m，1H)，7.28(m，1H)，7.17(m，2H)，3.43(t，J＝7.7Hz，2H)，2.92(t，J＝7.8Hz，2H)。
C9H12N2SFCl的M.S.(CI)，m/z(相对强度)199(M -Cl，100)，123(39)。
C9H12N2SFCl的元素分析计算值C，46.05;H，5.15;N，11.93;S，13.66;Cl，15.10。
实测值C，45.93;H，5.11;N，11.83;S，13.59;Cl，15.14。
实施例28制备S-(2-(3-硝基苯基)乙基)异硫脲氢溴酸盐在0℃下，向由3-硝基苯乙醇(500mg，2.99mmol)及吡啶(35.6mg，36μl，0.45mmol)溶于THF(10ml)所成的溶液中，添加三溴化磷(298mg，0.10ml，1.10mmol)。即刻形成白色沉淀物。将反应混合物加热至室温，并搅拌1h。加入水和乙醚，并将二相分离。有机相用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤，并用无水硫酸镁脱水。过滤混合物，并真空除去溶剂，得棕色油状物。
将粗制溴化物溶于95%乙醇(10ml)，并向其中加入硫脲(251mg，3.30mmol)。将反应混合物加热回流16h，冷至室温，真空除去溶剂。将粗制黄色固体物悬浮于丙酮中，并将该混合物加热回流10min。过滤热溶液，得白色固体物。
1H NMR(300MHz，d6-DMSO)δ9.12(br，s，2H)，8.96(br，s，2H)，8.22(s，1H)，8.14(d，J＝7.9Hz，1H)，7.78(d，J＝7.6Hz，1H)，7.64(t，J＝8.0Hz，1H)，3.50(t，J＝7.0Hz，2H)，3.10(t，J＝7.2Hz，2H)。
C9H12N3O2SBr的M.S.(CI)，m/z(相对强度)226(M -Br，26)，136(36)，76(81)。
C9H12N2O2SBr的元素分析计算值C，35.31;H，3.95;N，13.72;S，10.47;Br，26.10。
实测值C，35.22;H，3.88;N，13.62;S，10.36;Br，26.18。
实施例29制备S-(2-(1H-吡咯-1-基)乙基)异硫脲在室温下，向由新蒸馏过的N-(2-溴代乙基)吡咯(1.00g，5.74mmol)溶于95%乙醇(12ml)所成的溶液中，添加硫脲(415mg，5.74mmol)。在回流下，搅拌溶液22h，冷至室温，并真空浓缩该混合物，得稠密的浅米黄色渍状物。令该油状物在室温下结晶16h以上，过滤晶体并以氯仿(10ml)冲洗，得1.078g标题所述化合物，其形态为浅米黄色针状结晶(收率75%)。
1H NMR(300 MHz，d6-DMSO)δ 9.06(br，s，4H)，6.80(t，J＝2.10Hz，2H)，5.99(t，J＝2.10Hz，2H)，4.12(t，J＝6.50Hz，2H)，3.52(t，J＝6.50Hz，2H)。
C7H12N3SBr的元素分析计算值C，33.61;H，4.84;N，16.80;S，12.82;Br，31.94。
实测值C，33.68;H，4.84;N，16.74;S，12.74;Br，31.99。
熔点94.6-95.0℃。
实施例30用下列方法测定了对NO合成酶的抑制作用由人胎盘提纯NOS
