专利名称：鲍氏志贺氏菌7型的o－抗原特异的核苷酸的制作方法
技术领域：
本发明涉及鲍氏志贺氏菌7型(Shigella boydii7)中控制O-抗原合成的基因簇的核苷酸全序列，特别是涉及鲍氏志贺氏菌7型中控制O-抗原合成的基因簇中的寡核苷酸，可利用这些对O-抗原特异的寡核苷酸快速、准确地检测人体及环境中的鲍氏志贺氏菌7型并鉴定这些致病菌中的O-抗原。
O-抗原是革兰氏阴性细菌脂多糖中的O特异性多糖成分，它由许多重复的寡糖单位组成。O-抗原的合成过程研究得较清楚先由糖基转移酶将核苷二磷酸单糖转移到一个固定在细胞内膜的脂分子上，然后在内膜的内侧合成寡糖单位，O-抗原的寡糖单位再通过转运酶被转移到内膜外侧，而后通过聚合酶聚合成多糖，再被连接到一个糖脂分子上形成脂多糖分子[Whitfield，C.(1995)“Biosynthesis of lipopolysaccharide Oantigens”.Trends in Microbiology.3178-185；Schnaitman，C.A.andJ.D.Klena.(1993)“Genetics of lipopolysaccharide biosynthesis inentericbacteria”.Microbiological Reviews，57(3)655-682]。编码负责O-抗原合成的所有酶分子的基因一般在染色体上相邻排列，形成一个基因簇[Reeves，P.R.，et al.(1996)“Bacterial polysaccharide synthesis and genenomenclature”Trends in Microbiology，4495-503]。在志贺氏菌、大肠杆菌和沙门氏菌中，O-抗原基因簇位于galF和gnd基因之间[Lei Wang.et al(2001)“Sequence analysis of four Shigella boydii O-antigen lociimplicationfor Escherichia coli and Shigella relationships”.Infection andImmunity，116923-6930；Lei Wang and Peter Reeves(2000)“TheEscherichia coli O111 and Salmonella enterica O35 gene clustersgeneclusters encoding the same colitose-containing O antigen are highlyconserved”.Journal of Bacteriology.1825256-5261]。O-抗原基因簇含有三类基因糖合成路径基因，糖基转移酶基因，寡糖单位处理基因。其中糖合成路径基因编码的酶合成O-抗原所需的核苷二磷酸单糖；糖基转移酶基因编码的酶将核苷二磷酸单糖及其它分子转到单糖上从而使单糖聚合成寡糖单位；寡糖单位处理基因包括转运酶基因和聚合酶基因，它们将寡糖单位转移到细菌内膜外侧，再聚合成多糖。糖基转移酶基因和寡糖单位处理基因只存在于携带这些基因的基因簇里。O-抗原中单糖的不同，单糖间联结键的不同和寡糖单位之间联结键的不同构成了O-抗原的多样性，而单糖的组成、单糖间的联结键及寡糖单位之间的联结键是由O-抗原基因簇中的基因控制着，所以O-抗原基因簇决定了O-抗原的合成，也决定了O-抗原的多样性。
因为O-抗原是极强的抗原，是志贺氏菌重要的致病因素之一，同时它又具有极强的多样性，这启示我们能研究一种快速、准确地检测志贺氏菌及其O-抗原的特异性好、灵敏度高的方法。以表面多糖为目标的血清学免疫反应自上世纪30年代以来一直被用于对细菌的分型和鉴定，是鉴定致病菌的唯一的手段。这种诊断方法需要大量的抗血清，而抗血清一般种类不全，数量不足，大量的抗血清在制备和储存中也存在一些困难。另一方面此法耗时长、灵敏度低、漏检率高、准确性差，所以，现在普遍认为这种传统的血清学检测方法将为现代分子生物学方法取代。1993年，Luk，J.M.C et.al用沙门氏菌(S.enterica)O-抗原基因簇的特异核苷酸序列通过PCR方法鉴定了沙门氏菌的O-抗原[Luk，J.M.C.et.al.(1993)“Selective amplification ofabequose and paratose synthase genes(rfb)by polymerase chain reactionfor identification of S.enterica major serogroups(A，B，C2，andD)”，J.Clin.Microbiol.312118-2123]。Luk，et.al的方法是将相应于沙门氏菌血清型E1，D1，A，B和C2的O-抗原内的CDP-阿比可糖和CDP-泰威糖的合成基因的核苷酸序列排列后得到对不同血清型的沙门氏菌特异的寡核苷酸。1996年，Paton，A.W et.al用针对E.coli O111的O-抗原特异的源于wbdI基因的寡核苷酸鉴定了一株产毒素的E.coli O111的血清型[“Molecularmicrobiological investigation of an outbreak of Hemolytic-UremicSyndrome caused by dry fermented sausage contaminated with Shiga-liketoxin producing Escherichiacoli”.J.Clin.Microbiol.341622-1627]，但是后来的研究表明Paton，A.W et.al的用源于wbdI基因的寡核苷酸鉴定E.coli O111的血清型的方法有假阳性结果出现。Bastin D.A.and Reeves，P.R.认为，这是由于wbdI基因是一个推测的糖合成路径基因[Bastin D.A.andReeves，P.R.(1995)Sequence and analysis of the O antigen gene(rfb)cluster of Escherichia coli O111.Gene 16417-23]，而在其它细菌的O-抗原的结构中也可能有这个糖，所以糖合成路径基因对于O-抗原并不是高度特异的。
志贺氏菌有46种血清型，大肠杆菌有166种不同的O-抗原，二者亲缘关系非常近，并且有12种O-抗原是大肠杆菌和志贺氏菌共有的，其中鲍氏志贺氏菌7型就拥有相同的O-抗原[Ewing，W.H.(1986)“Edwards and Ewing’sidentification of the Enterobacteriaceae”.Elsevier SciencePublishers，Amsterdam，The Netherlands；T.cheasty，et al.(1983)“Antigenic relationships between the enteroinvasive Escherichiacoli antigens O28ac，O112ac，O124，O136，O143，O144，O152 and O164 andShigella O antigens”J.clin Microbiol，17(4)681-684]，传统的血清型方法不能将它们区分。
本发明的次一目的是提供了鲍氏志贺氏菌7型的O-抗原基因簇的全长核苷酸序列。
本发明的另一目的是提供了构成鲍氏志贺氏菌7型的O-抗原基因簇的基因转运酶的基因即wzx基因或与wzx有相似功能的基因；聚合酶基因即wzy基因或与wzy有相似功能的基因；糖基转移酶基因，包括orf8、orf10、orf11、orf12基因；糖合成路径基因，包括flmA，flmB，neuA，flmD，flmH，nue，glf。
本发明的又一目的是提供了寡核苷酸，它们分别源于鲍氏志贺氏菌7型的O-抗原基因簇中编码糖基转移酶的基因包括orf8、orf10、orf11、orf12基因；源于编码转运酶的基因即wzx基因或与wzx有相似功能的基因、源于编码聚合酶的基因即wzy基因或与wzy有相似功能的基因；它们是上述基因内的寡核苷酸，长度在10-20nt；它们对鲍氏志贺氏菌7型的O-抗原是特异的；尤其是表一中列出的寡核苷酸，它们对鲍氏志贺氏菌7型的O-抗原是高度特异的，而且这些寡核苷酸还可重新组合，组合后的寡核苷酸对鲍氏志贺氏菌7型的O-抗原也是高度特异的。
本发明的再一目的是提供的上述寡核苷酸可作为引物用于核酸扩增反应，或者作为探针用于杂交反应，或者用于制造基因芯片或微阵列，从而通过这些方法来检测和鉴定鲍氏志贺氏菌7型的O-抗原及检测和鉴定鲍氏志贺氏菌7型。
本发明的还一目的是提供了分离鲍氏志贺氏菌7型的O-抗原基因簇的全序列的方法。按照本方法操作可以获得其他细菌的O-抗原基因簇的全序列，也可以获得编码其他多糖抗原的细菌的基因簇的全序列。
本发明的目的是由以下技术方案实现的。
本发明对鲍氏志贺氏菌7型的O-抗原特异的核苷酸，其特征在于，其是如SEQ ID NO1所示的分离的核苷酸，全长15796个碱基；或者具有一个或多个插入、缺失或取代的碱基，同时保持所述分离的核苷酸功能的SEQ ID NO1的核苷酸。
前述的对鲍氏志贺氏菌7型的O-抗原特异的核苷酸，其特征在于它是由11个基因组成，它们都位于galF基因和gnd基因之间。
前述的对鲍氏志贺氏菌7型的O-抗原特异的核苷酸，其特征在于，所述的基因包括转运酶基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因；聚合酶基因，包括wzy基因或与wzy有相似功能的基因；糖基转移酶基因，包括orf8、orf10、orf11、orf12基因；其中所述的wzx基因是SEQ ID NO1中的6714至7928碱基的核苷酸；orf8基因是SEQ ID NO1中的7936至8877碱基的核苷酸；wzy基因是SEQ ID NO1中的8889至10184碱基的核苷酸；orf10基因是SEQ ID NO1中的10186至11148碱基的核苷酸；orf11基因是SEQ IDNO1中的11355至12272碱基的核苷酸；orf12基因是SEQ ID NO1中的12247至13176碱基的核苷酸；前述的对鲍氏志贺氏菌7型的O-抗原特异的核苷酸，其特征在于，其是源于所述的wzx基因、wzy基因或糖基转移酶基因的orf8、orf10、orf11、orf12基因；或糖合成路径基因中的寡核苷酸；以及它们的混合或它们的重组。
前述的对鲍氏志贺氏菌7型的O-抗原特异的核苷酸，其特征在于，所述的源于wzx的寡核苷酸对是SEQ ID NO1中的6782至6799碱基的核苷酸和7449至7466碱基的核苷酸，SEQ ID NO1中的6971至6989碱基的核苷酸和7481至7498碱基的核苷酸，SEQ ID NO1中的7035至7053碱基的核苷酸和7588至7607碱基的核苷酸；源于orf8的寡核苷酸对是SEQ ID NO1中的8065至8082碱基的核苷酸和8789至8806碱基的核苷酸，SEQ ID NO1中的8134至8152碱基的核苷酸和8685至8704碱基的核苷酸，SEQ ID NO1中的8198至8215碱基的核苷酸和8459至8476碱基的核苷酸；源于wzy的寡核苷酸对是SEQ ID NO1中的9091至9108碱基的核苷酸和9457至9474碱基的核苷酸，SEQ ID NO1中的9357至9376碱基的核苷酸和9704至9721碱基的核苷酸，SEQ ID NO1中的9120至9137碱基的核苷酸和9945至9962碱基的核苷酸；源于orf10的寡核苷酸对是SEQ ID NO1中的10271至10288碱基的核苷酸和11060至11077碱基的核苷酸，SEQ ID NO1中的10375至10393碱基的核苷酸和10790至10808碱基的核苷酸，SEQ ID NO1中的10510至10528碱基的核苷酸和11090至11108碱基的核苷酸；源于orf11的寡核苷酸对是SEQ ID NO1中的11737至11754碱基的核苷酸和12013至12030碱基的核苷酸，SEQ ID NO1中的11367至11384碱基的核苷酸和12154至12171碱基的核苷酸，SEQ ID NO1中的11482至11598碱基的核苷酸和11839至11856碱基的核苷酸；源于orf12的寡核苷酸对是
SEQ ID NO1中的12274至12291碱基的核苷酸和13016至13033碱基的核苷酸，SEQ ID NO1中的12489至12506碱基的核苷酸和13101至13120碱基的核苷酸，SEQ ID NO1中的12384至12401碱基的核苷酸和12959至12976碱基的核苷酸。
前述的对鲍氏志贺氏菌7型的O-抗原特异的核苷酸在检测表达O-抗原的细菌、在诊断中鉴定细菌的O-抗原和细菌的其它多糖抗原的应用。
前述的对鲍氏志贺氏菌7型的O-抗原特异的核苷酸的重组分子，而且通过插入表达可提供表达鲍氏志贺氏菌7型的O-抗原，并成为细菌疫苗。
前述的对鲍氏志贺氏菌7型的O-抗原特异的核苷酸的应用，其特征在于，其作为引物用于PCR、作为探针用于杂交反应与荧光检测、或者用于制造基因芯片或微阵列，检测人体和环境中的细菌。
前述的对鲍氏志贺氏菌7型的O-抗原特异的核苷酸的分离方法，其特征在于，其包括下述步骤(1)提取基因组。在LB培养基中37℃过夜培养志贺氏菌，离心收集细胞，用Tris-HCl(pH8.0)和EDTA重悬细胞，37℃温育20分后加入溶菌酶裂解细菌，加入蛋白酶K和SDS降解蛋白质，再加入RNase去除RNA；然后用等体积酚及等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)抽提去除其中的酶和蛋白，再用等体积的乙醚抽提除去残余的酚；用2倍体积乙醇沉淀DNA，用玻璃丝卷出DNA后用70％乙醇洗DNA，最后将DNA重悬于30ulTE中，基因组DNA通过0.4％的琼脂糖凝胶电泳检测；(2)通过Long PCR扩增鲍氏志贺氏菌7型中的O-抗原基因簇。首先根据经常发现于O-抗原基因簇启动子区的JumpStart序列设计上游引物(#1523-ATT GTG GCT GCA GGG ATC AAA GAA AT)，再根据O-抗原基因簇下游的gnd基因设计下游引物(#1524-TAG TCG CGT GNG CCT GGA TTA AGT TCG C)；用Boehringer Mannheim公司的Expand Long Template PCR方法扩增O-抗原基因簇，PCR反应程序如下在94℃预变性2分；然后94℃变性10秒；60℃退火30秒，68℃延伸15分，这样进行30个循环；最后，在68℃继续延伸7分，得到长度为15796个碱基的PCR产物；合并6管long PCR产物，并用Promega公司的Wizard PCR Preps纯化试剂盒纯化PCR产物；(3)构建O-抗原基因簇文库。用被修改的Novagen DNaseI shot gun法构建O-抗原基因簇文库，反应体系是300ng PCR纯化产物，0.9ul0.1M MnCl2，1ul1∶2000稀释的1mg/ml的DNaseI，反应在室温中进行；选择合适的反应时间使酶切后的DNA片段大小集中在1kb-3kb之间，而后加入2ul0.1M EDTA终止反应，合并4管同样的反应体系，分别用等体积的酚和酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)抽提一次，再用等体积的乙醚抽提两次后，用2.5倍体积的无水乙醇沉淀DNA，并用70％乙醇洗沉淀，最后重悬于18ul水中；随后在此混合物中加入2.5ul dNTP(1mMdCTP，1mMdGTP，1mMdTTP，10mMdATP)，1.25ul100mM DTT和5单位的T4DNA聚合酶，11℃30分，将酶切产物补成平端，75℃终止反应后，加入5单位的Tth DNA聚合酶及其相应的缓冲液并将体系扩大为80ul，使DNA的3’端加dA尾，此混合物经氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提和乙醚抽提后与Promega公司的3×10-3的pGEM-T-Easy载体于16℃连接24小时，总体积为90ul，其中有9ul的10×buffer和25单位的T4DNA连接酶，最后用无水乙醇沉淀连接混合物，70％乙醇洗后溶于30ul水中得到连接产物，用Bio-Rad公司的电转化感受态细胞的制备方法制备感受态大肠杆菌DH5α细胞，取2-3ul连接产物与50ul感受态大肠杆菌DH5α混合后，转到Bio-Rad公司的0.2cm的电击杯中电击，电压为2.5千伏，时间为5.0毫秒-6.0毫秒，电击后立即在杯中加入1ml的SOC培养基使菌复苏，然后将菌涂在含有氨苄青霉素、X-Gal和IPTG的LB固体培养基上37℃过夜培养，次日得到蓝白菌落。将得到的白色菌落即白色克隆转到含有氨苄青霉素的LB固体培养基上培养，同时从每个克隆中提取质粒并用EcoRI酶切鉴定其中的插入片段的大小，得到的白色克隆构成了鲍氏志贺氏菌7型的O-抗原基因簇文库；(4)对文库中的克隆测序。从文库中挑选插入片段在700bp以上的120个克隆由上海生物工程有限公司用ABI377型DNA自动测序仪对克隆中的插入片段单向进行测序，使序列达到80％的覆盖率。剩余20％的序列再根据已得到的序列设计引物，两对引物，如下所示5’-GCATGGGTTACTGTACTAGC-3’和3’-AATGGCATCAATACCCGC-5’及5’-TGGCGGTATTGAGAGAGT-3’和3’-TTACAGGCTACTTCTCTTC-5’，再从鲍氏志贺氏菌7型的基因组DNA中直接PCR并对PCR产物测序，从而获得O-抗原基因簇的所有序列。
