专利名称：一种用于治疗鸭病毒性疾病的鸭白细胞干扰素的制作方法
技术领域：
本发明属于兽药技术领域，涉及一种治疗鸭病毒性疾病的鸭白细胞干扰素的制备 方法及其抗病毒活性的测定。
背景技术：
随着国民经济的飞速发展及农业结构的科学调整，养鸭业成了畜牧业发展速度很 快的一个产业。在养鸭业迅速发展的大好背景下，鸭的流动性大大增加，鸭的集约化生产程 度进一步提高，鸭疾病对鸭生产所造成的影响变得越来越突出。如何有效防治鸭疾病、减少 经济损失，成为大家非常关心的问题之一。目前，主要是以防疫为手段来控制鸭病毒性疾病 的发生。近年来各方面的研究发现，干扰素(病毒的干扰作用是由一种物质引起的，该物质 称之为干扰素)具有抗病毒作用外，还具有抗肿瘤作用，对免疫系统的调节作用和抗细胞 等一系列的生理活性，但在兽医学领域，动物干扰素未能被广泛应用，主要原因在于目前所 获得的动物干扰素安全性不高，制造工艺复杂，成本高，售价昂贵，效果不显著，推广受到限 制。本发明目的是旨在克服上述缺点，提供一种治疗鸭病毒性疾病的鸭白细胞干扰 素。该鸭白细胞干扰素作为一种广谱抗病毒药物，用于治疗鸭瘟、鸭病毒性肝炎、鸭源性新 城疫、鸭源性减蛋综合症等疾病。干扰素抗病毒具有以下特点1、干扰素抗病毒不是杀灭而是抑制病毒，一旦撤去干扰素，病毒往往又重新繁殖。 只有用足够浓度的干扰素，长期使用，才有可能将其彻底消灭。因此干扰素需要长期使用治 疗。2、干扰素具有种属特异性，人干扰素一般只用于治疗人的疾病。因此要对抗鸭病 毒病就要制备鸭干扰素。3、不同的细胞种类和不同的动物、不同的病毒感染类型对干扰素的敏感性不同。 因此，类型不同的干扰素临床效果也有所不同。关于干扰素的研究报道很多，其制备方法已日渐成熟，但由于干扰素具有种属特 异性，针对不同的物种要用相应的干扰素来治疗效果最好。同时不同的细胞种类和不同的 动物、不同的病毒感染类型对干扰素的敏感性不同。因此，类型不同的干扰素临床效果也有 所不同。要对抗鸭病毒性疾病就要制备鸭干扰素。目前还未见有关利用鸭血制备鸭白细胞 干扰素的报道。因此，提供一种有效预防和治疗鸭病毒性疾病的鸭白细胞干扰素的制备方法，是 该技术领域科研人员急需开发的新课题之一。
发明内容
本发明的目的在于在现有技术的基础上改进，提供一种鸭白细胞干扰素的制备方法。
3
为实现上述目的本发明所采用的实施方式如下一种鸭白细胞干扰素的制备及其抗病毒活性的测定方法，其特征在于具体实施步 骤如下(1)制备鸭血清无菌采集鸭血，4°C冰箱放置，自然析出，用0. 2% CaCl2处理血 浆，除去纤维蛋白，0. 22 μ m过滤除菌，置-20°c保存备用；(2)制备白细胞无菌采集健康鸭血，加入100μ g/ml双抗和适量枸橼酸抗凝剂， 4°C冰箱放置；以4000rpm离心30min，收集中层白细胞，灰黄层，用PBS清洗再次离心分离， 收集沉淀白细胞，用加了 100 μ g/ml双抗及上述鸭血清的DMEM培养液稀释白细胞沉淀物， 使白细胞浓度稀释为1 XlO6Ail ；(3)白细胞悬液中加入效价高的人白细胞干扰素作为启动干扰素，使培养液中含 干扰素抗病毒活性100 500单位/ml，于37°C水浴搅拌培养3 4h ；(4)在启动的白细胞悬液中加入适量诱生剂鸭源性新城疫病毒(用前在9日龄鸭 胚中扩增并测定血凝效价为1 1280)，使其最终浓度为320血凝单位/ml，37°C水浴摇床 培养18 24h ；(5)待干扰素达到最高峰时，离心收集上清，加入盐酸调至PH2.0 3.0，4°C，放置 3 5天，灭活病毒，再加NaHCO3调至pH7. 