从新鲜胎盘中除去羊膜及绒毛膜，然后用0.9% NaCl冲洗胎盘。在一台Waring搅切机中，以3体积HEDS缓冲液(20mM HEPES pH7.8，0.1mM EDTA，5mM DTT，0.2M蔗糖)加0.1mM PMSF使组织匀浆化。使匀浆滤过干酐包布，再以1000g离心20min。将上清液以27，500g在离心30min。在上清液中加入固体硫酸铵，使饱和度达到32%。把沉淀出来的蛋白质以25，000g制成团粒，再将其重溶于最小体积的HEDS缓冲液加0.1mM PMSF、10μg/ml抑酶醛肽及大豆胰蛋白酶抑剂制、以及1μg/ml抑胃肽的混合液中。重溶后的丸粒以15，000g离心10min。向上清液中加入1/20体积的2.5′ADP琼脂糖树脂(Sigma)，并将浆料缓慢混合过夜。第二天一早，将浆料装入柱中。依次用HEDS、0.5M NaCl(溶于HEDS)、HEDS洗涤树脂，再用10mM NADPH(溶于HEDS)洗脱NOS。该酶可用超滤及速冻法来浓缩，并在-70℃下贮存至少3个月而不失活。
人胎盘NOS的测定按Schmidt等人的方法(PNAS，88，365-369，1991)来观察瓜氨酸的形成，以测定NOS，该方法的改变如下20mM Hepes，PH7.4，10μg/ml调钙蛋白，2.5mM CaCl2，2.5mM DTT，125μm HADPH，10μm四氢生物喋呤，0.5mg/ml BSA，以及1μML-[14C]精氨酸(New England Nuclear产)。在使用单时间点测定速度来对动力学进行研究之前，先确定NOS催化速度的线性。
从细胞诱导的人体结肠直肠腺癌DLD-1细胞中提纯NOS在37℃下，使DLD-1(ATCC编号CCL221)在补充以L-谷氨酰胺、青霉素、链霉素、以及10%热灭活胎牛血清的，5% CO2溶于RPMI 1640所成的培养基中生长。使细胞生长至融合，然后加入下列细胞素合剂100单位/ml干扰素-γ，200单位/ml白细胞介素-6(interleukin-6)，10ng/ml肿瘤坏死因子，以及0.5ng/ml白细胞素-1β(interleukin-1β)。在18-24h诱导后，刮收细胞，并以磷酸盐缓冲的盐水洗涤。将成困粒的细胞贮存在-70℃下。在4℃下，对已诱导过的NOS进行提纯。将置于TDGB(20mM tris pH7.5，10%甘油，1mM DTT，2μM四氢生物喋吟)的细胞冷冻/解冻三次，以此来制备粗浸出液。将浸出液直接加到2′，5′ADP琼脂糖(Pharmacia)柱上。顺次用TDGB、0.5M NaCl的TDGB溶液、TDGB来洗涤树脂。用2mM NADPH(溶于TDGB)来洗脱NOS。接着，加入BSA，将1mg/ml的最终浓度。NOS可予以速冻，并可在-70℃下贮存至少2月而不失活。
可诱导人体NOS的测定按上所述来测定瓜氨酸的形成，但使用10μM FAD，并从测定混合物中除去调钙蛋白和CaCl2。
从人脑中提纯NOS人脑NOS用Schmidt等人(PNAS88，365-369，1991)、Mayer等人(Fed.Eur.Biochem.Soc.288 187-191，1991)及Bredt与Snyder(PNAS 87 682-685，1990)提出的各种方法来制备。简而言之，将新鲜的整脑(3个，分离掉有髓组织，1050g)在冷缓冲液A(50mM HEPES，pH7.5(室温pH值)及0.5mM EDTA，10mM DTT，总体积3.6L)中，用多聚酯来匀浆。混合物以13，000g离心1h，并取出上清液(约2050ml)。在上清液中添加固态硫酸铵(365g，约30%饱和)，并缓慢搅拌总计30min。