(5)核苷酸序列的拼接及分析。用英国剑桥MRC(Medical Research Council)分子生物学实验室出版的Staden package软件包的Pregap4和Gap4软件拼接和编辑所有的序列，从而得到鲍氏志贺氏菌7型的O-抗原基因簇的核苷酸全长序列(见序列列表)。序列的质量主要由两个方面来保证1)对鲍氏志贺氏菌7型的基因组作6个Long PCR反应，然后混合这些产物以产生文库。2)对每个碱基，保证3个以上高质量的覆盖率。在得到鲍氏志贺氏菌7型O-抗原基因簇的核苷酸序列后，用美国国家生物技术信息学中心(The NationalCenter for Biotechnology Information，NCBI)的orffinder发现基因，找到13个开放的阅读框，用blast系列软件与GenBank中的基因比较以发现这些开放的阅读框的功能并确定它们是什么基因，再用英国sanger中心的Artemis软件完成基因注释，用Clustral W软件做DNA和蛋白质序列间的精确比对，最后得到鲍氏志贺氏菌7型的O-抗原基因簇的结构，(6)特异基因的筛选。针对鲍氏志贺氏菌7型的O-抗原基因簇中的wzx、wzy、orf8、orf10、orf11、orf12基因设计引物。在每个基因内各设计了三对引物，每对引物分布在相应基因内的不同地方，以确保其特异性；用这些引物以166株大肠杆菌和43株志贺氏菌的基因组为模板进行PCR，在各组中都没有扩增到任何大小正确的带，即在大多数组中没有得到任何PCR产物带，虽然在少数组中得到PDR产物带，但其大小不符合预期大小，所以wzx、wzy、orf8、orf10、orf11、orf12基因对鲍氏志贺氏菌7型的O-抗原都是高度特异的。
也就是，在本发明的第一个方面，提供了鲍氏志贺氏菌7型的O-抗原基因簇的全长核苷酸序列，它的全序列如SEQ ID NO1所示，全长15796个碱基；或者具有一个或多个插入、缺失或取代的碱基，同时保持所述分离的核苷酸功能的SEQ ID NO1的核苷酸。通过本发明的方法得到了鲍氏志贺氏菌7型的O-抗原基因簇的结构，如表3所示，它总共由11个基因组成，都位于galF基因和gnd基因之间。
在本发明的第二个方面，提供了鲍氏志贺氏菌7型的O-抗原基因簇中的基因，即转运酶基因(wzx基因或与wzx有相似功能的基因)；聚合酶基因(wzy基因或与wzy有相似功能的基因)；糖基转移酶基因，包括orf8、orf10、orf11、orf12基因；细菌多糖抗原中特殊的糖合成路径基因，包括flmA，flmB，neuA，flmD，flmH，nue，glf基因，它们在O-抗原基因簇中的起始位置和终止位置及核苷酸序列都列在表4中。本发明尤其涉及到糖基转移酶基因、转运酶基因和聚合酶基因，因为糖合成路径基因即合成核苷二磷酸单糖的基因现在被预示对较多胞外多糖是常见的、共同的，对细菌的O-抗原并不是很特异的，而本发明涉及到的糖基转移酶基因、转运酶基因和聚合酶基因对鲍氏志贺氏菌7型的O-抗原是高度特异的。
在本发明的第三个方面，提供了源于鲍氏志贺氏菌7型的O-抗原基因簇中的wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因和糖基转移酶基因，包括orf8、orf10、orf11、orf12基因的寡核苷酸，它们是这些基因中的任何一段寡核苷酸。但是，优先被用的是列于表一中的寡核苷酸对，在表一中也列出了这些寡核苷酸对在O-抗原基因簇中的位置及以这些寡核苷酸对为引物所做的PCR反应的产物的大小，这些PCR反应可用表中的退火温度进行。这些引物只在以鲍氏志贺氏菌7型为模板进行的PCR扩增中得到预期大小的产物，而在以表二所列的166株大肠杆菌和43株志贺氏菌为模板进行的PCR扩增中都未得到预期大小的产物。更详细地说，以这些寡核苷酸对为引物所做的PCR反应在大多数细菌中均未得到任何产物，虽然在有些菌中得到了PCR产物带，但其大小不符合预期大小，这是由于引物结合到基因组的别的位置造成，这种问题可通过用基因内的其它引物做PCR来避免。所以，可以确定这些引物即表一所列的寡核苷酸对鲍氏志贺氏菌7型及它们的O-抗原是高度特异的。
本发明的其他方面由于本文的技术的公开，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
如本发明所用，“寡核苷酸”是指来源于O-抗原基因簇中的编码糖基转移酶的基因、编码转运酶的基因和编码聚合酶的基因内的一段核苷酸分子，它们在长度上可改变，一般在10到20个核苷酸范围内改变。更确切的说这些寡核苷酸是源于wzx基因(核苷酸位置是从SEQ ID NO1的6714至7928碱基)，orf8基因(核苷酸位置是从SEQ ID NO1的7936至8877碱基)，wzy基因(核苷酸位置是从SEQ ID NO1的8889至10184碱基)，orf10基因(核苷酸位置是从SEQ ID NO1的10186至11148碱基)，orf11基因(核苷酸位置是从SEQID NO1的11355至12272碱基)，orf12基因(核苷酸位置是从SEQ ID NO1的12247至13176碱基)。源于以上基因内的寡核苷酸对鲍氏志贺氏菌7型(SEQID NO1)都是高度特异的。
此外，有时两个遗传相似的编码不同O-抗原的基因簇通过基因重组或突变产生新的O-抗原，从而产生新的细菌类型，新的突变株。在这种环境中，需要筛选出多对寡核苷酸同重组基因杂交以提高检测的特异性。因此，本发明提供了一整套多对寡核苷酸的混合物，它们源于糖基转移酶基因；源于转运酶和聚合酶基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因；也源于糖合成路径基因。这些基因的混合物对一个特殊的细菌多糖抗原来说是特异的，从而使这套寡核苷酸对这个细菌的多糖抗原是特异的。更具体地说，这些寡核苷酸的混合物是源于糖基转移酶基因、wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy或与wzy有相似功能的基因中的寡核苷酸与源于糖合成路径基因中的寡核苷酸的组合。
在另一方面，本发明涉及寡核苷酸的鉴定，它们可以用于检测表达O-抗原的细菌和在诊断中鉴定细菌的O-抗原。
本发明涉及到一种检测食品中的一个或多个细菌多糖抗原的方法，这些抗原可以使样品能与以下至少一个基因的寡核苷酸特异性杂交，这些基因是(i)编码糖基转移酶的基因(ii)编码转运酶和聚合酶的基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因。在条件许可的情况下至少一个寡核苷酸能与至少一个表达特殊的O-抗原的细菌的一个以上的那样的基因特异性杂交，这些细菌是鲍氏志贺氏菌7型或。可用PCR方法检测，更可以将本发明方法中的核苷酸标记后作为探针通过杂交反应如southern-blot或荧光检测，或者通过基因芯片或微阵列检测样品中的抗原及细菌。
本发明者考虑到以下情况当单个的特异的寡核苷酸检测无效时，寡核苷酸的混合物能与靶区域特异性杂交以检测样品。因此本发明提供了一套寡核苷酸用于本发明所述的检测方法。这里所说的寡核苷酸是指源于编码糖基转移酶的基因、编码转运酶的基因和聚合酶的基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因的寡核苷酸。这套寡核苷酸对一个特殊的细菌的O-抗原来说是特异的，这一特殊的细菌O-抗原是由鲍氏志贺氏菌7型或表达的。
另一方面，本发明涉及到一种检测排泄物中的一个或多个细菌多糖抗原的方法，这些抗原可以使样品能与以下至少一个基因的寡核苷酸特异性杂交，这些基因是(i)编码糖基转移酶的基因(ii)编码转运酶和聚合酶的基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因。在条件许可的情况下至少一个寡核苷酸能与至少一个表达特殊的O-抗原的细菌的一个以上的那样的基因特异性杂交。这些细菌是鲍氏志贺氏菌7型或。可用本发明中的寡核苷酸作引物通过PCR的方法检测样品，也可将本发明中的寡核苷酸分子标记后作为探针通过杂交反应如southern-blot或荧光检测，或者通过基因芯片或微阵列检测样品中的抗原及细菌。
一般一对寡核苷酸可能与同样的基因杂交也可与不同的基因杂交，但它们中必须有一个寡核苷酸能特异性杂交到特殊抗原型的特异序列上，另一个寡核苷酸可杂交于非特异性区域。因此，当特殊的多糖抗原基因簇中的寡核苷酸被重新组合时，至少能选出一对寡核苷酸与多糖抗原基因簇中特异基因混合物杂交，或者选出多对寡核苷酸与特异基因的混合物杂交。甚至即使当一个特殊的基因簇中所有基因都独一无二时，此方法也能应用于识别此基因簇内的基因混合物的核苷酸分子。因此本发明提供了一整套用于检测本发明方法的多对寡核苷酸，在这里多对寡核苷酸是源于编码糖基转移酶的基因、编码转运酶和聚合酶的基因包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因，这套寡核苷酸对一个特殊的细菌多糖来说是特异的，这套寡核苷酸可能是糖合成中必须基因的核苷酸。
另一方面，本发明也涉及到一种检测源于病人的样品中的一个或多个细菌多糖抗原的方法。样品中的一个或多个细菌多糖抗原可以使样品能与以下至少一个基因中的一对寡核苷酸中的一个特异性杂交，这些基因是(i)编码糖基转移酶的基因(ii)编码转运酶和聚合酶的基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因。在条件许可的情况下至少一个寡核苷酸能与样品中的至少一个表达特殊的O-抗原的细菌的一个以上的那样的基因特异性杂交，这些细菌是鲍氏志贺氏菌7型或。可用本发明中的寡核苷酸作引物通过PCR的方法检测样品，也可将本发明中的寡核苷酸标记后作为探针通过杂交反应，或者通过基因芯片或微阵列检测样品中的抗原及细菌。
更详细地说，以上描述的方法可以理解为当寡核苷酸对被使用时，其中的一个寡核苷酸分子能杂交到一个并不是来源于糖基转移酶基因、wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因的序列上。此外，当两个寡核苷酸都能杂交上时，它们可能杂交于同一基因也可能杂交到不同基因上。也即，当交叉反应出现问题时，可选择寡核苷酸的混合物来检测混合的基因以提供检测的特异性。
本发明者相信本发明不必限于以上所提的核苷酸序列编码的特定的O-抗原，而且广泛应用于检测所有表达O-抗原和鉴定O-抗原的细菌。而且，由于O-抗原合成和其他多糖抗原(如细菌胞外抗原)合成之间的相似性，发明者相信本发明的方法和分子也应用于这些其他的多糖抗原。
本发明首次公开了鲍氏志贺氏菌7型的O-抗原基因簇的全长序列，而且可从这个未被克隆的全长基因簇的序列中产生重组分子，通过插入表达可产生表达鲍氏志贺氏菌7型的O-抗原，并成为有用的疫苗。
具体实施例方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(NewYorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件。实施例1基因组的提取。
在5mL的LB培养基中37℃过夜培养志贺氏菌，离心收集细胞。用500ul50mM Tris-HCl(pH8.0)和10ul 0.4M EDTA重悬细胞，37℃温育20分，然后加入10ul 10mg/ml的溶菌酶继续保温20分。之后加入3ul 20mg/ml的蛋白酶K、15ul 10％SDS，50℃温育2小时，再加入3ul 10mg/ml的RNase，65℃30分。加等体积酚抽提混合物，取上清液液再用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)抽提两次，取上清液液再用等体积的乙醚抽提以除去残余的酚。上清液液用2倍体积乙醇沉淀DNA，用玻璃丝卷出DNA并用70％乙醇洗DNA，最后将DNA重悬于30ul TE中。基因组DNA通过0.4％的琼脂糖凝胶电泳检测。实施例2通过PCR扩增鲍氏志贺氏菌7型中的O-抗原基因簇。
鲍氏志贺氏菌7型的O-抗原基因簇通过Long PCR扩增。首先根据经常发现于O-抗原基因簇启动子区的JumpStart序列设计上游引物(#1523-ATTGTG GCT GCA GGG ATC AAA GAA AT)，再根据O-抗原基因簇下游的gnd基因设计下游引物(#1524-TAG TCG CGT GNG CCT GGA TTA AGT TCG C)。用BoehringerMannheim公司的Expand Long Template PCR方法扩增O-抗原基因簇，PCR反应程序如下在94℃预变性2分；然后94℃变性10秒，60℃退火30秒，68℃延伸15分，这样进行30个循环。最后，在68℃继续延伸7分，得到PCR产物，用0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的大小及其特异性。合并6管long PCR产物，并用Promega公司的Wizard PCR Preps纯化试剂盒纯化PCR产物。实施例3构建O-抗原基因簇文库。