0 8. 0，无菌4°C离心4000rpm30min，收集上清 干扰素，除去沉淀及杂质，即得粗制鸭白细胞干扰素；(6)鸭白细胞干扰素抗病毒活性检测，主要步骤是10日龄SPF鸭胚去掉四肢、 头部及内脏，加2倍体积胰酶消化，37°C消化IOmin左右，等成絮状时倒掉胰酶，加入DMEM 培养基反复吹打，制备DEF，吹打均勻后过滤，取一滴滤液在细胞记数板查看细胞密度，以 IX IO4Cells/空密度将DEF铺于96孔板，每孔100 μ 1，待细胞长成单层后，加入10倍梯度 稀释的鸭白细胞干扰素，37°C、CO2，作用24h左右，接VSV病毒1000TCID5(1，37°C、CO2，培养 24h左右，镜检阳性对照孔有75%病变，加鸭白细胞干扰素孔有达到及小于50%时，记录结^ ο本发明的有益效果是根据干扰素治疗的种属特异性，制备了鸭白细胞干扰素治 疗鸭病毒性疾病。虽然目前基因工程干扰素研究很热，但其具有制备成本高，产量低，在临 床推广中受到限制。本发明利用鸭血制备鸭白细胞干扰素的方法其具有很多优点制备 成本低，使用剂量低，疗效好。在保证质量的前提下，利用鸭血制备鸭白细胞干扰素能够降 低了药物的成本。因此该产品具有巨大市场前景和很好的经济效益。本产品注入动物机体 后，具有疗效好、安全可靠、用量低、无毒副作用和成本低等优点。
具体实施例方式实施例1 一种鸭白细胞干扰素的制备方法，具体步骤如下(1)制备鸭血清无菌采集鸭血，4°C冰箱放置，自然析出，用0. 2% CaCl2处理血 浆，除去纤维蛋白，0. 22 μ m过滤除菌，置-20°c保存备用，用量为4 8% ；(2)制备白细胞无菌采集健康鸭血，加入100μ g/ml双抗和适量枸橼酸抗凝剂， 4°C冰箱放置；以4000rpm离心，30min,收集中层白细胞，灰黄层，用PBS清洗再次离心分离， 收集沉淀白细胞，用加了 100 μ g/ml双抗及上述鸭血清的DMEM培养液稀释白细胞沉淀物， 使白细胞浓度稀释为1 XlO6Ail ；
(3)白细胞悬液中加入效价高的人白细胞干扰素作为启动干扰素，使培养液中含 干扰素抗病毒活性400单位/ml，于37°C水浴搅拌培养4h ；(4)在启动的白细胞悬液中加入适量诱生剂鸭源性新城疫病毒，使其最终浓度为 512血凝单位/ml，37°C水浴摇床培养18h ；(6)待干扰素达到最高峰时，4°C 4000rpm离心，收集上清，加入盐酸调至pH3.0， 40C，放置3天，灭活病毒，再加NaHCO3调至pH7. 0 8. 0，4°C 4000rpm离心30min,收集上 清干扰素，除去沉淀及杂质，过滤除菌，即得粗制鸭白细胞干扰素。