苯磺酰氟类化合物及其制备方法和应用的制作方法

专利名称：：苯磺酰氟类化合物及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及到一种苯磺酰氟类化合物及其制备方法和应用，具体为以磺酰氟基(-S02F)作为反应基团，以母体苯环作为发色团、以R作为辅助取代基团的新型苯磺酰氟类化合物(ANewKindofBenzeneSulfonylFluoride)及其在氨基酸和蛋白质、肽以及含有一级氨基或二级氨基、羟基、酚羟基、巯基的化合物或其它化学物质中的应用。苯磺酰氟类化合物作为衍生化试剂及标记试剂不仅可以用于蛋白质、肽结构及氨基酸的测定、进行蛋白质或蛋白质组学研究，还可以用于新药的研究开发，亦可用作医疗卫生机构诊断疑难病症、药效评估，也可作为国家药检单位、质检单位进行质量监控的标记试剂。
背景技术：
：目前在蛋白质或蛋白质组学研究领域所应用的标记试剂中，不少产品的衍生化反应温度都在60'C-7(TC左右，较低温度也在55'C左右，因此在衍生化反应过程中将使蛋白质、肽的立体构型发生变化，导致蛋白质、肽失去生物活性，从而难以测定蛋白质的二级结构、三级结构。具体还表现在1)某些标记试剂对于组成人体蛋白质的某些氨基酸不能完全适用，例如，对二级氨基酸、色氨酸、半胱氨酸、脯氨酸、羟脯氨酸。2)某些标记试剂在与a-氨基酸的手性中心的官能团反应后，会产生内消旋化作用，导致部分或全部立体化学信息丢失。在肽中会导致手性中心部分或全部差向异构化失去生物活性。3)大多数现有标记试剂对空气中的湿度比较敏感，释放出腐蚀性气体，易于水解，从而失去其衍生化的反应活性。4)某些标记试剂与氨基酸反应所生成的衍生化产物稳定性低，影响后续检测操作的正常进行，严重者甚至会导致错误的检测结果。5)某些标记试剂由于检测灵敏度不够，无法检测出超微量的已知或未知化合物。6)某些标记试剂由于合成工序繁复，导致售价昂贵，无法普及使用。
发明内容本发明的目的在于提供一种新型的苯磺酰氟类化合物及其制备方法和应用，以克服已有技术的不足。本发明的分子中含有在可见光区或是在近紫外光区可以进行检测的结构，并且具有可以与蛋白质、肽、氨基酸及含有一级氨基、二级氨基、羟基、酚羟基、巯基的化合物或化学物质进行衍生化反应的活性基团。具有在接近人体体温(35'C-45'C左右、pH8-10左右)条件下进行衍生化反应、不产生消旋化作用、产品本身及衍生化产物稳定性高、仪器响应值高、不释放腐蚀性气体、无放射性、无环境污染、合成方便、制造成本较低、易于在室温下保存及运输的的特点。本发明提供的苯磺酰氟类化合物，具有通式为(I)的化合物其中，R为烷基、垸氧基、酰基、羧酸基、氰基、硝基、卤素或是它们的混合。本发明具有通式为(I)的化合物中可选择的取代基R二4-乙基、4-叔丁基、4-卤素、2-甲氧基、4-甲氧基、4-乙酰基、3-氰基、2-硝基、3-硝基、3-羧酸基；R-2，4-二甲基、3，5-二甲基、2-甲基-5-硝基、4-甲基-3-硝基、2-甲氧基-4-甲基、2-甲基-4-甲氧基、2,5-二甲氧基、3,4-二甲氧基、4-氟-3-硝基、2-氟-5-硝基、2-氟-4-甲基。