首先是连接产物的获得用被修改的Novagen DNaseI shot gun法构建O-抗原基因簇文库。反应体系是300ng PCR纯化产物，0.9ul 0.1M MnCl2，1ul 1∶2000稀释的1mg/ml的DNaseI，反应在室温中进行。酶切10分钟使DNA片段大小集中在1kb-3kb之间，而后加入2ul 0.1M EDTA终止反应。合并4管同样的反应体系，分别用等体积的酚和酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)抽提一次，再用等体积的乙醚抽提两次后，用2.5倍体积的无水乙醇沉淀DNA，并用70％乙醇洗沉淀，最后重悬于18ul水中。随后在此混合物中加入2.5uldNTP(1mMdCTP，1mMdGTP，1mMdTTP，10mMdATP)，1.25ul 100mM DTT和5单位的T4DNA聚合酶，11℃30分，将酶切产物补成平端，75℃终止反应后，加入5单位的Tth DNA聚合酶及其相应的缓冲液并将体系扩大为80ul，70℃反应20分，使DNA的3’端加dA尾。此混合物经等体积氯仿∶异戊醇抽提和等体积乙醚抽提后与Promega公司的3×10-3的pGEM-T-Easy载体于16℃连接24小时，总体积为90ul。其中有9ul的10×buffer和25单位的T4DNA连接酶。最后用1/10体积的3M NaAc(pH5.2)和2倍体积的无水乙醇沉淀连接混合物，再用70％乙醇洗沉淀，干燥后溶于30ul水中得到连接产物。
其次是感受态细胞的制备参照Bio-Rad公司提供的方法制备感受态细胞大肠杆菌DH5α。取一环大肠杆菌DH5α单菌落于5ml的LB培养基中，180rpm培养10小时后，取2ml培养物转接到200ml的LB培养基中，37℃250rpm剧烈振荡培养到OD600 0.5左右，然后冰浴冷却20分，于4℃4000rpm离心15分。倾尽上清液液，用冷的冰预冷的去离子灭菌水200ml吹散菌体，于4℃4000rpm离心15分。再用冷的冰预冷的去离子灭菌水100ml吹散菌体，于4℃4000rpm离心15分。用冷的冰预冷的10％的甘油悬浮细胞，4℃ 6000rpm离心10分，弃上清液液，最后沉淀用1ml冰预冷的10％的甘油悬浮细胞，即为感受态细胞。将制得的感受态细胞分装为50ul一管，-70℃保存。
最后是电转化感受态细胞取2-3ul连接产物与50ul感受态大肠杆菌DH5α混合后，转到Bio-Rad公司的0.2cm的电击杯中电击，电压为2.5千伏，时间为5.0毫秒-6.0ms毫秒。电击后立即在杯中加入1ml的SOC培养基使菌复苏。然后立即将菌涂在含有氨苄青霉素、X-Gal和IPTG的LB固体培养基上37℃倒置过夜培养，次日得到蓝白菌落。将得到的白色菌落即白色克隆转到含有氨苄青霉素的LB固体培养基上培养，同时从每个克隆中提取质粒并用EcoRI酶切鉴定其中的插入片段的大小，得到白色克隆群构成了鲍氏志贺氏菌7型的O-抗原基因簇文库。实施例4对文库中的克隆测序从文库中挑选插入片段在700bp以上的120个克隆由上海生物工程有限公司用ABI377型DNA自动测序仪对克隆中的插入片段单向进行测序，使序列达到80％的覆盖率。剩余20％的序列再根据已得到的序列设计引物，再从鲍氏志贺氏菌7型的基因组DNA中直接PCR并对PCR产物测序，从而获得O-抗原基因簇的所有序列。在鲍氏志贺氏菌7型中我们设计了两对引物，如下所示5’-GCATGGGTTACTGTACTAGC-3’和3’-AATGGCATCAATACCCGC-5’5’-TGGCGGTATTGAGAGAGT-3’和3’-TTACAGGCTACTTCTCTTC-5’实施例5核苷酸序列的拼接及分析用英国剑桥MRC(Medical Research Council)分子生物学实验室出版的Staden package软件包的Pregap4和Gap4软件拼接和编辑所有的序列，从而得到鲍氏志贺氏菌7型的O-抗原基因簇的核苷酸全长序列(见序列列表)。序列的质量主要由两个方面来保证1)对鲍氏志贺氏菌7型的基因组作6个Long PCR反应，然后混合这些产物以产生文库。2)对每个碱基，保证3个以上高质量的覆盖率。在得到鲍氏志贺氏菌7型O-抗原基因簇的核苷酸序列后，用美国国家生物技术信息学中心(The National Center for BiotechnologyInformation，NCBI)的orffinder发现基因，找到13个开放的阅读框，用blast系列软件与GenBank中的基因比较以发现这些开放的阅读框的功能并确定它们是什么基因，再用英国sanger中心的Artemis软件完成基因注释，用Clustral W软件做DNA和蛋白质序列间的精确比对，最后得到鲍氏志贺氏菌7型的O-抗原基因簇的结构，如表3所示。
通过检索和比较，发现orf1与Aeromonas punctata的合成酶flmA基因在197个氨基酸的序列中都有53％的相同性，表明它们之间有高度的同源性。所以可以确定orf1是flmA基因。orf2与Aeromonas punctata的合成酶flmB基因在378个氨基酸的序列中都有61％的相同性，表明它们之间有高度的同源性。所以可以确定orf2是flmB基因。orf3与Aeromonas punctata的nueA基因在227个氨基酸的序列中有56％的相同性，表明它们之间有高度的同源性。所以，可以确定orf3是neuA基因。orf4与Aeromonas punctata的flmD基因在361氨基酸的序列中有33％的相同性，53％的相似性，表明它们之间也有高度的同源性。所以，可以确定orf4是flmD基因。orf5与Aeromonaspunctata的flmH基因在227个氨基酸的序列中有35％的相同性，59％的相似性，表明它们之间有高度的同源性。所以，可以确定orf5是flmH基因。Orf6与Aeromonas punctata的neuB基因在361氨基酸的序列中有73％的相同性，84％的相似性，表明它们之间也有高度的同源性。所以，可以确定orf6是neuB基因。Orf7与大肠杆菌的wzx基因在307个氨基酸序列中有23％的相同性，并且通过Eisenberg等人的算法[Eisenberg，D，Schwarz，E.etal(1984).Analysis ofmembrane and surface protein sequences with the hydrophobic momentplot.J.Mol.Biol.179125-142]发现orf7有12个潜在的穿膜区，它与许多wzx蛋白相似，而且在wzx蛋白的氨基端有一个大约50个氨基酸的保守基序，所以可以确定orf7是wzx基因，命名为wzx。Orf8与Salmonella enterica的glycosyltansferase基因在286个氨基酸中有29％的相同性，是一个糖基转移酶基因，命名为orf8。 Orf9与大肠杆菌的wzy基因在306个氨基酸序列中有20％的相同性，另外通过Eisenberg算法得知orf9有10个潜在的穿膜区，与其他的O-抗原聚合酶有相似的二级结构，所以确定orf9就是wzy基因，命名为wzy。Orf11与S.boydii的糖基转移酶基因在239个氨基酸序列中有32％的相同性，51％的相似性，所以确定orf11是一个乙酰基转移酶基因，命名为orf11。Orf12与Methanothermobacter thermautotrophicas的糖基转移酶基因在286个氨基酸序列中有36％的相同性，51％的相似性，所以确定orf12是一个糖基转移酶基因，命名为orf12。 Orf12与Pseudomonas aeruginosa的合成酶wbpS基因在628个氨基酸序列中有56％的相同性，72％的相似性，所以确定orf12是一个合成酶酶基因，命名为orf12，Orf13与Pseudomonastyphimurium LT2的glf基因在381个氨基酸序列中有58％的相同性，73％的相似性，所以可以确定orf13是glf基因，命名为glf。根据鲍氏志贺氏菌7型的O-抗原结构可知还需要有1个糖基转移酶基因，orf10与已知序列无明显同源性，但具有糖基转移酶的特征，是1个糖基转移酶，命名为orf10。实施例6特异基因的筛选。针对鲍氏志贺氏菌7型的O-抗原基因簇中的wzx、wzy、orf8、orf10、orf11、orf12基因设计引物，这些基因在核苷酸序列中的位置见表1所示。
表1列出了鲍氏志贺氏菌7型的O抗原基因簇中糖基转移酶基因和寡糖单位处理基因及基因内的引物及PCR数据。在表中列出了鲍氏志贺氏菌7型的O抗原基因簇的糖基转移酶基因、转运酶基因和聚合酶基因及它们的相应的功能和大小。在每个基因内，我们各设计了三对引物，每对引物分布在相应基因内的不同地方以确保其特异性。在表中还列出了每个引物在SEQ IDNO1中的位置和大小。以每对引物用表中所列的相应的退火温度以表二中的所有菌的基因组为模板进行PCR，得到了相应的PCR产物，其大小也列于表中。
mdh(malate dehydrogenase)基因是存在于所有的大肠杆菌的基因组中且高度保守的一个基因，所以我们根据mdh基因设计了引物#101(-TTC ATC CTAAAC TCC TTA TT)和#102(-TAA TCG CAG GGG AAA GCA GG)，然后从166株大肠杆菌中提取基因组，方法如前所述。用这对引物从166株大肠杆菌的基因组中PCR以鉴定大肠杆菌并检测其基因组的质量。
表2是用于筛选特异基因的166株大肠杆菌和43株志贺氏菌及它们的来源，为了检测的方便，我们将它们每8-10个菌分为一组，总共27组，它们的来源都列于表中。
在第23组中含有鲍氏志贺氏菌7型的基因组DNA作为阳性对照。以每组菌做模板，用表一中的每对引物按如下条件做PCR在94℃预变性2分后，94℃变性15秒，退火温度因引物的不同而不同(参照表一)，退火时间是50秒，72℃延伸2分，这样进行30个循环。最后在72℃继续延伸10分，反应体系是25ul。反应完毕后，取10ulPCR产物通过0.8％琼脂糖凝胶电泳检测扩增出的片段。
对于wzx、wzy、orf8、orf10、orf11、orf12基因，每个基因都有1至3对引物被检测，每对引物除了在第23组中做PCR后得到了预期大小的正确的一条带外，在第18组中也都得到同样大小的特异性带。以第18组中的每个菌的基因组DNA做模板PCR后，发现只在中得到了阳性结果。更详细地说，以上每个基因的每一对引物都在中得到预期大小的正确的PCR产物带。据报道，鲍氏志贺氏菌7型的O-抗原结构是一样的，我们的结果从另一个侧面证实了这一点。此外，所有的引物在其他组中都没有扩增到任何大小正确的带，也就是说，在大多数组中没有得到任何PCR产物带，虽然在少数组中得到PCR产物带，但其大小不符合预期大小，所以wzx、wzy、orf8、orf10、orf11、orf12基因对鲍氏志贺氏菌7型及其O-抗原都是高度特异的。
最后，通过PCR从鲍氏志贺氏菌7型中筛选到对鲍氏志贺氏菌7型的O-抗原高度特异的基因wzx、wzy和四个糖基转移酶基因。而这些基因内的任何一段10-20nt的寡核苷酸对鲍氏志贺氏菌7型的O-抗原是特异的，尤其是上述每个基因中的引物即寡核苷酸对经PCR检测后证实对鲍氏志贺氏菌7型是高度特异的。所有的这些寡核苷酸都可用于快速准确地检测人体和环境中的鲍氏志贺氏菌7型，并能鉴定它们的O-抗原。
表3是鲍氏志贺氏菌7型的O-抗原基因簇的结构表，在表中列出了鲍氏志贺氏菌7型的O-抗原基因簇的结构，共由13个基因组成，每个基因用方框表示，并在方框内写入基因的名称，数字表示的是O-抗原基因簇中的开放阅读框(orf)的顺序。在O-抗原基因簇的两端是galF基因和gnd基因，这两个基因不负责O-抗原的合成，我们只是用它们的一段序列设计引物来扩增O-抗原基因簇的全长序列。
表4是鲍氏志贺氏菌7型的O-抗原基因簇中的基因的位置表，在表中列出了鲍氏志贺氏菌7型的O-抗原基因簇中的所有开放阅读框在全序列中的准确位置，在每个开放阅读框的起始密码子和终止密码子的下面划线。
序列列表SEQUENCE LISTING<110>南开大学<120>对鲍氏志贺氏菌7型的O-抗原特异的核苷酸<130>对鲍氏志贺氏菌7型的O-抗原特异的核苷酸<160>1<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>15796<212>DNA<213>Shigella boydii<400>1ctcctggtga ctcatgcgtc caagaacgcg gtcgaaaacc acttcgacac ctcatatgaa 60ttagaatcgc tccttgaaca gcgtgtaaaa cgccagttgc tggcggaagt tcagtccatc120tgcccaccgg gcgtcaccat tatgaatgtg cgtcagagcg aacctttagg tttgggccac180tccattttgt gcgccagacc cgccattggc gacaatccat tcgttgtggt gctgcctgat240gtcgttattg atgatgccag cgccgatccg ctgcgttaca accttgccgc tatgattgcg300cgattcaacg aaacgggtcg cagtcaggtt ctggcaaaac gtatgccggg tgacctctct360gaatactctg tcatccagac taaagaaccg ctggatcgtg aaggcaaagt cagtcgcatt420gttgaattta tcgaaaaacc cgatcagccg cagacactgg attcagacat tatggcggtt480ggtcgctatg tgctttctgc agacatttgg cctgaactgg agcggactca acccggtgca540tggggacgta ttcagctaac tgacgcaatt gccgaactgg cgaaaaaaca gtccgttgat600gcaatgttaa tgacgggtga cagctacgac tgcggtaaaa aaatgggcta catgcaggca660tttgtgaagt acggactacg caacctgaaa gaaggagtga agttccgcaa agggattgag720cagctgttaa gcgaataaaa 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ttaccgagtg gaataacggt gaactgagca gttacctgat 15180
cgacataacc aaagacatct tcaccaaaaa agatgaagac ggtaactacc tggttgatgt15240gattctggat gaagcggcta acaaaggtac cggtaaatgg accagccaga gtgcgctgga15300tctcggcgaa ccgctgtcgc tgattaccga gtctgtgttt gcacgttata tctcgtctct15360gaaagatcag cgtgttgccg cgtctaaagt tctctctggt ccgcaggcac agccagcagg15420cgacaaagcg gagttcatcg agaaagttcg ccgtgcgctg tatcttggca aaatcgtttc15480ttatgctcag ggcttctctc aattgcgtgc cgcgtctgaa gagtatcact gggatctgaa15540ctacggtgaa atcgcgaaga ttttccgtgc tggctgcatc atccgtgcgc agttcctgca15600gaaaatcacc gatgcctatg ccgaaaacct aaaaatcgct aacctgctgt tggctccgta15660ttttaagaaa atcgctgacg actaccaaca agcactgcgt gatgtcgtcg cttatgcagt15720gcaaaacggt attccggttc caaccttctc tgcggcggtt gcttattacg acagctatcg15780tgccgctgtcctgcct 15796表一鲍氏志贺氏菌7型O抗原基因簇中的糖基转移酶基因和寡糖单位处理基因及其中的引物及PCR数据