实施例2 —种鸭白细胞干扰素抗病毒活性检测的方法，具体步骤如下(1)将10日龄SPF鸭胚去掉四肢、头部及内脏，用加有100 μ g/ml双抗的PBS冲洗 2次，洗去血液，剪碎，加2倍体积胰酶消化，37°C IOmin左右；(2)等剪碎组织成絮状时倒掉胰酶，加入DMEM培养液，移液枪反复吹打；(3)吹打均勻后纱布过滤，除去未消化的大块及杂质，制备成DEF ；(4)取一滴滤液在细胞记数板查看细胞密度，以1 X IO4Cells/孔密度将DEF铺于 96孔板，每孔100μ 1 ；(5)待细胞长成单层后，加入100 μ 1 10倍梯度稀释的鸭白细胞干扰素，37°C、C02， 作用24h左右；(6)接 VSV 病毒 1000 TCID50, 37°C、CO2,培养 24h 左右；(7)镜检阳性对照孔有75%病变，加鸭白细胞干扰素孔有达到及小于50%时，记 录结果。结果见表1 表1试验数据 表1中数据表明，半数保护量(PD5tl)介于10_4和10_5之间，按Reed-Muench法计 算。公式为
50%—低于50%百分率50—28.9距离比例=-=-=0.79
高于50%百分率一低于50%百分率55.6—28.9按公式低于50%百分率的鸭白细胞干扰素的对数 距离比例X稀释系数的对 数=-4-0. 79 = -4. 79，查对数表。实施例3 本鸭白细胞干扰素对在鸭上的应用
对实施例1所述工艺制备的鸭白细胞干扰素，按照农业部公告第442号发布的兽 用生物制品临床试验研究资料要求进行以下研究1、试验动物20日龄健康鸭80只，常规方式饲喂。2、攻毒对60只攻等量鸭瘟弱毒，均致发病。3、试验方法待症状出现，立即进行临床治疗试验。随机分为4组，每组20只。低 剂量鸭白细胞干扰素溶液剂量为20IU/kg ；中剂量鸭白细胞干扰素溶液剂量为60IU/kg ；高 剂量鸭白细胞干扰素溶液剂量为100IU/kg，空白组不给药，注射，均一日一次，连续7天。4、试验结果低剂量组症状减轻，精神、食欲等均好转；中剂量组跟高剂量组均恢 复健康，精神、食欲等恢复正常。通过上述实施例，我们发现所提取的鸭白细胞转移因子对于鸭的病毒病起到治疗 作用。因此本发明可以进行大规模的生产推广。本发明可以做成各种剂型，口服剂型、糖浆剂型等，还可通过常规冻干工艺进一步 可得到鸭白细胞干扰素的粉末，结合常规辅料，可制成胶囊、片剂等剂型。
权利要求
一种用于治疗鸭病毒性疾病的鸭白细胞干扰素，其特征在于原料优选为鸭血。
2.根据权利要求1所述的鸭白细胞干扰素，其特征在于诱生剂可以为鸭瘟病毒、鸭病 毒性肝炎病毒、鸭源性新城疫病毒、鸭源性减蛋综合症病毒，其中优选鸭源性新城疫病毒。
3.根据权利要求1所述的鸭白细胞干扰素，其特征在于活性检测可以选择鸭胚成纤 维细胞、鸡胚成纤维细胞、Wish细胞等，其中优选鸭胚成纤维细胞。
全文摘要
本发明公开了一种治疗鸭病毒性疾病的鸭白细胞干扰素的制备及活性检测方法，使用鸭源性新城疫病毒作为诱生剂诱导健康鸭白细胞，包括原料制备→混合→水浴搅拌培养→离心收获→灭活病毒→除菌→抗病毒活性检测等工序。本发明成功利用了鸭新鲜全血作为原料，制备工艺简便，产品质量可靠。鸭白细胞干扰素用于鸭机体后，具有疗效好、安全可靠和无毒副作用等特点。其功能是作为一种广谱抗病毒，治疗鸭瘟，鸭病毒性肝炎、鸭源性新城疫、鸭源性减蛋综合征等病毒性疾病。本品用于动物机体，具有疗效好、安全可靠、用量低、无毒副作用和成本低等优点。
文档编号C07K14/555GK101906157SQ20091006913
公开日2010年12月8日 申请日期2009年6月4日 优先权日2009年6月4日
发明者王小娥 申请人:天津瑞普生物技术股份有限公司
技术领域：