沉淀物以13，000g造粒30min，并将这些团粒重新悬浮于约400ml含4μM四氢生物喋呤、1μM FAD(Sigma)及1μM FMN(Sigma)的缓冲液A中。将悬浮液以41，000g离心60min。取出上清液，倾入液氮中予以冷冻，并在-70℃下保存过夜。将混合物解冻，并使之以4ml/min流过2′，5′ADP-琼脂糖柱(0.4g，膨胀于缓冲液A中)。以100ML缓冲液A、200ml含500mM NaCl的缓冲液A、100ml缓冲液A，以及30ml含5mM NADPH的缓冲液A洗涤该柱。向酶溶液中添加四氢生物喋呤至10μM，FAD及FMN至1μM，以及加吐温(Tween)至0.1%。用Centriprep-30将该溶液浓缩至体积约为500μl。按Schmidt等于1991年所述的方法测定酶活性，但在测定时使用了10μM四氢生物喋呤。
抑制的结果示如表1。
数值为抑制常数(Ki)，该常数是通过在三种或三种以上抑制剂浓度下测量百分抑制率，并估计相对于精氨酸的竞争抑制率后而获得的。
权利要求
1.具有NO合成酶抑制作用的异硫脲衍生物供制造有利于抑制NO合成酶的疾病治疗药物的应用。
2.权利要求1所述的应用，其中异硫脲衍生物是通式(Ⅰ)
所示的化合物或其盐，式中R为(1)一个C1-14烃基;或(2)一个5-节和6节的杂环;或(3)一个9节双杂环系上述各R基团可为一或二个各自分别选自下列基团的基团所取代(a)卤;(b)-XR1，其中X为氧，C(O)m，式中m为1或2;S(O)n，式中n为0、1或2;或者NR2，式中R2为氢、C1-6烷基或C3-6环烷基，或者R2连到R1上，形成一个C2-6亚烷基;R1为氢;或C1-6烷基、C2-6链烯基、C3-6环烷基、C7-9芳烷基、C6-10芳基、或者一个5节或6节杂环基团，上述各基团可任选地为一个或二个各自分别选自下列基团的基团所取代C1-3烷基、羟基、C1-3烷氧基团、氨基、C1-3烷基氨基、卤、硝基、或者C(O)m′R2b基团，式中m′为1或2，R2b为氢或C1-4烷基;或者R1为一个NR3R4基团，式中R3和R4可相同或不同，且各为氢或C1-4烷基，或者R3和R4相连，形成一个C2-6亚烷基;(c)一个
基团，式中Y为氧;S(O)n，式中n如上所规定;或NH5，式中R5为氢或C1-4烷基;W为0或1;Q为C2-4烃基;或者亚氨基氮连接到R基团或Q基团上，形成一个5节或6节杂环;或者(d)一个基团A，其中A是一个杂环系，它可优选地为如上定义的基团
所取代;或者(e)C1-6烷基、C2-6链烯基或链炔基或者C3-6环烷基;或者R中各碳原子之一连到式(Ⅰ)所示化合物中的亚氨基氮原子上，形成一个5节或6节杂环;条件为R不是甲基。
3.权利要求2所述的应用，其中R为(1)C1-4烷基;(2)C2-4链烯基，(3)一个
基团，其中p为1至2，q为0至1;或者(4)一个5节或六节杂环，其中含有一或二个氮原子;上述各基团可任选地为一个或二个相同或不同的下列基团所取代(a)卤素，优先为溴;(b)一个OR2b′，其中R2b′为氢或甲基;(c)一个C(O)mR2b′，其中m及R2b′如上所定义;(d)一个SR9基团，其中R9为甲基或乙基;(e)一个NR7bRab基团，其中R7b和R8b各自分别选自氢或C1-4烷基，优先为氢、甲基或乙基;(f)一个可任选地为如上所定义的一个OR2b′，或
基团所取代的苯环;(g)含有一个或二个各自分别选自氮或氧的杂原子的5节或6节杂环，或者(h)C1-4烷基，优先为甲基;或者R中的一个碳原子连到式(Ⅰ)所示化合物的亚氨基氮上，形成一个噻唑或噻唑啉环。
4.权利要求2或3所述的应用，条件为R不是乙基、丙基或异丙基。
5.权利要求1或2所述的应用，其中异硫脲衍生物是式(ⅠA)、(ⅠB)或(ⅠC)所示的化合物。
式中R′为一个C1-8亚烷基，C2-8亚烯基或亚炔基，它们含或不含一个苯环、一个5节或6节杂环，或者一个如前所定义的X基团，其中虚线代表一个双键或一个单键。
6.权利要求1所述的应用，其中异硫脲衍生物为式(Ⅱ)