*在所有组中得到2条错误大小的带，**在6组中都得到1条错误大小的带，***在所有组中得到1条错误大小的带表二 166株大肠杆菌和43株志贺氏菌及它们的来源组号 该组中含有的菌株 来源1 野生型大肠杆菌O1，O2，O3，O10，O16，O18，O39 IMVSa2 野生型大肠杆菌O40，O41，O48，O49，O71，O73，O88，O100IMVS3 野生型大肠杆菌O102，O109，O119，O120，O121，O125，O126，O137 IMVS4 野生型大肠杆菌O138，O139，O149，O7，O5，O6，O11，O12IMVS5 野生型大肠杆菌O13，O14，O15，O17，O19ab，O20，O21，O22 IMVS6 野生型大肠杆菌O23，O24，O25，O26，O27，O28，O29，O30IMVS7 野生型大肠杆菌O32，O33，O34，O35，O36，O37，O38，O42IMVS8 野生型大肠杆菌O43，O44，O45，O46，O50，O51，O52，O53IMVS9 野生型大肠杆菌O54，O55，O56，O57，O58，O59，O60，O61IMVS10 野生型大肠杆菌O62，O63，O64，O65，O66，O68，O69，O70IMVS11 野生型大肠杆菌O74，O75，O76，O77，O78，O79，O80，O81IMVS12 野生型大肠杆菌O82，O83，O84，O85，O86，O87，O89，O90IMVS13 野生型大肠杆菌O91，O92，O95，O96，O97，O98，O99，O101 IMVS14 野生型大肠杆菌O112，O162，O113，O114，O115，O116，O117，O118IMVS15 野生型大肠杆菌O123，O165，O166，O167，O168，O169，O170，O171See b16 野生型大肠杆菌O172，O173，O127，O128，O129，O130，O131，O132， See c17 野生型大肠杆菌O133，O134，O135，O136，O140，O141，O142，O143IMVS18 野生型大肠杆菌O144，O145，O146，O147，O148，O150，O151，O152IMVS19 野生型大肠杆菌O153，O154，O155，O156，O157，O158，O159，O164IMVS20 野生型大肠杆菌O160，O161，O163，O8，O9，O124，O111 IMVS21 野生型大肠杆菌O103，O104，O105，O106，O107，O108，O110 IMVS22 鲍氏志贺氏菌血清型B4，B5，B6，B8，B9，B11，B12，B14 Seed23 鲍氏志贺氏菌血清型B1，B3，B7，B8，B10，B13，B15，B16，B17，B18 Seed24 痢疾志贺氏菌血清型D1，D2，D3，D4，D5，D6，D7，D8Seed25 痢疾志贺氏菌血清D9，D10，D11，D12，D13 Seed26 弗氏志贺氏菌F6a，F1a，F1b，F2a，F2b，F3，F4a，F4b，F5(v7)F5(v4) Seed27 宋内氏志贺氏D5，DR Seeda. Institude of Medical and Veterinary Science，Anelaide，Australiab. O123 from IMVS；the rest from Statens Serum Institut，Copenhagen，Denmarkc. 172 and 173 from Statens Serum Institut，Copenhagen，Denmark，the rest from IMVSd. 中国预防医学科学院流行病学研究所表3是鲍氏志贺氏菌7型的O-抗原基因簇的结构表 1kb表4是鲍氏志贺氏菌7型的O-抗原基因簇中的基因的位置表ctcctggtga ctcatgcgtc caagaacgcg gtcgaaaacc acttcgacac ctcatatgaa 60ttagaatcgc tccttgaaca gcgtgtaaaa cgccagttgc tggcggaagt tcagtccatc 120tgcccaccgg gcgtcaccat tatgaatgtg cgtcagagcg aacctttagg tttgggccac 180tccattttgt gcgccagacc cgccattggc gacaatccat tcgttgtggt gctgcctgat 240gtcgttattg atgatgccag cgccgatccg ctgcgttaca accttgccgc tatgattgcg 300cgattcaacg aaacgggtcg cagtcaggtt ctggcaaaac gtatgccggg tgacctctct 360gaatactctg tcatccagac taaagaaccg ctggatcgtg aaggcaaagt cagtcgcatt 420gttgaattta tcgaaaaacc cgatcagccg cagacactgg attcagacat tatggcggtt 480ggtcgctatg tgctttctgc agacatttgg cctgaactgg agcggactca acccggtgca 540tggggacgta ttcagctaac tgacgcaatt gccgaactgg cgaaaaaaca gtccgttgat 600gcaatgttaa tgacgggtga cagctacgac tgcggtaaaa aaatgggcta catgcaggca 660tttgtgaagt 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权利要求
1.一种对鲍氏志贺氏菌7型的O-抗原特异的核苷酸，其特征在于，其是如SEQ ID NO1所示的分离的核苷酸，全长15796个碱基；或者具有一个或多个插入、缺失或取代的碱基，同时保持所述分离的核苷酸功能的SEQ ID NO1的核苷酸。
2.按照权利要求1所述的对鲍氏志贺氏菌7型的O-抗原特异的核苷酸，其特征在于它是由11个基因组成，它们都位于galF基因和gnd基因之间。
3.按照权利要求2所述的对鲍氏志贺氏菌7型的O-抗原特异的核苷酸，其特征在于，所述的基因包括转运酶基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因；聚合酶基因，包括wzy基因或与wzy有相似功能的基因；糖基转移酶基因，包括orf8、orf10、orf11、orf12基因；其中所述的wzx基因是SEQ ID NO1中的6714至7928碱基的核苷酸；orf8基因是SEQ ID NO1中的7936至8877碱基的核苷酸；wzy基因是SEQ ID NO1中的8889至10184碱基的核苷酸；orf10基因是SEQ ID NO1中的10186至11148碱基的核苷酸；orf11基因是SEQ ID NO1中的11355至12272碱基的核苷酸；orf12基因是SEQ ID NO1中的12247至13176碱基的核苷酸；
4.按照权利要求1或2所述的对鲍氏志贺氏菌7型的O-抗原特异的核苷酸，其特征在于，其是源于所述的wzx基因、wzy基因或糖基转移酶基因的orf8、orf10、orf11、orf12基因；或糖合成路径基因中的寡核苷酸；以及它们的混合或它们的重组。
5.按照权利要求4所述的对鲍氏志贺氏菌7型的O-抗原特异的核苷酸，其特征在于，所述的源于wzx基因的寡核苷酸对是SEQ ID NO1中的6782至6799碱基的核苷酸和7449至7466碱基的核苷酸；SEQ ID NO1中的6971至6989碱基的核苷酸和7481至7498碱基的核苷酸；SEQ ID NO1中的7035至7053碱基的核苷酸和7588至7607碱基的核苷酸；源于orf8基因的寡核苷酸对是SEQ ID NO1中的8065至8082碱基的核苷酸和8789至8806碱基的核苷酸；SEQ ID NO1中的8134至8152碱基的核苷酸和8685至8704碱基的核苷酸；SEQ ID NO1中的8198至8215碱基的核苷酸和8459至8476碱基的核苷酸；源于wzy基因的寡核苷酸对是SEQ ID NO1中的9091至9108碱基的核苷酸和9457至9474碱基的核苷酸；SEQ ID NO1中的9357至9376碱基的核苷酸和9704至9721碱基的核苷酸；SEQ ID NO1中的9120至9137碱基的核苷酸和9945至9962碱基的核苷酸；源于orf10基因的寡核苷酸对是SEQ ID NO1中的10271至10288碱基的核苷酸和11060至11077碱基的核苷酸；SEQ ID NO1中的10375至10393碱基的核苷酸和10790至10808碱基的核苷酸；SEQ ID NO1中的10510至10528碱基的核苷酸和11090至11108碱基的核苷酸；源于orf11基因的寡核苷酸对是SEQ ID NO1中的11737至11754碱基的核苷酸和12013至12030碱基的核苷酸；SEQ ID NO1中的11367至11384碱基的核苷酸和12154至12171碱基的核苷酸；SEQ ID NO1中的11482至11598碱基的核苷酸和11839至11856碱基的核苷酸；源于orf12基因的寡核苷酸对是SEQ ID NO1中的12274至12291碱基的核苷酸和13016至13033碱基的核苷酸；SEQ ID NO1中的12489至12506碱基的核苷酸和13101至13120碱基的核苷酸；SEQ ID NO1中的12384至12401碱基的核苷酸和12959至12976碱基的核苷酸。
6.权利要求1所述的对鲍氏志贺氏菌7型的O-抗原特异的核苷酸在检测表达O-抗原的细菌、在诊断中鉴定细菌O-抗原和细菌的其它多糖抗原的应用。
7.权利要求1所述的对鲍氏志贺氏菌7型的O-抗原特异的核苷酸的重组分子，而且通过插入表达可提供表达鲍氏志贺氏菌7型的O-抗原，并成为细菌疫苗。
8.按照权利要求1所述的对鲍氏志贺氏菌7型的O-抗原特异的核苷酸的应用，其特征在于，其作为引物用于PCR、作为探针用于杂交反应与荧光检测、或者用于制造基因芯片或微阵列，检测人体和环境中的细菌。
9.按照权利要求1所述的对鲍氏志贺氏菌7型的O-抗原特异的核苷酸的分离方法，其特征在于，其包括下述步骤(1)提取基因组。在LB培养基中37℃过夜培养志贺氏菌，离心收集细胞，用Tris-HCl(pH8.0)和EDTA重悬细胞，37℃温育20分后加入溶菌酶裂解细菌，加入蛋白酶K和SDS降解蛋白质，再加入RNase去除RNA；然后用等体积酚及等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)抽提去除其中的酶和蛋白，再用等体积的乙醚抽提除去残余的酚；用2倍体积乙醇沉淀DNA，用玻璃丝卷出DNA后用70％乙醇洗DNA，最后将DNA重悬于30ulTE中，基因组DNA通过0.4％的琼脂糖凝胶电泳检测；(2)通过Long PCR扩增鲍氏志贺氏菌7型中的O-抗原基因簇。首先根据经常发现于O-抗原基因簇启动子区的JumpStart序列设计上游引物(#1523-ATT GTG GCT GCA GGG ATC AAA GAA AT)，再根据O-抗原基因簇下游的gnd基因设计下游引物(#1524-TAG TCG CGT GNG CCT GGA TTA AGT TCG C)；用Boehringer Mannheim公司的Expand Long Template PCR方法扩增O-抗原基因簇，PCR反应程序如下在94℃预变性2分；然后94℃变性10秒；60℃退火30秒，68℃延伸15分，这样进行30个循环；最后，在68℃继续延伸7分，得到长度为15796个碱基的PCR产物；合并6管long PCR产物，并用Promega公司的Wizard PCR Preps纯化试剂盒纯化PCR产物；(3)构建O-抗原基因簇文库。用被修改的Novagen DNaseI shot gun法构建O-抗原基因簇文库，反应体系是300ng PCR纯化产物，0.9ul 0.1M MnCl2，1ul 1∶2000稀释的1mg/ml的DNaseI，反应在室温中进行；选择合适的反应时间使酶切后的DNA片段大小集中在1kb-3kb之间，而后加入2ul 0.1M EDTA终止反应，合并4管同样的反应体系，分别用等体积的酚和酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)抽提一次，再用等体积的乙醚抽提两次后，用2.5倍体积的无水乙醇沉淀DNA，并用70％乙醇洗沉淀，最后重悬于18ul水中；随后在此混合物中加入2.5ul dNTP(1mMdCTP，1mMdGTP，1mMdTTP，10mMdATP)，1.25ul100mM DTT和5单位的T4DNA聚合酶，11℃30分，将酶切产物补成平端，75℃终止反应后，加入5单位的Tth DNA聚合酶及其相应的缓冲液并将体系扩大为80ul，使DNA的3’端加dA尾，此混合物经氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提和乙醚抽提后与Promega公司的3×10-3的pGEM-T-Easy载体于16℃连接24小时，总体积为90ul，其中有9ul的10×buffer和25单位的T4DNA连接酶，最后用无水乙醇沉淀连接混合物，70％乙醇洗后溶于30ul水中得到连接产物；用Bio-Rad公司的电转化感受态细胞的制备方法制备感受态大肠杆菌DH5α细胞，取2-3ul连接产物与50ul感受态大肠杆菌DH5α混合后，转到Bio-Rad公司的0.2cm的电击杯中电击，电压为2.5千伏，时间为5.0毫秒-6.0毫秒，电击后立即在杯中加入1ml的SOC培养基使菌复苏，然后将菌涂在含有氨苄青霉素、X-Gal和IPTG的LB固体培养基上37℃过夜培养，次日得到蓝白菌落。将得到的白色菌落即白色克隆转到含有氨苄青霉素的LB固体培养基上培养，同时从每个克隆中提取质粒并用EcoRI酶切鉴定其中的插入片段的大小，得到的白色克隆构成了鲍氏志贺氏菌7型的O-抗原基因簇文库；(4)对文库中的克隆测序。从文库中挑选插入片段在700bp以上的120个克隆由上海生物工程有限公司用ABI377型DNA自动测序仪对克隆中的插入片段单向进行测序，使序列达到80％的覆盖率。剩余20％的序列再根据已得到的序列设计引物，两对引物，如下所示5’-GCATGGGTTACTGTACTAGC-3’和3’-AATGGCATCAATACCCGC-5’及5’-TGGCGGTATTGAGAGAGT-3’和3’-TTACAGGCTACTTCTCTTC-5’，再从鲍氏志贺氏菌7型的基因组DNA中直接PCR并对PCR产物测序，从而获得O-抗原基因簇的所有序列。(5)核苷酸序列的拼接及分析。用英国剑桥MRC(Medical ResearchCouncil)分子生物学实验室出版的Staden package软件包的Pregap4和Gap4软件拼接和编辑所有的序列，从而得到鲍氏志贺氏菌7型的O-抗原基因簇的核苷酸全长序列(见序列列表)。序列的质量主要由两个方面来保证1)对鲍氏志贺氏菌7型的基因组作6个Long PCR反应，然后混合这些产物以产生文库。2)对每个碱基，保证3个以上高质量的覆盖率。在得到鲍氏志贺氏菌7型O-抗原基因簇的核苷酸序列后，用美国国家生物技术信息学中心(TheNational Center for Biotechnology Information，NCBI)的orffinder发现基因，找到13个开放的阅读框，用blast系列软件与GenBank中的基因比较以发现这些开放的阅读框的功能并确定它们是什么基因，再用英国sanger中心的Artemis软件完成基因注释，用Clustral W软件做DNA和蛋白质序列间的精确比对，最后得到鲍氏志贺氏菌7型的O-抗原基因簇的结构，(6)特异基因的筛选。针对鲍氏志贺氏菌7型的O-抗原基因簇中的wzx、wzy、orf8、orf10、orf11、orf12基因设计引物；在每个基因内各设计了三对引物，每对引物分布在相应基因内的不同地方，以确保其特异性；用这些引物以166株大肠杆菌和43株志贺氏菌的基因组为模板进行PCR，在其他组中都没有扩增到任何大小正确的带，即在大多数组中没有得到任何PCR产物带，虽然在少数组中得到PDR产物带，但其大小不符合预期大小，所以wzx、wzy、orf8、orf10、orf11、orf12基因对鲍氏志贺氏菌7型的O-抗原都是高度特异的。