本发明属于兽药技术领域，涉及一种治疗鸭病毒性疾病的鸭白细胞干扰素的制备 方法及其抗病毒活性的测定。
背景技术：
随着国民经济的飞速发展及农业结构的科学调整，养鸭业成了畜牧业发展速度很 快的一个产业。在养鸭业迅速发展的大好背景下，鸭的流动性大大增加，鸭的集约化生产程 度进一步提高，鸭疾病对鸭生产所造成的影响变得越来越突出。如何有效防治鸭疾病、减少 经济损失，成为大家非常关心的问题之一。目前，主要是以防疫为手段来控制鸭病毒性疾病 的发生。近年来各方面的研究发现，干扰素(病毒的干扰作用是由一种物质引起的，该物质 称之为干扰素)具有抗病毒作用外，还具有抗肿瘤作用，对免疫系统的调节作用和抗细胞 等一系列的生理活性，但在兽医学领域，动物干扰素未能被广泛应用，主要原因在于目前所 获得的动物干扰素安全性不高，制造工艺复杂，成本高，售价昂贵，效果不显著，推广受到限 制。本发明目的是旨在克服上述缺点，提供一种治疗鸭病毒性疾病的鸭白细胞干扰 素。该鸭白细胞干扰素作为一种广谱抗病毒药物，用于治疗鸭瘟、鸭病毒性肝炎、鸭源性新 城疫、鸭源性减蛋综合症等疾病。干扰素抗病毒具有以下特点1、干扰素抗病毒不是杀灭而是抑制病毒，一旦撤去干扰素，病毒往往又重新繁殖。 只有用足够浓度的干扰素，长期使用，才有可能将其彻底消灭。因此干扰素需要长期使用治 疗。2、干扰素具有种属特异性，人干扰素一般只用于治疗人的疾病。因此要对抗鸭病 毒病就要制备鸭干扰素。3、不同的细胞种类和不同的动物、不同的病毒感染类型对干扰素的敏感性不同。 因此，类型不同的干扰素临床效果也有所不同。关于干扰素的研究报道很多，其制备方法已日渐成熟，但由于干扰素具有种属特 异性，针对不同的物种要用相应的干扰素来治疗效果最好。同时不同的细胞种类和不同的 动物、不同的病毒感染类型对干扰素的敏感性不同。因此，类型不同的干扰素临床效果也有 所不同。要对抗鸭病毒性疾病就要制备鸭干扰素。目前还未见有关利用鸭血制备鸭白细胞 干扰素的报道。因此，提供一种有效预防和治疗鸭病毒性疾病的鸭白细胞干扰素的制备方法，是 该技术领域科研人员急需开发的新课题之一。
发明内容
本发明的目的在于在现有技术的基础上改进，提供一种鸭白细胞干扰素的制备方法。
3
为实现上述目的本发明所采用的实施方式如下一种鸭白细胞干扰素的制备及其抗病毒活性的测定方法，其特征在于具体实施步 骤如下(1)制备鸭血清无菌采集鸭血，4°C冰箱放置，自然析出，用0. 2% CaCl2处理血 浆，除去纤维蛋白，0. 22 μ m过滤除菌，置-20°c保存备用；(2)制备白细胞无菌采集健康鸭血，加入100μ g/ml双抗和适量枸橼酸抗凝剂， 4°C冰箱放置；以4000rpm离心30min，收集中层白细胞，灰黄层，用PBS清洗再次离心分离， 收集沉淀白细胞，用加了 100 μ g/ml双抗及上述鸭血清的DMEM培养液稀释白细胞沉淀物， 使白细胞浓度稀释为1 XlO6Ail ；(3)白细胞悬液中加入效价高的人白细胞干扰素作为启动干扰素，使培养液中含 干扰素抗病毒活性100 500单位/ml，于37°C水浴搅拌培养3 4h ；(4)在启动的白细胞悬液中加入适量诱生剂鸭源性新城疫病毒(用前在9日龄鸭 胚中扩增并测定血凝效价为1 1280)，使其最终浓度为320血凝单位/ml，37°C水浴摇床 培养18 24h ；(5)待干扰素达到最高峰时，离心收集上清，加入盐酸调至PH2.0 3.0，4°C，放置 3 5天，灭活病毒，再加NaHCO3调至pH7. 