所示的化合物或其盐，式中Ra为一个C1-8炔基，或者5节或6节杂环，或者一个9节双环杂环系，它们各自任选地被卤素或者一个或二个-XaR1a所取代，其中R1a为氢、C1-6烷基、C3-6环烷基、C7-9芳烷基、C5-10芳基，或者一个5节或6节杂环基团，该杂环基团任选地被C1-3烷基、C1-3烷氧基、氨基、卤素或硝基所取代，或者R1a为一个NR3aR4a基团，其中R3a和R4a或同或不同，且各为氢或C1-3烷基，或者R3a和R4a相连，形成一个C2-6亚烷基，且Xa为氧;C(O)ma，其中ma为1或2;S(O)na，其中na为0、1或2;或者NR2a，其中R2a为氢、C1-6烷基或C3-6环烷基，或者R2a连到R1a上，形成一个C2-6亚烷基，或者为一个
基团所取代，其中t为0至4，Wa为0或1，Ya为氧、硫及NR7a，其中R7a为氢或C1-4烷基;或者Ra将硫原子连到式(Ⅰ)所示化合物中的一个氮原子上，形成一个5节或6节杂环，条件是Ra不是甲基。
7.权利要求1至6所述的应用，其中所述异硫脲衍生物选自S-(2-氨乙基)异硫脲S-(2-(二甲基氨基)丙基)异硫脲S-(2-甲基-2-丙烯基)异硫脲S，S′-亚乙基二(异硫脲)S，S′-1，5-亚戊基二(异硫脲)S-(2-(二甲基氨基)乙基)异硫脲2-氨基-2-噻唑啉S，S′-1，6-亚己基二(异硫脲)S，S′-1，7-亚庚基二(异硫脲)S-苄基异硫脲S-(2-吗啉代乙基)异硫脲S-(6-甲基-2-(甲硫基)-4-嘧啶基)异硫脲S，S′-(1，4亚苯基二(亚甲基)二异硫脲S-叔丁基异硫脲S-(4-乙基苄基)异硫脲S-((甲硫基)甲基)异硫脲S-(3-溴丙基)异硫脲S-(2-溴乙基)异硫脲S-(3-甲基-2-丁烯基)异硫脲S-烯丙基异硫脲S-(3-氨基丙基)异硫脲S，S′-(1，3-亚苯基二(亚甲基))二异硫脲S，S′-(2-亚甲基-1，3-亚丙基)二异硫脲S，S′-(2-丁炔-1，4-亚基)二异硫脲S，S′-(1，3亚苯基二(1，2-亚乙基)二异硫脲S，S′-(1，4-亚苯基二(1，2-亚乙基)二异硫脲2-氨基-5-甲基噻唑S-((2-氨基-4-噻唑基)甲基-L-半胱氨酸3-((2-氨基-4-噻唑基)甲基-L-丙氨酸2-氨基-4-甲基噻唑2-氨基-4，5-二甲基噻唑S-(2-(1H-吡咯-1-基)乙基)异硫脲S-(3-羟基丙基)异硫脲S-(2-苯基)乙基)异硫脲S-(2-(3-甲氧基苯基)乙基)异硫脲4-(2-氨基-4-噻唑基)甲基)-L-高丙氨酸N，N-(1，3-亚苯基二(亚甲基))二(S-甲基异硫脲)N，N-(1，3-亚苯基二(亚甲基))二(S-乙基异硫脲)S-(2-(5-((脒硫基)甲基)-2-噻吩基)乙基)异硫脲S-(3-(4-((脒硫基)甲基)苯基)丙基)异硫脲S-(3-(5-(2-脒硫基)乙基)-2-噻吩基)丙基)异硫脲S-(2-(4-氟苯基)乙基)异硫脲S-(2-(4-溴苯基)乙基)异硫脲S-(2-(3-甲氧基苯基)乙基)异硫脲S-(2-(3-甲基苯基)乙基)异硫脲S-(2-(4-乙氧基苯基)乙基)异硫脲S-(2-(4-甲氧基苯基)乙基)异硫脲S-(2-(2-溴苯基)乙基)异硫脲S-(2-(2-氟苯基)乙基)异硫脲S-(2-(3-硝基苯基)乙基)异硫脲S-(3-(1H-吡咯-1-基)丙基)异硫脲S-(2-(2-氯苯基)乙基)异硫脲S-(2-(2，5-二甲基苯基)乙基)异硫脲S-(2-(4-乙氧基-3-甲氧基苯基)乙基)异硫脲或它们的盐。
8.权利要求1至3或6中任何一项所述的应用，其中所述异硫脲衍生物选自S-乙基异硫脲、S-丙基异硫脲、S-异丙基异硫脲。
9.权利要求1所述异硫脲作治疗系统性低血压的应用。
10.权利要求1或2所述异硫脲作治疗败血性休克的应用。
11.权利要求9所述异硫脲的应用，其中系统性低血压因细胞素或细胞素诱导疗法所致。