全文摘要
本发明提供一种鲍氏志贺氏菌7型的O－抗原特异的核苷酸，其是鲍氏志贺氏菌7型(Shigella boydii 7)中控制O－抗原合成的基因簇的核苷酸全序列，还包括O－抗原基因簇的结构以及源于鲍氏志贺氏菌7型的O－抗原基因簇中的糖基转移酶基因和寡糖单位处理基因(包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy相似功能的基因)的寡核苷酸，并且包括获得细菌O－抗原基因簇的方法，本发明通过PCR证实它们对鲍氏志贺氏菌7型的O－抗原都有高度的特异性，本发明还公开了用本发明的寡核苷酸检测和鉴定人体及环境中的鲍氏志贺氏菌7型的方法。
文档编号C07H21/00GK1429832SQ0310053
公开日2003年7月16日 申请日期2003年1月20日 优先权日2003年1月20日
发明者王磊, 陶江, 冯露 申请人:南开大学
技术领域：
本发明涉及鲍氏志贺氏菌7型(Shigella boydii7)中控制O-抗原合成的基因簇的核苷酸全序列，特别是涉及鲍氏志贺氏菌7型中控制O-抗原合成的基因簇中的寡核苷酸，可利用这些对O-抗原特异的寡核苷酸快速、准确地检测人体及环境中的鲍氏志贺氏菌7型并鉴定这些致病菌中的O-抗原。
O-抗原是革兰氏阴性细菌脂多糖中的O特异性多糖成分，它由许多重复的寡糖单位组成。O-抗原的合成过程研究得较清楚先由糖基转移酶将核苷二磷酸单糖转移到一个固定在细胞内膜的脂分子上，然后在内膜的内侧合成寡糖单位，O-抗原的寡糖单位再通过转运酶被转移到内膜外侧，而后通过聚合酶聚合成多糖，再被连接到一个糖脂分子上形成脂多糖分子[Whitfield，C.(1995)“Biosynthesis of lipopolysaccharide Oantigens”.Trends in Microbiology.3178-185；Schnaitman，C.A.andJ.D.Klena.(1993)“Genetics of lipopolysaccharide biosynthesis inentericbacteria”.Microbiological Reviews，57(3)655-682]。编码负责O-抗原合成的所有酶分子的基因一般在染色体上相邻排列，形成一个基因簇[Reeves，P.R.，et al.(1996)“Bacterial polysaccharide synthesis and genenomenclature”Trends in Microbiology，4495-503]。在志贺氏菌、大肠杆菌和沙门氏菌中，O-抗原基因簇位于galF和gnd基因之间[Lei Wang.et al(2001)“Sequence analysis of four Shigella boydii O-antigen lociimplicationfor Escherichia coli and Shigella relationships”.Infection andImmunity，116923-6930；Lei Wang and Peter Reeves(2000)“TheEscherichia coli O111 and Salmonella enterica O35 gene clustersgeneclusters encoding the same colitose-containing O antigen are highlyconserved”.Journal of Bacteriology.1825256-5261]。O-抗原基因簇含有三类基因糖合成路径基因，糖基转移酶基因，寡糖单位处理基因。其中糖合成路径基因编码的酶合成O-抗原所需的核苷二磷酸单糖；糖基转移酶基因编码的酶将核苷二磷酸单糖及其它分子转到单糖上从而使单糖聚合成寡糖单位；寡糖单位处理基因包括转运酶基因和聚合酶基因，它们将寡糖单位转移到细菌内膜外侧，再聚合成多糖。糖基转移酶基因和寡糖单位处理基因只存在于携带这些基因的基因簇里。O-抗原中单糖的不同，单糖间联结键的不同和寡糖单位之间联结键的不同构成了O-抗原的多样性，而单糖的组成、单糖间的联结键及寡糖单位之间的联结键是由O-抗原基因簇中的基因控制着，所以O-抗原基因簇决定了O-抗原的合成，也决定了O-抗原的多样性。
因为O-抗原是极强的抗原，是志贺氏菌重要的致病因素之一，同时它又具有极强的多样性，这启示我们能研究一种快速、准确地检测志贺氏菌及其O-抗原的特异性好、灵敏度高的方法。以表面多糖为目标的血清学免疫反应自上世纪30年代以来一直被用于对细菌的分型和鉴定，是鉴定致病菌的唯一的手段。这种诊断方法需要大量的抗血清，而抗血清一般种类不全，数量不足，大量的抗血清在制备和储存中也存在一些困难。另一方面此法耗时长、灵敏度低、漏检率高、准确性差，所以，现在普遍认为这种传统的血清学检测方法将为现代分子生物学方法取代。1993年，Luk，J.M.C et.al用沙门氏菌(S.enterica)O-抗原基因簇的特异核苷酸序列通过PCR方法鉴定了沙门氏菌的O-抗原[Luk，J.M.C.et.al.(1993)“Selective amplification ofabequose and paratose synthase genes(rfb)by polymerase chain reactionfor identification of S.enterica major serogroups(A，B，C2，andD)”，J.Clin.Microbiol.312118-2123]。Luk，et.al的方法是将相应于沙门氏菌血清型E1，D1，A，B和C2的O-抗原内的CDP-阿比可糖和CDP-泰威糖的合成基因的核苷酸序列排列后得到对不同血清型的沙门氏菌特异的寡核苷酸。1996年，Paton，A.W et.al用针对E.coli O111的O-抗原特异的源于wbdI基因的寡核苷酸鉴定了一株产毒素的E.coli O111的血清型[“Molecularmicrobiological investigation of an outbreak of Hemolytic-UremicSyndrome caused by dry fermented sausage contaminated with Shiga-liketoxin producing Escherichiacoli”.J.Clin.Microbiol.341622-1627]，但是后来的研究表明Paton，A.W et.al的用源于wbdI基因的寡核苷酸鉴定E.coli O111的血清型的方法有假阳性结果出现。Bastin D.A.and Reeves，P.R.认为，这是由于wbdI基因是一个推测的糖合成路径基因[Bastin D.A.andReeves，P.R.(1995)Sequence and analysis of the O antigen gene(rfb)cluster of Escherichia coli O111.Gene 16417-23]，而在其它细菌的O-抗原的结构中也可能有这个糖，所以糖合成路径基因对于O-抗原并不是高度特异的。
志贺氏菌有46种血清型，大肠杆菌有166种不同的O-抗原，二者亲缘关系非常近，并且有12种O-抗原是大肠杆菌和志贺氏菌共有的，其中鲍氏志贺氏菌7型就拥有相同的O-抗原[Ewing，W.H.(1986)“Edwards and Ewing’sidentification of the Enterobacteriaceae”.Elsevier SciencePublishers，Amsterdam，The Netherlands；T.cheasty，et al.(1983)“Antigenic relationships between the enteroinvasive Escherichiacoli antigens O28ac，O112ac，O124，O136，O143，O144，O152 and O164 andShigella O antigens”J.clin Microbiol，17(4)681-684]，传统的血清型方法不能将它们区分。
本发明的次一目的是提供了鲍氏志贺氏菌7型的O-抗原基因簇的全长核苷酸序列。
本发明的另一目的是提供了构成鲍氏志贺氏菌7型的O-抗原基因簇的基因转运酶的基因即wzx基因或与wzx有相似功能的基因；聚合酶基因即wzy基因或与wzy有相似功能的基因；糖基转移酶基因，包括orf8、orf10、orf11、orf12基因；糖合成路径基因，包括flmA，flmB，neuA，flmD，flmH，nue，glf。
本发明的又一目的是提供了寡核苷酸，它们分别源于鲍氏志贺氏菌7型的O-抗原基因簇中编码糖基转移酶的基因包括orf8、orf10、orf11、orf12基因；源于编码转运酶的基因即wzx基因或与wzx有相似功能的基因、源于编码聚合酶的基因即wzy基因或与wzy有相似功能的基因；它们是上述基因内的寡核苷酸，长度在10-20nt；它们对鲍氏志贺氏菌7型的O-抗原是特异的；尤其是表一中列出的寡核苷酸，它们对鲍氏志贺氏菌7型的O-抗原是高度特异的，而且这些寡核苷酸还可重新组合，组合后的寡核苷酸对鲍氏志贺氏菌7型的O-抗原也是高度特异的。
本发明的再一目的是提供的上述寡核苷酸可作为引物用于核酸扩增反应，或者作为探针用于杂交反应，或者用于制造基因芯片或微阵列，从而通过这些方法来检测和鉴定鲍氏志贺氏菌7型的O-抗原及检测和鉴定鲍氏志贺氏菌7型。
本发明的还一目的是提供了分离鲍氏志贺氏菌7型的O-抗原基因簇的全序列的方法。按照本方法操作可以获得其他细菌的O-抗原基因簇的全序列，也可以获得编码其他多糖抗原的细菌的基因簇的全序列。
本发明的目的是由以下技术方案实现的。
本发明对鲍氏志贺氏菌7型的O-抗原特异的核苷酸，其特征在于，其是如SEQ ID NO1所示的分离的核苷酸，全长15796个碱基；或者具有一个或多个插入、缺失或取代的碱基，同时保持所述分离的核苷酸功能的SEQ ID NO1的核苷酸。
前述的对鲍氏志贺氏菌7型的O-抗原特异的核苷酸，其特征在于它是由11个基因组成，它们都位于galF基因和gnd基因之间。
前述的对鲍氏志贺氏菌7型的O-抗原特异的核苷酸，其特征在于，所述的基因包括转运酶基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因；聚合酶基因，包括wzy基因或与wzy有相似功能的基因；糖基转移酶基因，包括orf8、orf10、orf11、orf12基因；其中所述的wzx基因是SEQ ID NO1中的6714至7928碱基的核苷酸；orf8基因是SEQ ID NO1中的7936至8877碱基的核苷酸；wzy基因是SEQ ID NO1中的8889至10184碱基的核苷酸；orf10基因是SEQ ID NO1中的10186至11148碱基的核苷酸；orf11基因是SEQ IDNO1中的11355至12272碱基的核苷酸；orf12基因是SEQ ID NO1中的12247至13176碱基的核苷酸；前述的对鲍氏志贺氏菌7型的O-抗原特异的核苷酸，其特征在于，其是源于所述的wzx基因、wzy基因或糖基转移酶基因的orf8、orf10、orf11、orf12基因；或糖合成路径基因中的寡核苷酸；以及它们的混合或它们的重组。
前述的对鲍氏志贺氏菌7型的O-抗原特异的核苷酸，其特征在于，所述的源于wzx的寡核苷酸对是SEQ ID NO1中的6782至6799碱基的核苷酸和7449至7466碱基的核苷酸，SEQ ID NO1中的6971至6989碱基的核苷酸和7481至7498碱基的核苷酸，SEQ ID NO1中的7035至7053碱基的核苷酸和7588至7607碱基的核苷酸；源于orf8的寡核苷酸对是SEQ ID NO1中的8065至8082碱基的核苷酸和8789至8806碱基的核苷酸，SEQ ID NO1中的8134至8152碱基的核苷酸和8685至8704碱基的核苷酸，SEQ ID NO1中的8198至8215碱基的核苷酸和8459至8476碱基的核苷酸；源于wzy的寡核苷酸对是SEQ ID NO1中的9091至9108碱基的核苷酸和9457至9474碱基的核苷酸，SEQ ID NO1中的9357至9376碱基的核苷酸和9704至9721碱基的核苷酸，SEQ ID NO1中的9120至9137碱基的核苷酸和9945至9962碱基的核苷酸；源于orf10的寡核苷酸对是SEQ ID NO1中的10271至10288碱基的核苷酸和11060至11077碱基的核苷酸，SEQ ID NO1中的10375至10393碱基的核苷酸和10790至10808碱基的核苷酸，SEQ ID NO1中的10510至10528碱基的核苷酸和11090至11108碱基的核苷酸；源于orf11的寡核苷酸对是SEQ ID NO1中的11737至11754碱基的核苷酸和12013至12030碱基的核苷酸，SEQ ID NO1中的11367至11384碱基的核苷酸和12154至12171碱基的核苷酸，SEQ ID NO1中的11482至11598碱基的核苷酸和11839至11856碱基的核苷酸；源于orf12的寡核苷酸对是
SEQ ID NO1中的12274至12291碱基的核苷酸和13016至13033碱基的核苷酸，SEQ ID NO1中的12489至12506碱基的核苷酸和13101至13120碱基的核苷酸，SEQ ID NO1中的12384至12401碱基的核苷酸和12959至12976碱基的核苷酸。
前述的对鲍氏志贺氏菌7型的O-抗原特异的核苷酸在检测表达O-抗原的细菌、在诊断中鉴定细菌的O-抗原和细菌的其它多糖抗原的应用。
前述的对鲍氏志贺氏菌7型的O-抗原特异的核苷酸的重组分子，而且通过插入表达可提供表达鲍氏志贺氏菌7型的O-抗原，并成为细菌疫苗。
前述的对鲍氏志贺氏菌7型的O-抗原特异的核苷酸的应用，其特征在于，其作为引物用于PCR、作为探针用于杂交反应与荧光检测、或者用于制造基因芯片或微阵列，检测人体和环境中的细菌。