0 8. 0，无菌4°C离心4000rpm30min，收集上清 干扰素，除去沉淀及杂质，即得粗制鸭白细胞干扰素；(6)鸭白细胞干扰素抗病毒活性检测，主要步骤是10日龄SPF鸭胚去掉四肢、 头部及内脏，加2倍体积胰酶消化，37°C消化IOmin左右，等成絮状时倒掉胰酶，加入DMEM 培养基反复吹打，制备DEF，吹打均勻后过滤，取一滴滤液在细胞记数板查看细胞密度，以 IX IO4Cells/空密度将DEF铺于96孔板，每孔100 μ 1，待细胞长成单层后，加入10倍梯度 稀释的鸭白细胞干扰素，37°C、CO2，作用24h左右，接VSV病毒1000TCID5(1，37°C、CO2，培养 24h左右，镜检阳性对照孔有75%病变，加鸭白细胞干扰素孔有达到及小于50%时，记录结^ ο本发明的有益效果是根据干扰素治疗的种属特异性，制备了鸭白细胞干扰素治 疗鸭病毒性疾病。虽然目前基因工程干扰素研究很热，但其具有制备成本高，产量低，在临 床推广中受到限制。本发明利用鸭血制备鸭白细胞干扰素的方法其具有很多优点制备 成本低，使用剂量低，疗效好。在保证质量的前提下，利用鸭血制备鸭白细胞干扰素能够降 低了药物的成本。因此该产品具有巨大市场前景和很好的经济效益。本产品注入动物机体 后，具有疗效好、安全可靠、用量低、无毒副作用和成本低等优点。
具体实施例方式实施例1 一种鸭白细胞干扰素的制备方法，具体步骤如下(1)制备鸭血清无菌采集鸭血，4°C冰箱放置，自然析出，用0. 2% CaCl2处理血 浆，除去纤维蛋白，0. 22 μ m过滤除菌，置-20°c保存备用，用量为4 8% ；(2)制备白细胞无菌采集健康鸭血，加入100μ g/ml双抗和适量枸橼酸抗凝剂， 4°C冰箱放置；以4000rpm离心，30min,收集中层白细胞，灰黄层，用PBS清洗再次离心分离， 收集沉淀白细胞，用加了 100 μ g/ml双抗及上述鸭血清的DMEM培养液稀释白细胞沉淀物， 使白细胞浓度稀释为1 XlO6Ail ；
(3)白细胞悬液中加入效价高的人白细胞干扰素作为启动干扰素，使培养液中含 干扰素抗病毒活性400单位/ml，于37°C水浴搅拌培养4h ；(4)在启动的白细胞悬液中加入适量诱生剂鸭源性新城疫病毒，使其最终浓度为 512血凝单位/ml，37°C水浴摇床培养18h ；(6)待干扰素达到最高峰时，4°C 4000rpm离心，收集上清，加入盐酸调至pH3.0， 40C，放置3天，灭活病毒，再加NaHCO3调至pH7. 0 8. 0，4°C 4000rpm离心30min,收集上 清干扰素，除去沉淀及杂质，过滤除菌，即得粗制鸭白细胞干扰素。实施例2 —种鸭白细胞干扰素抗病毒活性检测的方法，具体步骤如下(1)将10日龄SPF鸭胚去掉四肢、头部及内脏，用加有100 μ g/ml双抗的PBS冲洗 2次，洗去血液，剪碎，加2倍体积胰酶消化，37°C IOmin左右；(2)等剪碎组织成絮状时倒掉胰酶，加入DMEM培养液，移液枪反复吹打；(3)吹打均勻后纱布过滤，除去未消化的大块及杂质，制备成DEF ；(4)取一滴滤液在细胞记数板查看细胞密度，以1 X IO4Cells/孔密度将DEF铺于 96孔板，每孔100μ 1 ；(5)待细胞长成单层后，加入100 μ 1 10倍梯度稀释的鸭白细胞干扰素，37°C、C02， 作用24h左右；(6)接 VSV 病毒 1000 TCID50, 37°C、CO2,培养 24h 左右；(7)镜检阳性对照孔有75%病变，加鸭白细胞干扰素孔有达到及小于50%时，记 录结果。