12.权利要求1所述异硫脲作短期免疫抑制治疗的应用。
13.权利要求1所述异硫脲作自体免疫疾病治疗的应用。
14.权利要求1所述异硫脲作炎性疾病治疗的应用。
15.除了S-乙基异硫脲、S-丙基异硫脲、S-异丙基异硫脲、苄基异硫脲、S，S-(1，4-亚苯基二(亚甲基)二异硫脲及S-(2-(二甲基氨基)乙基)异硫脲之外，供药用的式(Ⅰ)所示异硫脲衍生物。
16.前列权利要求中所定义式(ⅠA)、(ⅠB)或(ⅠC)的新异硫脲衍生物。
17.权利要求16所述的异硫脲衍生物，该衍生物选自S，S′-(1，4-亚苯基二(1，2-亚乙基)二异硫脲S-(2-(1H-吡咯-1-基)乙基)二异硫脲S-((2-氨基-4-噻唑基)甲基)-L-半胱氨酸γ-(2′-氨基-4-噻唑基)-L-高丙氨酸S，S′-(1，2-亚苯基二(1，2-亚乙基)二异硫脲β-(2′-氨基-4′-噻唑基)-L-丙氨酸S-(2′氨基-5′-(R，S)-噻唑啉基甲基)-L-半胱氨酸4-((2-氨基-4-噻唑基)甲基)-L-高丙氨酸N，N-(1，3-亚苯基二(亚甲基))二(S-甲基异硫脲)N，N-(1，3-亚苯基二(亚甲基))二(S-乙基异硫脲)S-(3-(4-((脒硫基)甲基)苯基)丙基)异硫脲S-(2-(5-((脒硫基)甲基)-2-噻吩基)乙基)异硫脲S-(3-(5-((2-脒硫基)乙基)-2-噻吩基)丙基)异硫脲S-((2-氨基-4-噻唑基)甲基)-D-半胱氨酸S-((2-氨基-4-噻唑基)甲基)-(D，L)-高半胱氨酸S-(2-(2-氨基-4-噻唑基)乙基)-L-半胱氨酸S-(2-(4-氟苯基)乙基)异硫脲S-(2-(4-溴苯基)乙基)异硫脲S-(2-(3-甲氧基苯基)乙基)异硫脲S-(2-(3-甲基苯基)乙基)异硫脲S-(2-(4-乙氧基苯基)乙基)异硫脲S-(2-(4-甲氧基苯基)乙基)异硫脲S-(2-(2-溴苯基)乙基)异硫脲S-(2-(2-氟苯基)乙基)异硫脲S-(2-(3-硝基苯基)乙基)异硫脲S-(3-(1H-吡咯-1-基)丙基)异硫脲S-(2-(4-乙氧基-3-甲氧基苯基)乙基)异硫脲S-(2-(2，4，6-三甲基苯基)乙基)异硫脲S-(2-(2，6-二甲氧基苯基)乙基)异硫脲及其盐。
18.权利要求16所述异硫脲衍生物的制备方法，该方法包括a)硫脲与化合物RL(L′)r的反应，式中R如前所定义，L及L′均为离去基团，r为0或1，需要时，在反应后除去保护基团;或者b)除去式(IB1)所示化合物的保护基团，
式中R′及虚线的定义如前所述，P及P′或同或不同，均为保护基团。
19.一种医药制剂，该制剂包括除S-乙基异硫脲、S-丙基异硫脲、S-异丙基异硫脲、S-苄基异硫脲、S，S-(1，4-亚苯基二亚甲基二异硫脲及S-(2-(二甲基氨基)乙基)异硫脲之外，如前所定义的一种异硫脲衍生物，或其任一种药理学可接受的盐或其溶剂化物，以及一种或多种药理学可配伍的载体，以及可含或不含一种或多种其它治疗性成分。
20.一种有利于NO合成酶抑制的疾病治疗方法，该方法包括投给治疗有效的量的、具有对NO合成酶抑制作用的异硫脲衍生物。
全文摘要
公开了异硫脲衍生物及其在医学，尤其在有利于抑制一氧化氮合成酶的疾病治疗方面的应用，还公开了含该类衍生物的药物制剂及其制造方法。
文档编号C07D207/36GK1095710SQ9312164
公开日1994年11月30日 申请日期1993年11月26日 优先权日1992年11月27日
发明者E·P·加维, G·J·塔努力, J·A·奥普林格, E·S·富法恩 申请人:惠尔康基金会集团公司
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