前述的对鲍氏志贺氏菌7型的O-抗原特异的核苷酸的分离方法，其特征在于，其包括下述步骤(1)提取基因组。在LB培养基中37℃过夜培养志贺氏菌，离心收集细胞，用Tris-HCl(pH8.0)和EDTA重悬细胞，37℃温育20分后加入溶菌酶裂解细菌，加入蛋白酶K和SDS降解蛋白质，再加入RNase去除RNA；然后用等体积酚及等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)抽提去除其中的酶和蛋白，再用等体积的乙醚抽提除去残余的酚；用2倍体积乙醇沉淀DNA，用玻璃丝卷出DNA后用70％乙醇洗DNA，最后将DNA重悬于30ulTE中，基因组DNA通过0.4％的琼脂糖凝胶电泳检测；(2)通过Long PCR扩增鲍氏志贺氏菌7型中的O-抗原基因簇。首先根据经常发现于O-抗原基因簇启动子区的JumpStart序列设计上游引物(#1523-ATT GTG GCT GCA GGG ATC AAA GAA AT)，再根据O-抗原基因簇下游的gnd基因设计下游引物(#1524-TAG TCG CGT GNG CCT GGA TTA AGT TCG C)；用Boehringer Mannheim公司的Expand Long Template PCR方法扩增O-抗原基因簇，PCR反应程序如下在94℃预变性2分；然后94℃变性10秒；60℃退火30秒，68℃延伸15分，这样进行30个循环；最后，在68℃继续延伸7分，得到长度为15796个碱基的PCR产物；合并6管long PCR产物，并用Promega公司的Wizard PCR Preps纯化试剂盒纯化PCR产物；(3)构建O-抗原基因簇文库。用被修改的Novagen DNaseI shot gun法构建O-抗原基因簇文库，反应体系是300ng PCR纯化产物，0.9ul0.1M MnCl2，1ul1∶2000稀释的1mg/ml的DNaseI，反应在室温中进行；选择合适的反应时间使酶切后的DNA片段大小集中在1kb-3kb之间，而后加入2ul0.1M EDTA终止反应，合并4管同样的反应体系，分别用等体积的酚和酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)抽提一次，再用等体积的乙醚抽提两次后，用2.5倍体积的无水乙醇沉淀DNA，并用70％乙醇洗沉淀，最后重悬于18ul水中；随后在此混合物中加入2.5ul dNTP(1mMdCTP，1mMdGTP，1mMdTTP，10mMdATP)，1.25ul100mM DTT和5单位的T4DNA聚合酶，11℃30分，将酶切产物补成平端，75℃终止反应后，加入5单位的Tth DNA聚合酶及其相应的缓冲液并将体系扩大为80ul，使DNA的3’端加dA尾，此混合物经氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提和乙醚抽提后与Promega公司的3×10-3的pGEM-T-Easy载体于16℃连接24小时，总体积为90ul，其中有9ul的10×buffer和25单位的T4DNA连接酶，最后用无水乙醇沉淀连接混合物，70％乙醇洗后溶于30ul水中得到连接产物，用Bio-Rad公司的电转化感受态细胞的制备方法制备感受态大肠杆菌DH5α细胞，取2-3ul连接产物与50ul感受态大肠杆菌DH5α混合后，转到Bio-Rad公司的0.2cm的电击杯中电击，电压为2.5千伏，时间为5.0毫秒-6.0毫秒，电击后立即在杯中加入1ml的SOC培养基使菌复苏，然后将菌涂在含有氨苄青霉素、X-Gal和IPTG的LB固体培养基上37℃过夜培养，次日得到蓝白菌落。将得到的白色菌落即白色克隆转到含有氨苄青霉素的LB固体培养基上培养，同时从每个克隆中提取质粒并用EcoRI酶切鉴定其中的插入片段的大小，得到的白色克隆构成了鲍氏志贺氏菌7型的O-抗原基因簇文库；(4)对文库中的克隆测序。从文库中挑选插入片段在700bp以上的120个克隆由上海生物工程有限公司用ABI377型DNA自动测序仪对克隆中的插入片段单向进行测序，使序列达到80％的覆盖率。剩余20％的序列再根据已得到的序列设计引物，两对引物，如下所示5’-GCATGGGTTACTGTACTAGC-3’和3’-AATGGCATCAATACCCGC-5’及5’-TGGCGGTATTGAGAGAGT-3’和3’-TTACAGGCTACTTCTCTTC-5’，再从鲍氏志贺氏菌7型的基因组DNA中直接PCR并对PCR产物测序，从而获得O-抗原基因簇的所有序列。
(5)核苷酸序列的拼接及分析。用英国剑桥MRC(Medical Research Council)分子生物学实验室出版的Staden package软件包的Pregap4和Gap4软件拼接和编辑所有的序列，从而得到鲍氏志贺氏菌7型的O-抗原基因簇的核苷酸全长序列(见序列列表)。序列的质量主要由两个方面来保证1)对鲍氏志贺氏菌7型的基因组作6个Long PCR反应，然后混合这些产物以产生文库。2)对每个碱基，保证3个以上高质量的覆盖率。在得到鲍氏志贺氏菌7型O-抗原基因簇的核苷酸序列后，用美国国家生物技术信息学中心(The NationalCenter for Biotechnology Information，NCBI)的orffinder发现基因，找到13个开放的阅读框，用blast系列软件与GenBank中的基因比较以发现这些开放的阅读框的功能并确定它们是什么基因，再用英国sanger中心的Artemis软件完成基因注释，用Clustral W软件做DNA和蛋白质序列间的精确比对，最后得到鲍氏志贺氏菌7型的O-抗原基因簇的结构，(6)特异基因的筛选。针对鲍氏志贺氏菌7型的O-抗原基因簇中的wzx、wzy、orf8、orf10、orf11、orf12基因设计引物。在每个基因内各设计了三对引物，每对引物分布在相应基因内的不同地方，以确保其特异性；用这些引物以166株大肠杆菌和43株志贺氏菌的基因组为模板进行PCR，在各组中都没有扩增到任何大小正确的带，即在大多数组中没有得到任何PCR产物带，虽然在少数组中得到PDR产物带，但其大小不符合预期大小，所以wzx、wzy、orf8、orf10、orf11、orf12基因对鲍氏志贺氏菌7型的O-抗原都是高度特异的。
也就是，在本发明的第一个方面，提供了鲍氏志贺氏菌7型的O-抗原基因簇的全长核苷酸序列，它的全序列如SEQ ID NO1所示，全长15796个碱基；或者具有一个或多个插入、缺失或取代的碱基，同时保持所述分离的核苷酸功能的SEQ ID NO1的核苷酸。通过本发明的方法得到了鲍氏志贺氏菌7型的O-抗原基因簇的结构，如表3所示，它总共由11个基因组成，都位于galF基因和gnd基因之间。
在本发明的第二个方面，提供了鲍氏志贺氏菌7型的O-抗原基因簇中的基因，即转运酶基因(wzx基因或与wzx有相似功能的基因)；聚合酶基因(wzy基因或与wzy有相似功能的基因)；糖基转移酶基因，包括orf8、orf10、orf11、orf12基因；细菌多糖抗原中特殊的糖合成路径基因，包括flmA，flmB，neuA，flmD，flmH，nue，glf基因，它们在O-抗原基因簇中的起始位置和终止位置及核苷酸序列都列在表4中。本发明尤其涉及到糖基转移酶基因、转运酶基因和聚合酶基因，因为糖合成路径基因即合成核苷二磷酸单糖的基因现在被预示对较多胞外多糖是常见的、共同的，对细菌的O-抗原并不是很特异的，而本发明涉及到的糖基转移酶基因、转运酶基因和聚合酶基因对鲍氏志贺氏菌7型的O-抗原是高度特异的。
在本发明的第三个方面，提供了源于鲍氏志贺氏菌7型的O-抗原基因簇中的wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因和糖基转移酶基因，包括orf8、orf10、orf11、orf12基因的寡核苷酸，它们是这些基因中的任何一段寡核苷酸。但是，优先被用的是列于表一中的寡核苷酸对，在表一中也列出了这些寡核苷酸对在O-抗原基因簇中的位置及以这些寡核苷酸对为引物所做的PCR反应的产物的大小，这些PCR反应可用表中的退火温度进行。这些引物只在以鲍氏志贺氏菌7型为模板进行的PCR扩增中得到预期大小的产物，而在以表二所列的166株大肠杆菌和43株志贺氏菌为模板进行的PCR扩增中都未得到预期大小的产物。更详细地说，以这些寡核苷酸对为引物所做的PCR反应在大多数细菌中均未得到任何产物，虽然在有些菌中得到了PCR产物带，但其大小不符合预期大小，这是由于引物结合到基因组的别的位置造成，这种问题可通过用基因内的其它引物做PCR来避免。所以，可以确定这些引物即表一所列的寡核苷酸对鲍氏志贺氏菌7型及它们的O-抗原是高度特异的。
本发明的其他方面由于本文的技术的公开，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
如本发明所用，“寡核苷酸”是指来源于O-抗原基因簇中的编码糖基转移酶的基因、编码转运酶的基因和编码聚合酶的基因内的一段核苷酸分子，它们在长度上可改变，一般在10到20个核苷酸范围内改变。更确切的说这些寡核苷酸是源于wzx基因(核苷酸位置是从SEQ ID NO1的6714至7928碱基)，orf8基因(核苷酸位置是从SEQ ID NO1的7936至8877碱基)，wzy基因(核苷酸位置是从SEQ ID NO1的8889至10184碱基)，orf10基因(核苷酸位置是从SEQ ID NO1的10186至11148碱基)，orf11基因(核苷酸位置是从SEQID NO1的11355至12272碱基)，orf12基因(核苷酸位置是从SEQ ID NO1的12247至13176碱基)。源于以上基因内的寡核苷酸对鲍氏志贺氏菌7型(SEQID NO1)都是高度特异的。
此外，有时两个遗传相似的编码不同O-抗原的基因簇通过基因重组或突变产生新的O-抗原，从而产生新的细菌类型，新的突变株。在这种环境中，需要筛选出多对寡核苷酸同重组基因杂交以提高检测的特异性。因此，本发明提供了一整套多对寡核苷酸的混合物，它们源于糖基转移酶基因；源于转运酶和聚合酶基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因；也源于糖合成路径基因。这些基因的混合物对一个特殊的细菌多糖抗原来说是特异的，从而使这套寡核苷酸对这个细菌的多糖抗原是特异的。更具体地说，这些寡核苷酸的混合物是源于糖基转移酶基因、wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy或与wzy有相似功能的基因中的寡核苷酸与源于糖合成路径基因中的寡核苷酸的组合。
在另一方面，本发明涉及寡核苷酸的鉴定，它们可以用于检测表达O-抗原的细菌和在诊断中鉴定细菌的O-抗原。
本发明涉及到一种检测食品中的一个或多个细菌多糖抗原的方法，这些抗原可以使样品能与以下至少一个基因的寡核苷酸特异性杂交，这些基因是(i)编码糖基转移酶的基因(ii)编码转运酶和聚合酶的基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因。在条件许可的情况下至少一个寡核苷酸能与至少一个表达特殊的O-抗原的细菌的一个以上的那样的基因特异性杂交，这些细菌是鲍氏志贺氏菌7型或。可用PCR方法检测，更可以将本发明方法中的核苷酸标记后作为探针通过杂交反应如southern-blot或荧光检测，或者通过基因芯片或微阵列检测样品中的抗原及细菌。
本发明者考虑到以下情况当单个的特异的寡核苷酸检测无效时，寡核苷酸的混合物能与靶区域特异性杂交以检测样品。因此本发明提供了一套寡核苷酸用于本发明所述的检测方法。这里所说的寡核苷酸是指源于编码糖基转移酶的基因、编码转运酶的基因和聚合酶的基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因的寡核苷酸。这套寡核苷酸对一个特殊的细菌的O-抗原来说是特异的，这一特殊的细菌O-抗原是由鲍氏志贺氏菌7型或表达的。
另一方面，本发明涉及到一种检测排泄物中的一个或多个细菌多糖抗原的方法，这些抗原可以使样品能与以下至少一个基因的寡核苷酸特异性杂交，这些基因是(i)编码糖基转移酶的基因(ii)编码转运酶和聚合酶的基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因。在条件许可的情况下至少一个寡核苷酸能与至少一个表达特殊的O-抗原的细菌的一个以上的那样的基因特异性杂交。这些细菌是鲍氏志贺氏菌7型或。可用本发明中的寡核苷酸作引物通过PCR的方法检测样品，也可将本发明中的寡核苷酸分子标记后作为探针通过杂交反应如southern-blot或荧光检测，或者通过基因芯片或微阵列检测样品中的抗原及细菌。
一般一对寡核苷酸可能与同样的基因杂交也可与不同的基因杂交，但它们中必须有一个寡核苷酸能特异性杂交到特殊抗原型的特异序列上，另一个寡核苷酸可杂交于非特异性区域。因此，当特殊的多糖抗原基因簇中的寡核苷酸被重新组合时，至少能选出一对寡核苷酸与多糖抗原基因簇中特异基因混合物杂交，或者选出多对寡核苷酸与特异基因的混合物杂交。甚至即使当一个特殊的基因簇中所有基因都独一无二时，此方法也能应用于识别此基因簇内的基因混合物的核苷酸分子。因此本发明提供了一整套用于检测本发明方法的多对寡核苷酸，在这里多对寡核苷酸是源于编码糖基转移酶的基因、编码转运酶和聚合酶的基因包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因，这套寡核苷酸对一个特殊的细菌多糖来说是特异的，这套寡核苷酸可能是糖合成中必须基因的核苷酸。
另一方面，本发明也涉及到一种检测源于病人的样品中的一个或多个细菌多糖抗原的方法。样品中的一个或多个细菌多糖抗原可以使样品能与以下至少一个基因中的一对寡核苷酸中的一个特异性杂交，这些基因是(i)编码糖基转移酶的基因(ii)编码转运酶和聚合酶的基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因。在条件许可的情况下至少一个寡核苷酸能与样品中的至少一个表达特殊的O-抗原的细菌的一个以上的那样的基因特异性杂交，这些细菌是鲍氏志贺氏菌7型或。可用本发明中的寡核苷酸作引物通过PCR的方法检测样品，也可将本发明中的寡核苷酸标记后作为探针通过杂交反应，或者通过基因芯片或微阵列检测样品中的抗原及细菌。
更详细地说，以上描述的方法可以理解为当寡核苷酸对被使用时，其中的一个寡核苷酸分子能杂交到一个并不是来源于糖基转移酶基因、wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因的序列上。此外，当两个寡核苷酸都能杂交上时，它们可能杂交于同一基因也可能杂交到不同基因上。也即，当交叉反应出现问题时，可选择寡核苷酸的混合物来检测混合的基因以提供检测的特异性。
本发明者相信本发明不必限于以上所提的核苷酸序列编码的特定的O-抗原，而且广泛应用于检测所有表达O-抗原和鉴定O-抗原的细菌。而且，由于O-抗原合成和其他多糖抗原(如细菌胞外抗原)合成之间的相似性，发明者相信本发明的方法和分子也应用于这些其他的多糖抗原。
本发明首次公开了鲍氏志贺氏菌7型的O-抗原基因簇的全长序列，而且可从这个未被克隆的全长基因簇的序列中产生重组分子，通过插入表达可产生表达鲍氏志贺氏菌7型的O-抗原，并成为有用的疫苗。
具体实施例方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(NewYorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件。实施例1基因组的提取。
在5mL的LB培养基中37℃过夜培养志贺氏菌，离心收集细胞。用500ul50mM Tris-HCl(pH8.0)和10ul 0.4M EDTA重悬细胞，37℃温育20分，然后加入10ul 10mg/ml的溶菌酶继续保温20分。之后加入3ul 20mg/ml的蛋白酶K、15ul 10％SDS，50℃温育2小时，再加入3ul 10mg/ml的RNase，65℃30分。加等体积酚抽提混合物，取上清液液再用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)抽提两次，取上清液液再用等体积的乙醚抽提以除去残余的酚。上清液液用2倍体积乙醇沉淀DNA，用玻璃丝卷出DNA并用70％乙醇洗DNA，最后将DNA重悬于30ul TE中。基因组DNA通过0.4％的琼脂糖凝胶电泳检测。实施例2通过PCR扩增鲍氏志贺氏菌7型中的O-抗原基因簇。