R-2,4，6-三甲基；本发明提供的苯磺酰氟类化合物的制备方法包括的步骤在相转移催化剂聚乙二醇400-800存在下，以本发明的前体化合物苯磺酰氯和金属氟化物为原料，在有机溶剂中(以乙腈为溶剂，或二氧陆圜为^剂)，至少室温条件搅拌下，进行氟代反应1-2小时，过滤，用乙醇洗漆除去溶剂，干燥。本发明提供的苯磺酰氟类化合物应用于蛋白质、肽或氨基酸的衍生化反应及其检测；或与含有一级氨基、二级氨基、羟基、酚羟基、巯基的化合物或其它化学物质进行衍生化反应及其检测。本发明提供的苯磺酰氟类化合物是具有全新分子结构的标记试剂，它具有较低的分子量，分子量范围在178~239、6道尔顿之间，属于小分子化合物。较小的分子使得苯磺酰氟类化合物更易于向蛋白质，肽分子的二级或三级结构内滲透，进行衍生化反应，达到微量、超微量定性定量分析目的，即在温和条件(35'C-45'C左右、pH8"10左右)下能够与蛋白质、肽、氨基酸及含有一级氨基或二级氨基、羟基、酚羟基、巯基的化合物或化学物质进行衍生化反应。其衍生化产物稳定，重复性好，仪器响应值高，检测灵敏度达到nmol-fmol级，使超微量的已知或未知化合物达到化学衍生化和仪器检测的效果。苯磺酰氟类化合物温和的衍生化反应条件在对蛋白质、肽进行衍生化反应时，可以在低于蛋白质及肽的变性温度的条件下，在35°C-45'C左右进行衍生化反应。在衍生化反应中，手性中心官能团不产生经由恶唑酮机制的消旋作用，使氨基酸、肽、蛋白质及其它含有手性中心的化合物或化学物质的立体化学性息不致丟失，保持光学纯度，立体化学完整性，以及它们的生物活性，使苯磺酰氟类化合物可以在蛋白质、肽保持其生物活性的基础上推定蛋白质的二级结构、三级结构，从而使苯磺酰氟类化合物在对蛋白质及肽进行标记、定性定量检测时与现有标记试剂相比较时显示出明显的优势。本发明苯磺酰氟类化合物具有较好的稳定性，不仅使其本身在室温及干燥的环境下具有较好的稳定性(储藏时间在18个月以上)，其衍生化产物在室温及潮湿环境中也具有较好的稳定性。具体实施方式-实施例1:4-甲氧基苯磺酰氟CH30-C6H4-S02F的合成向容量为500ml具有搅拌器、回流冷凝器、温度计插孔和加料口的四口圆底烧瓶中加入氟化钠10.5g，聚乙二醇4008g和乙腈200ml。在3(TC水浴上搅拌60分钟，直至观察到氟化钠微粒大小均匀。而后向上述四口烧瓶中加入含有20.6g4-甲氧基苯磺酰氯的200ml乙腈的悬浮液。在30'C温度下继续搅拌120分钟后停止反应。把氟代反应物悬混液倒入搅拌状态下盛有400ml蒸馏水的容量为1000ml的烧杯内，静置过夜。在布氏漏斗上过滤出氟代产物，用乙醇洗涤除去乙腈，干燥称重，得4-甲氧基苯磺酰氟的粗产物14g。在乙醇溶液中重结晶，得无色结晶产品4-甲氧基苯磺酰氟，分子量190。将4-甲氧基苯磺酰氟用乙腈溶解，配置成浓度为1x1(T6mol/L的溶液，在UV3150紫外吸收分光光度计上测定在此浓度下的紫外-可见紫外吸收光谱。测得其最大吸收波长入m狄二270nm。实施例2:2-甲氧基4-甲基苯磺酰氟2-CH304-CH3-C6H4-S02F的合成向容量为500ml具有搅拌器、回流冷凝器、温度计插孔和加料口的四口烧瓶中加入氟化钠12,6g，聚乙二醇6008g和乙腈200ml。在30'C水浴上搅拌60分钟，直至观察到氟化钠微粒大小均匀。而后向上述四口烧瓶中加入含有22g2-甲氧基4-甲基苯磺酰氯的200ml乙腈的悬浮液。在30'C温度下继续搅拌120分钟后停止反应。