结果见表1 表1试验数据 表1中数据表明，半数保护量(PD5tl)介于10_4和10_5之间，按Reed-Muench法计 算。公式为
50%—低于50%百分率50—28.9距离比例=-=-=0.79
高于50%百分率一低于50%百分率55.6—28.9按公式低于50%百分率的鸭白细胞干扰素的对数 距离比例X稀释系数的对 数=-4-0. 79 = -4. 79，查对数表。实施例3 本鸭白细胞干扰素对在鸭上的应用
对实施例1所述工艺制备的鸭白细胞干扰素，按照农业部公告第442号发布的兽 用生物制品临床试验研究资料要求进行以下研究1、试验动物20日龄健康鸭80只，常规方式饲喂。2、攻毒对60只攻等量鸭瘟弱毒，均致发病。3、试验方法待症状出现，立即进行临床治疗试验。随机分为4组，每组20只。低 剂量鸭白细胞干扰素溶液剂量为20IU/kg ；中剂量鸭白细胞干扰素溶液剂量为60IU/kg ；高 剂量鸭白细胞干扰素溶液剂量为100IU/kg，空白组不给药，注射，均一日一次，连续7天。4、试验结果低剂量组症状减轻，精神、食欲等均好转；中剂量组跟高剂量组均恢 复健康，精神、食欲等恢复正常。通过上述实施例，我们发现所提取的鸭白细胞转移因子对于鸭的病毒病起到治疗 作用。因此本发明可以进行大规模的生产推广。本发明可以做成各种剂型，口服剂型、糖浆剂型等，还可通过常规冻干工艺进一步 可得到鸭白细胞干扰素的粉末，结合常规辅料，可制成胶囊、片剂等剂型。
权利要求
一种用于治疗鸭病毒性疾病的鸭白细胞干扰素，其特征在于原料优选为鸭血。
2.根据权利要求1所述的鸭白细胞干扰素，其特征在于诱生剂可以为鸭瘟病毒、鸭病 毒性肝炎病毒、鸭源性新城疫病毒、鸭源性减蛋综合症病毒，其中优选鸭源性新城疫病毒。
3.根据权利要求1所述的鸭白细胞干扰素，其特征在于活性检测可以选择鸭胚成纤 维细胞、鸡胚成纤维细胞、Wish细胞等，其中优选鸭胚成纤维细胞。
全文摘要
本发明公开了一种治疗鸭病毒性疾病的鸭白细胞干扰素的制备及活性检测方法，使用鸭源性新城疫病毒作为诱生剂诱导健康鸭白细胞，包括原料制备→混合→水浴搅拌培养→离心收获→灭活病毒→除菌→抗病毒活性检测等工序。本发明成功利用了鸭新鲜全血作为原料，制备工艺简便，产品质量可靠。鸭白细胞干扰素用于鸭机体后，具有疗效好、安全可靠和无毒副作用等特点。其功能是作为一种广谱抗病毒，治疗鸭瘟，鸭病毒性肝炎、鸭源性新城疫、鸭源性减蛋综合征等病毒性疾病。本品用于动物机体，具有疗效好、安全可靠、用量低、无毒副作用和成本低等优点。
文档编号C07K14/555GK101906157SQ20091006913
公开日2010年12月8日 申请日期2009年6月4日 优先权日2009年6月4日
发明者王小娥 申请人:天津瑞普生物技术股份有限公司
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