鲍氏志贺氏菌7型的O-抗原基因簇通过Long PCR扩增。首先根据经常发现于O-抗原基因簇启动子区的JumpStart序列设计上游引物(#1523-ATTGTG GCT GCA GGG ATC AAA GAA AT)，再根据O-抗原基因簇下游的gnd基因设计下游引物(#1524-TAG TCG CGT GNG CCT GGA TTA AGT TCG C)。用BoehringerMannheim公司的Expand Long Template PCR方法扩增O-抗原基因簇，PCR反应程序如下在94℃预变性2分；然后94℃变性10秒，60℃退火30秒，68℃延伸15分，这样进行30个循环。最后，在68℃继续延伸7分，得到PCR产物，用0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的大小及其特异性。合并6管long PCR产物，并用Promega公司的Wizard PCR Preps纯化试剂盒纯化PCR产物。实施例3构建O-抗原基因簇文库。
首先是连接产物的获得用被修改的Novagen DNaseI shot gun法构建O-抗原基因簇文库。反应体系是300ng PCR纯化产物，0.9ul 0.1M MnCl2，1ul 1∶2000稀释的1mg/ml的DNaseI，反应在室温中进行。酶切10分钟使DNA片段大小集中在1kb-3kb之间，而后加入2ul 0.1M EDTA终止反应。合并4管同样的反应体系，分别用等体积的酚和酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)抽提一次，再用等体积的乙醚抽提两次后，用2.5倍体积的无水乙醇沉淀DNA，并用70％乙醇洗沉淀，最后重悬于18ul水中。随后在此混合物中加入2.5uldNTP(1mMdCTP，1mMdGTP，1mMdTTP，10mMdATP)，1.25ul 100mM DTT和5单位的T4DNA聚合酶，11℃30分，将酶切产物补成平端，75℃终止反应后，加入5单位的Tth DNA聚合酶及其相应的缓冲液并将体系扩大为80ul，70℃反应20分，使DNA的3’端加dA尾。此混合物经等体积氯仿∶异戊醇抽提和等体积乙醚抽提后与Promega公司的3×10-3的pGEM-T-Easy载体于16℃连接24小时，总体积为90ul。其中有9ul的10×buffer和25单位的T4DNA连接酶。最后用1/10体积的3M NaAc(pH5.2)和2倍体积的无水乙醇沉淀连接混合物，再用70％乙醇洗沉淀，干燥后溶于30ul水中得到连接产物。
其次是感受态细胞的制备参照Bio-Rad公司提供的方法制备感受态细胞大肠杆菌DH5α。取一环大肠杆菌DH5α单菌落于5ml的LB培养基中，180rpm培养10小时后，取2ml培养物转接到200ml的LB培养基中，37℃250rpm剧烈振荡培养到OD600 0.5左右，然后冰浴冷却20分，于4℃4000rpm离心15分。倾尽上清液液，用冷的冰预冷的去离子灭菌水200ml吹散菌体，于4℃4000rpm离心15分。再用冷的冰预冷的去离子灭菌水100ml吹散菌体，于4℃4000rpm离心15分。用冷的冰预冷的10％的甘油悬浮细胞，4℃ 6000rpm离心10分，弃上清液液，最后沉淀用1ml冰预冷的10％的甘油悬浮细胞，即为感受态细胞。将制得的感受态细胞分装为50ul一管，-70℃保存。
最后是电转化感受态细胞取2-3ul连接产物与50ul感受态大肠杆菌DH5α混合后，转到Bio-Rad公司的0.2cm的电击杯中电击，电压为2.5千伏，时间为5.0毫秒-6.0ms毫秒。电击后立即在杯中加入1ml的SOC培养基使菌复苏。然后立即将菌涂在含有氨苄青霉素、X-Gal和IPTG的LB固体培养基上37℃倒置过夜培养，次日得到蓝白菌落。将得到的白色菌落即白色克隆转到含有氨苄青霉素的LB固体培养基上培养，同时从每个克隆中提取质粒并用EcoRI酶切鉴定其中的插入片段的大小，得到白色克隆群构成了鲍氏志贺氏菌7型的O-抗原基因簇文库。实施例4对文库中的克隆测序从文库中挑选插入片段在700bp以上的120个克隆由上海生物工程有限公司用ABI377型DNA自动测序仪对克隆中的插入片段单向进行测序，使序列达到80％的覆盖率。剩余20％的序列再根据已得到的序列设计引物，再从鲍氏志贺氏菌7型的基因组DNA中直接PCR并对PCR产物测序，从而获得O-抗原基因簇的所有序列。在鲍氏志贺氏菌7型中我们设计了两对引物，如下所示5’-GCATGGGTTACTGTACTAGC-3’和3’-AATGGCATCAATACCCGC-5’5’-TGGCGGTATTGAGAGAGT-3’和3’-TTACAGGCTACTTCTCTTC-5’实施例5核苷酸序列的拼接及分析用英国剑桥MRC(Medical Research Council)分子生物学实验室出版的Staden package软件包的Pregap4和Gap4软件拼接和编辑所有的序列，从而得到鲍氏志贺氏菌7型的O-抗原基因簇的核苷酸全长序列(见序列列表)。序列的质量主要由两个方面来保证1)对鲍氏志贺氏菌7型的基因组作6个Long PCR反应，然后混合这些产物以产生文库。2)对每个碱基，保证3个以上高质量的覆盖率。在得到鲍氏志贺氏菌7型O-抗原基因簇的核苷酸序列后，用美国国家生物技术信息学中心(The National Center for BiotechnologyInformation，NCBI)的orffinder发现基因，找到13个开放的阅读框，用blast系列软件与GenBank中的基因比较以发现这些开放的阅读框的功能并确定它们是什么基因，再用英国sanger中心的Artemis软件完成基因注释，用Clustral W软件做DNA和蛋白质序列间的精确比对，最后得到鲍氏志贺氏菌7型的O-抗原基因簇的结构，如表3所示。
通过检索和比较，发现orf1与Aeromonas punctata的合成酶flmA基因在197个氨基酸的序列中都有53％的相同性，表明它们之间有高度的同源性。所以可以确定orf1是flmA基因。orf2与Aeromonas punctata的合成酶flmB基因在378个氨基酸的序列中都有61％的相同性，表明它们之间有高度的同源性。所以可以确定orf2是flmB基因。orf3与Aeromonas punctata的nueA基因在227个氨基酸的序列中有56％的相同性，表明它们之间有高度的同源性。所以，可以确定orf3是neuA基因。orf4与Aeromonas punctata的flmD基因在361氨基酸的序列中有33％的相同性，53％的相似性，表明它们之间也有高度的同源性。所以，可以确定orf4是flmD基因。orf5与Aeromonaspunctata的flmH基因在227个氨基酸的序列中有35％的相同性，59％的相似性，表明它们之间有高度的同源性。所以，可以确定orf5是flmH基因。Orf6与Aeromonas punctata的neuB基因在361氨基酸的序列中有73％的相同性，84％的相似性，表明它们之间也有高度的同源性。所以，可以确定orf6是neuB基因。Orf7与大肠杆菌的wzx基因在307个氨基酸序列中有23％的相同性，并且通过Eisenberg等人的算法[Eisenberg，D，Schwarz，E.etal(1984).Analysis ofmembrane and surface protein sequences with the hydrophobic momentplot.J.Mol.Biol.179125-142]发现orf7有12个潜在的穿膜区，它与许多wzx蛋白相似，而且在wzx蛋白的氨基端有一个大约50个氨基酸的保守基序，所以可以确定orf7是wzx基因，命名为wzx。Orf8与Salmonella enterica的glycosyltansferase基因在286个氨基酸中有29％的相同性，是一个糖基转移酶基因，命名为orf8。 Orf9与大肠杆菌的wzy基因在306个氨基酸序列中有20％的相同性，另外通过Eisenberg算法得知orf9有10个潜在的穿膜区，与其他的O-抗原聚合酶有相似的二级结构，所以确定orf9就是wzy基因，命名为wzy。Orf11与S.boydii的糖基转移酶基因在239个氨基酸序列中有32％的相同性，51％的相似性，所以确定orf11是一个乙酰基转移酶基因，命名为orf11。Orf12与Methanothermobacter thermautotrophicas的糖基转移酶基因在286个氨基酸序列中有36％的相同性，51％的相似性，所以确定orf12是一个糖基转移酶基因，命名为orf12。 Orf12与Pseudomonas aeruginosa的合成酶wbpS基因在628个氨基酸序列中有56％的相同性，72％的相似性，所以确定orf12是一个合成酶酶基因，命名为orf12，Orf13与Pseudomonastyphimurium LT2的glf基因在381个氨基酸序列中有58％的相同性，73％的相似性，所以可以确定orf13是glf基因，命名为glf。根据鲍氏志贺氏菌7型的O-抗原结构可知还需要有1个糖基转移酶基因，orf10与已知序列无明显同源性，但具有糖基转移酶的特征，是1个糖基转移酶，命名为orf10。实施例6特异基因的筛选。针对鲍氏志贺氏菌7型的O-抗原基因簇中的wzx、wzy、orf8、orf10、orf11、orf12基因设计引物，这些基因在核苷酸序列中的位置见表1所示。
表1列出了鲍氏志贺氏菌7型的O抗原基因簇中糖基转移酶基因和寡糖单位处理基因及基因内的引物及PCR数据。在表中列出了鲍氏志贺氏菌7型的O抗原基因簇的糖基转移酶基因、转运酶基因和聚合酶基因及它们的相应的功能和大小。在每个基因内，我们各设计了三对引物，每对引物分布在相应基因内的不同地方以确保其特异性。在表中还列出了每个引物在SEQ IDNO1中的位置和大小。以每对引物用表中所列的相应的退火温度以表二中的所有菌的基因组为模板进行PCR，得到了相应的PCR产物，其大小也列于表中。
mdh(malate dehydrogenase)基因是存在于所有的大肠杆菌的基因组中且高度保守的一个基因，所以我们根据mdh基因设计了引物#101(-TTC ATC CTAAAC TCC TTA TT)和#102(-TAA TCG CAG GGG AAA GCA GG)，然后从166株大肠杆菌中提取基因组，方法如前所述。用这对引物从166株大肠杆菌的基因组中PCR以鉴定大肠杆菌并检测其基因组的质量。
表2是用于筛选特异基因的166株大肠杆菌和43株志贺氏菌及它们的来源，为了检测的方便，我们将它们每8-10个菌分为一组，总共27组，它们的来源都列于表中。
在第23组中含有鲍氏志贺氏菌7型的基因组DNA作为阳性对照。以每组菌做模板，用表一中的每对引物按如下条件做PCR在94℃预变性2分后，94℃变性15秒，退火温度因引物的不同而不同(参照表一)，退火时间是50秒，72℃延伸2分，这样进行30个循环。最后在72℃继续延伸10分，反应体系是25ul。反应完毕后，取10ulPCR产物通过0.8％琼脂糖凝胶电泳检测扩增出的片段。
对于wzx、wzy、orf8、orf10、orf11、orf12基因，每个基因都有1至3对引物被检测，每对引物除了在第23组中做PCR后得到了预期大小的正确的一条带外，在第18组中也都得到同样大小的特异性带。以第18组中的每个菌的基因组DNA做模板PCR后，发现只在中得到了阳性结果。更详细地说，以上每个基因的每一对引物都在中得到预期大小的正确的PCR产物带。据报道，鲍氏志贺氏菌7型的O-抗原结构是一样的，我们的结果从另一个侧面证实了这一点。此外，所有的引物在其他组中都没有扩增到任何大小正确的带，也就是说，在大多数组中没有得到任何PCR产物带，虽然在少数组中得到PCR产物带，但其大小不符合预期大小，所以wzx、wzy、orf8、orf10、orf11、orf12基因对鲍氏志贺氏菌7型及其O-抗原都是高度特异的。
最后，通过PCR从鲍氏志贺氏菌7型中筛选到对鲍氏志贺氏菌7型的O-抗原高度特异的基因wzx、wzy和四个糖基转移酶基因。而这些基因内的任何一段10-20nt的寡核苷酸对鲍氏志贺氏菌7型的O-抗原是特异的，尤其是上述每个基因中的引物即寡核苷酸对经PCR检测后证实对鲍氏志贺氏菌7型是高度特异的。所有的这些寡核苷酸都可用于快速准确地检测人体和环境中的鲍氏志贺氏菌7型，并能鉴定它们的O-抗原。
表3是鲍氏志贺氏菌7型的O-抗原基因簇的结构表，在表中列出了鲍氏志贺氏菌7型的O-抗原基因簇的结构，共由13个基因组成，每个基因用方框表示，并在方框内写入基因的名称，数字表示的是O-抗原基因簇中的开放阅读框(orf)的顺序。在O-抗原基因簇的两端是galF基因和gnd基因，这两个基因不负责O-抗原的合成，我们只是用它们的一段序列设计引物来扩增O-抗原基因簇的全长序列。
表4是鲍氏志贺氏菌7型的O-抗原基因簇中的基因的位置表，在表中列出了鲍氏志贺氏菌7型的O-抗原基因簇中的所有开放阅读框在全序列中的准确位置，在每个开放阅读框的起始密码子和终止密码子的下面划线。
序列列表SEQUENCE LISTING<110>南开大学<120>对鲍氏志贺氏菌7型的O-抗原特异的核苷酸<130>对鲍氏志贺氏菌7型的O-抗原特异的核苷酸<160>1<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>15796<212>DNA<213>Shigella boydii<400>1ctcctggtga ctcatgcgtc caagaacgcg gtcgaaaacc acttcgacac ctcatatgaa 60ttagaatcgc tccttgaaca gcgtgtaaaa cgccagttgc tggcggaagt tcagtccatc120tgcccaccgg gcgtcaccat tatgaatgtg cgtcagagcg aacctttagg tttgggccac180tccattttgt gcgccagacc cgccattggc gacaatccat tcgttgtggt gctgcctgat240gtcgttattg atgatgccag cgccgatccg ctgcgttaca accttgccgc tatgattgcg300cgattcaacg aaacgggtcg cagtcaggtt ctggcaaaac gtatgccggg tgacctctct360gaatactctg tcatccagac taaagaaccg ctggatcgtg aaggcaaagt cagtcgcatt420gttgaattta tcgaaaaacc cgatcagccg cagacactgg attcagacat tatggcggtt480ggtcgctatg tgctttctgc agacatttgg cctgaactgg agcggactca acccggtgca540tggggacgta ttcagctaac tgacgcaatt gccgaactgg cgaaaaaaca gtccgttgat600gcaatgttaa tgacgggtga cagctacgac tgcggtaaaa aaatgggcta catgcaggca660tttgtgaagt acggactacg caacctgaaa gaaggagtga agttccgcaa agggattgag720cagctgttaa gcgaataaaa 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atgggatcac gtggttcggt 1620aataccgttc ttcttatcta tcaaagaaaa