把氟代反应物悬混液倒入搅拌状态下盛有400ml蒸馏水的容量为1000ml的烧杯内，静置过夜。在布氏漏斗上过滤出氟代产物，用乙醇洗涤除去乙腈，干燥称重，得2-甲氧基4-甲基苯磺酰氟粗产物14.2g。在乙醇溶液中重结晶，得无色结晶产品，分子量204。将2-f氧基4-甲基苯磺酰氟用乙腈溶解，配成浓度为"1(T6mol/L的溶液，在UV3150紫外吸收分光光度计上测定在此浓度下的紫外-可见紫外吸收光谱。测得其最大吸收波长入max=274nm。同样实验条件，在相转移催化剂聚乙二醇为400-800存在下(相对苯磺酰氟类化合物中不同试剂的分子质量取不同的相转移催化剂聚乙二醇)，以本发明苯磺酰氟类化合物产物的对应的前体化合物苯磺酰氯为原料，以金属氟化物(氟化钠，或氟化锂、氟化钾、氟化铷与氟化铯)为氟代试剂，在乙腈(或二氧陆圜，1,4-Dioxane)溶剂中，至少为室温条件下，进行氟代反应1-2小时，合成出本发明苯磺酰氟类化合物系列中的各种产品。见表1-3。由于相转移催化剂的应用，使得两种互不相溶的、在反应介质中也难以溶解的原料一苯磺酰氯化合物和金属氟化物在相转移催化剂作用下得以顺利反应，从而制得产率较高的苯磺酰氟类化合物。表1、2、3中所列出的标记试剂均可以参照实施例1或实施例2所示的氟代反应条件制得。表1:A系列(SIN0R0-9AS)R所代表的基团及其化合物<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>表2:B系列(SINORO-9BS)R所代表的基团及其化合物<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>表3:C系列(SIN0R0-9CS)R所代表的基团及其化合物<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>实施例3:利用4-甲氧基苯磺酰氟作为标记试剂测定二级氨基酸脯氨酸、羟脯氨酸、和N-乙基甘氨酸仪器美国Waters公司高效液相色谱仪510泵，U6k进样器，490E紫外检测器，反相C8色谱柱。试剂脯氨酸、羟脯氨酸、N-乙基甘氨酸(Aldrich产品)；苯磺酰氟类化合物系列中的4-甲氧基苯磺酰氟(SINORO"9AS2，自制)；流动相准确称取6.8g结晶醋酸钠，加约850ml去离子水溶液，用10%醋酸溶液调pH至4.2，加去离子水至1000ml，抽滤，取此溶液770ml加色谱纯乙腈230ml混匀，脱气备用；方法①准确配制浓度为2.5Mmol/L的脯氨酸水溶液、羟脯氨酸水溶液、N-乙基甘氨酸水溶液、3，4脱氢脯氨酸水溶液(内标)各100|jl，pH为9.3的硼酸钠-氨氧化钠缓冲溶液400|jl，浓度为400.0umol/L的4-甲氧基苯磺酰氟的乙腈-水(体积比为4:1)溶液100|j|。②准确吸取脯氨酸、羟基脯氨酸及N-乙基甘氨酸溶液各100yl和内标溶液100pl，加入到400plpH为9.3的硼酸钠-氢氧化钠缓冲溶液中，加入蒸馏水至总容积达到1000pl。③取上述混合液500ul与100pl浓度为400.0jjmol/L4-甲氧基苯磺酰氟的乙腈-水溶液混合，将该混合液注入微型反应管，置于38'C恒温水浴中，保温摇晃5分钟后取出，用稀盐酸调整pH到6-7,停止反应。取出，得到四种氨基酸与4-甲氧基苯磺酰氟的衍生化产物(通式为4-CH30-C6H4-S02-NH-CHR-COOH)的混合液。@取适量上述四种衍生化产物的混合液与适量的流动相溶液混合，在高效液相色谱仪上进行分离检测。(D经紫外检测器检测，得上述四种衍生化产物的吸收峰值后，以3，4脱氢脯氨酸的峰面积为标准，测得脯氨酸、羟脯氨酸、和N-乙基甘氨酸的定量数据。其检测极限达到10'9-10—12mol。实施例4:利用4-甲氧基苯磺酰氟作为标记试剂测定一级氨基酸和二级氨基酸的混合物中的二级氨基酸二级氨基酸中的脯氨酸、羟脯氨酸，N-乙基甘氨酸在尿液中异常出现，是生理学、病理学研究的对象。由于它们都是寡肽分子中的残基，因此，在检测过程中首先要把寡肽水解成氨基酸，才可以进行定量分析。由于共存于水解液中的一级氨基酸的干扰，使检测过程复杂化。复杂的检测程序和长时间的操作对被检测样的稳定性提出更高的要求，即，在其衍生化检测的过程中需要脯氨酸、羟脯氨酸及N-乙基甘氨酸的衍生化产物具有较高的稳定性。利用苯磺酰氟类化合物不仅避免了一级氨基酸的干扰，而且提高了其衍生化产物的稳定性及检测灵敏度。仪器美国Waters公司高效液相色谱仪510泵，U6k进样器，490E紫外检测器，反相C8色谱柱，Hettich离心机Mikro200。试剂3，4脱氢脯氨酸水溶液(内标)，苯磺酰氟类化合物系列中的4-甲氧基苯磺酰氟(SINORO-9AS2，自制)；方法①样品准备-尿液中寡肽水解向1ml尿液中加入浓度为12N的NaOH溶液1ml，导入耐温耐压玻璃管中，用聚四氟乙烯盖塞紧，放在热压灭菌器中，在121'C，1.034bar压力条件下加热水解60分钟后冷却至室温。按体积比为1:4的比例，向水解液中加入超纯水稀释。②向0,1ml水解液中加入适量的浓度为37。/0的浓盐酸0.1ml把水解液中和到中性。再加入浓度为0.5mol的NaOH溶液0.8ml，浓度为0.25mol的Na2C03溶液0.8ml，使含有一级氨基酸和二级氨基酸的水解液的pH上升到9.3。③邻苯二甲醛封闭一级氨基酸，4-甲氧基苯磺酰氟标记二级氨基酸，乙酸乙酯萃取取20pi尿肽水解液，与浓度为0.1(jmol/ml的3,4-脱氢-DL脯氨酸(内标)20yl混合均匀。把浓度为14.9mmol/ml的邻苯二甲醛20iJl加入到混合均匀的尿肽水解液中，在室温下摇晃3分钟，对其水解液中的一级氨基酸进行衍生化封闭。而后加入浓度为0.285mg/100|j|的4-甲氧基苯磺酰氟的乙腈溶液20iJl,在37'C，pH9.3条件下摇晃反应5分钟，完成其水解液中的二级氨基酸的衍生化封闭反应后，加酸调pH到5-6终止反应。得二级氨基酸中的脯氨酸、羟脯氨酸、N-乙基甘氨酸的4-甲氧基苯磺酰氟衍生化产物的混合液(其通式为4-CH30-C6H4-S02-NH-CHR-COOH)。向衍生化反应混合液中加入体积比为1:1的乙腈与超纯水混合液95|J|,混合均匀。另取40pi超纯水注入衍生化反应混合液及乙腈与超纯水混合液中，使最终的水相体积达到100yl。立即向其中加入0.5ml的乙酸乙酯，并注入离心管，在转速为8000RPM的离心机上离心分离5分钟。从离心管下部液相吸取25pi液体注入色谱柱供进一步分离检测用。(D高效液相色谱分离检测色谱柱流动相由溶剂A和溶剂B组成。其中溶剂A为浓度为150mmol,pH3.0磷酸二氢钠水溶液；溶剂B为由浓度为4%的N，N-二甲基甲酰胺(DMF)和容积比为4:1乙腈和水的混合液组成。溶剂A的pH用磷酸调节，在选定的梯度条件下洗脱。单柱在10分钟内完成分离和紫外检测，包括洗柱时间和柱平衡时间。(D在紫外吸收波长232nm处对脯氨酸、羟脯氨酸及N-乙基甘氨酸和4-甲氧基苯磺酰氟的衍生化产物进行定性定量测定。检测极限达到pmol级。检测数据表明利用4-甲氧基苯磺酰氟作为标记试剂具有很高的灵敏度，色谱柱可以在10分钟内完成分离检测。符合临床检测的要求。权利要求1、一种苯磺酰氟类化合物，其特征在于它具有通式为(I)的化合物其中，R为烷基、烷氧基、酰基、羧酸基、氰基、硝基、卤素或是它们的混合。2、根据权利要求1所述的苯磺酰氟类化合物，其特征在于-R-4-乙基、4-叔丁基、4-卤素、2-甲氧基、4-甲氧基、4-乙酰基、3-氰基、2-硝基、3-硝基或3-羧酸基。3、根据权利要求2所述的苯磺酰氟类化合物，其特征在于R-4-甲氧基。4、根据权利要求1所述的苯磺酰氟类化合物，其特征在于R=2,4-二甲基、3,5-二甲基、2-甲基-5-硝基、4-甲基-3-硝基、2-甲氧基-4-甲基、2-甲基斗甲氧基、2，5-二甲氧基、3,4-二甲氧基、4-氟-3-硝基、2-氟-5-硝基或2-氟-4-甲基。5、根据权利要求4所述的苯磺酰氟类化合物，其特征在于R-2-甲氧基4-甲基。6、根据权利要求1所述的苯磺酰氟类化合物，其特征在于R-2，4,6-三甲基。7、权利要求1所述的苯磺酰氟类化合物的制备方法，其特征在于包括的步骤在相转移催化剂聚乙二醇400-800存在下，以前体化合物苯磺酰氯和金属氟化物为原料，在有机溶剂中，至少室温条件，搅拌，进行氟代反应1-2小时，过滤，用乙醇洗涤除去溶剂，干燥。8、根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于所述的有机溶剂是乙腈或二氧陆圜。9、根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于所述的金属氟化物为氟化锂、氟化钠、氟化钾、氟化铷或氟化铯。10、权利要求1所述的苯磺酰氟类化合物的应用，其特征在于应用于蛋白质、肽或氨基酸的衍生化反应及其检测；或与含有一级氨基、二级氨基、羟基、酚羟基、巯基的化合物或其它化学物质进行衍生化反应及其检测。全文摘要本发明涉及到一种苯磺酰氟类化合物及其制备方法及和应用。通式为(I)的化合物，R为烷基、烷氧基、酰基、羧酸基、氰基、硝基、卤素或是它们的混合。以前体化合物苯磺酰氯和金属氟化物为原料在乙腈中进行氟代反应进行制备。以磺酰氟(-SO₂F)基作为反应基团，以母体苯环作为发色团、以R作为辅助取代基团的新型苯磺酰氟类化合物(ANewKindofBenzenesulfonylFluoride)不仅可以用于蛋白质、肽结构及氨基酸的测定、进行蛋白质或蛋白质组学研究，还可以用于新药的研究开发，亦可用作医疗卫生机构诊断疑难病症、药效评估，也可作为国家药检单位、质检单位进行质量监控的标记试剂。文档编号C07C303/02GK101585787SQ20091006930公开日2009年11月25日申请日期2009年6月18日优先权日2009年6月18日发明者李寿椿申请人:李寿椿