aggagaattg cctattactg atgatcgtat 1680gactcgcttt atgattactc tggagcaggg ggttgagtta gtttggcatg cgtttgaaga 1740tatggtcggt ggtgaaattt atgtaaaaaa aataccttcg atgaaagtaa ctgatatagc 1800aacagctgtt gcgcctaatg ctacacaaaa aatggtcggt attcgaccgg gcgagaaact 1860acacgagcag atgatcagtg ctgaagatgc ttattacact tatgaatatc cagagcattt 1920taagattctt ccagccattc acaactggtg taactcacct gaaaggatta aagatggtaa 1980aaaagtgcca gaaggcttcg tctatgaaag tgatagtaac gcagaatgga tgagtattga 2040agaacttcgt caatggatcg aggataatag agaaaaagta ggtaacattt gatgaaattt 2100attccctatg gacggcagga tgtttctgat gaagatatcc atgctgtggt ggatgtactg 2160aagtccgatt ttttgacgca aggaccatgt gttccccaat ttgagaaggc aattgctgat 2220tatgtgaatg ctaagtatgc agttgcagta aatagtgcta cttcagcact tcacattgct 2280tgtctcgcgt tggggatgaa gaaaggcgat tggctttgga catcgccaaa tacatttgtt 2340gcttctgcga actgtgctct ttattgcggt gctaatgtca gttttgtcga tattgatgcg 2400cggacttata atatgagtgt tagcgcgtta gaagcgaaac ttatgtctgc 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cgacataacc aaagacatct tcaccaaaaa agatgaagac ggtaactacc tggttgatgt15240gattctggat gaagcggcta acaaaggtac cggtaaatgg accagccaga gtgcgctgga15300tctcggcgaa ccgctgtcgc tgattaccga gtctgtgttt gcacgttata tctcgtctct15360gaaagatcag cgtgttgccg cgtctaaagt tctctctggt ccgcaggcac agccagcagg15420cgacaaagcg gagttcatcg agaaagttcg ccgtgcgctg tatcttggca aaatcgtttc15480ttatgctcag ggcttctctc aattgcgtgc cgcgtctgaa gagtatcact gggatctgaa15540ctacggtgaa atcgcgaaga ttttccgtgc tggctgcatc atccgtgcgc agttcctgca15600gaaaatcacc gatgcctatg ccgaaaacct aaaaatcgct aacctgctgt tggctccgta15660ttttaagaaa atcgctgacg actaccaaca agcactgcgt gatgtcgtcg cttatgcagt15720gcaaaacggt attccggttc caaccttctc tgcggcggtt gcttattacg acagctatcg15780tgccgctgtcctgcct 15796表一鲍氏志贺氏菌7型O抗原基因簇中的糖基转移酶基因和寡糖单位处理基因及其中的引物及PCR数据
*在所有组中得到2条错误大小的带，**在6组中都得到1条错误大小的带，***在所有组中得到1条错误大小的带表二 166株大肠杆菌和43株志贺氏菌及它们的来源组号 该组中含有的菌株 来源1 野生型大肠杆菌O1，O2，O3，O10，O16，O18，O39 IMVSa2 野生型大肠杆菌O40，O41，O48，O49，O71，O73，O88，O100IMVS3 野生型大肠杆菌O102，O109，O119，O120，O121，O125，O126，O137 IMVS4 野生型大肠杆菌O138，O139，O149，O7，O5，O6，O11，O12IMVS5 野生型大肠杆菌O13，O14，O15，O17，O19ab，O20，O21，O22 IMVS6 野生型大肠杆菌O23，O24，O25，O26，O27，O28，O29，O30IMVS7 野生型大肠杆菌O32，O33，O34，O35，O36，O37，O38，O42IMVS8 野生型大肠杆菌O43，O44，O45，O46，O50，O51，O52，O53IMVS9 野生型大肠杆菌O54，O55，O56，O57，O58，O59，O60，O61IMVS10 野生型大肠杆菌O62，O63，O64，O65，O66，O68，O69，O70IMVS11 野生型大肠杆菌O74，O75，O76，O77，O78，O79，O80，O81IMVS12 野生型大肠杆菌O82，O83，O84，O85，O86，O87，O89，O90IMVS13 野生型大肠杆菌O91，O92，O95，O96，O97，O98，O99，O101 IMVS14 野生型大肠杆菌O112，O162，O113，O114，O115，O116，O117，O118IMVS15 野生型大肠杆菌O123，O165，O166，O167，O168，O169，O170，O171See b16 野生型大肠杆菌O172，O173，O127，O128，O129，O130，O131，O132， See c17 野生型大肠杆菌O133，O134，O135，O136，O140，O141，O142，O143IMVS18 野生型大肠杆菌O144，O145，O146，O147，O148，O150，O151，O152IMVS19 野生型大肠杆菌O153，O154，O155，O156，O157，O158，O159，O164IMVS20 野生型大肠杆菌O160，O161，O163，O8，O9，O124，O111 IMVS21 野生型大肠杆菌O103，O104，O105，O106，O107，O108，O110 IMVS22 鲍氏志贺氏菌血清型B4，B5，B6，B8，B9，B11，B12，B14 Seed23 鲍氏志贺氏菌血清型B1，B3，B7，B8，B10，B13，B15，B16，B17，B18 Seed24 痢疾志贺氏菌血清型D1，D2，D3，D4，D5，D6，D7，D8Seed25 痢疾志贺氏菌血清D9，D10，D11，D12，D13 Seed26 弗氏志贺氏菌F6a，F1a，F1b，F2a，F2b，F3，F4a，F4b，F5(v7)F5(v4) Seed27 宋内氏志贺氏D5，DR Seeda. Institude of Medical and Veterinary Science，Anelaide，Australiab. O123 from IMVS；the rest from Statens Serum Institut，Copenhagen，Denmarkc. 172 and 173 from Statens Serum Institut，Copenhagen，Denmark，the rest from IMVSd. 中国预防医学科学院流行病学研究所表3是鲍氏志贺氏菌7型的O-抗原基因簇的结构表 1kb表4是鲍氏志贺氏菌7型的O-抗原基因簇中的基因的位置表ctcctggtga ctcatgcgtc caagaacgcg gtcgaaaacc acttcgacac ctcatatgaa 60ttagaatcgc tccttgaaca gcgtgtaaaa cgccagttgc tggcggaagt tcagtccatc 120tgcccaccgg gcgtcaccat tatgaatgtg cgtcagagcg aacctttagg tttgggccac 180tccattttgt gcgccagacc cgccattggc gacaatccat tcgttgtggt gctgcctgat 240gtcgttattg atgatgccag cgccgatccg ctgcgttaca accttgccgc tatgattgcg 300cgattcaacg aaacgggtcg cagtcaggtt ctggcaaaac gtatgccggg tgacctctct 360gaatactctg tcatccagac taaagaaccg ctggatcgtg aaggcaaagt cagtcgcatt 420gttgaattta tcgaaaaacc cgatcagccg cagacactgg attcagacat tatggcggtt 480ggtcgctatg tgctttctgc agacatttgg cctgaactgg agcggactca acccggtgca 540tggggacgta ttcagctaac tgacgcaatt gccgaactgg cgaaaaaaca gtccgttgat 600gcaatgttaa tgacgggtga cagctacgac tgcggtaaaa aaatgggcta catgcaggca 660tttgtgaagt acggactacg caacctgaaa gaaggagtga agttccgcaa agggattgag 720cagctgttaa gcgaataaaa atcttaccgg atgtaacggt taataagaaa atcataacgg 780cagtgaagat tcgtggtgaa agtaaattgc aacgaatgtt cctgccgtta ttgctttata 840aaacactata ataacaatga gttagcaata agattttagt caaatttttc caggattttc 900cttgtttcca gagcggattg gtaagacaat tagcgtttga atttttcggg tttagcgcga 960gtgggtaatg ctcgtcacat cgtaggtatg catgcagtgc tctggtagct gttaagccag1020gggcggtagc gtgtgttaaa cttaaggggg ttgttgcgag taatcaagat cgcggcaatt1080tcggattgtg tcttattttg ataataaaac tatcctgata actggtggta ctggctcatt1140orf1的起始cggcaataag tttgtgcgcatgacattaga taaatataac cctaaaaaga ttattattta1200ttctcgtgat gaaatgaaac agtgggaaat ggcaaaacat ttcaaggacg aaagccgaat1260tcgattcttt attggggatg ttcgtgataa agatcgtttg tatcgtgcgt tggatggtgt1320tgactttgtt gttcacgccg cagcaacaaa aatcgtacct acagcagagt ataatccctt1380cgaatgtgta aaaacaaata tcaatggtgc gatgaatgtg attgatgctt gtatcgataa1440aggtatcgaa cgtgttgttg cactttctac tgataaagca agcagccctg cgaatctgta1500tggtgcaaca aaattagcat ccgataaact 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orf3的起始taaatgaatg tggcaatcat tccagctcgt ggtggtagta aacgtatccc tcgaaaaaat3300attaaaatgt tttgcgggaa accaatgatt gcctggtcga ttaatgccgc tcgaaagagc3360ggcgtgtttg acagaatcat tgtttcgacg gatgatatgg agattgcagc tgtagcaaga3420aaattcggcg ccgaagttcc gtttatgcgg ccagaagaac tttcgaatga ttttactgga3480acaatccctg ttatacggca tgcggctgaa tggcttattt ctcagggaaa taaaataaaa3540tatatttgct gcatttatgc aacggccccc tttattagag atgaagattt aaaactaggt3600ttgaacctta tcaaagcaaa ggggggggat tattgttttt ctgttactac ttattcgtac3660cctattcaaa gagcattaaa aattaatgag aataacgaaa taaccatgtt tgatccgact3720cagtttgaaa tgcgatctca agatcttgtg gacgcttggc atgatgccgg gcaattttat3780tgggggaata ttgatgcatg gataaaagaa aaaccggtat ttaagtcaca ggctatacca3840ttacctttgc ctagagaacg agtgcaagat attgatacgc cggaagattg gcatttcgct3900orf4的起始 orf3的中止gaggtgttat ataggataaa tacaataaaa aatgaagatt gtatttaggg ttgatgcttc3960gctttcaatt ggttcaggac atgtttttcg ttgtctaaat cttgctggtg cattgagaaa4020gaatggtttt gaatgcattt ttcttacaaa ggaacatgca ggaaacttaa ttcaatatat4080aaagacatat 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权利要求
1.一种对鲍氏志贺氏菌7型的O-抗原特异的核苷酸，其特征在于，其是如SEQ ID NO1所示的分离的核苷酸，全长15796个碱基；或者具有一个或多个插入、缺失或取代的碱基，同时保持所述分离的核苷酸功能的SEQ ID NO1的核苷酸。
2.按照权利要求1所述的对鲍氏志贺氏菌7型的O-抗原特异的核苷酸，其特征在于它是由11个基因组成，它们都位于galF基因和gnd基因之间。
3.按照权利要求2所述的对鲍氏志贺氏菌7型的O-抗原特异的核苷酸，其特征在于，所述的基因包括转运酶基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因；聚合酶基因，包括wzy基因或与wzy有相似功能的基因；糖基转移酶基因，包括orf8、orf10、orf11、orf12基因；其中所述的wzx基因是SEQ ID NO1中的6714至7928碱基的核苷酸；orf8基因是SEQ ID NO1中的7936至8877碱基的核苷酸；wzy基因是SEQ ID NO1中的8889至10184碱基的核苷酸；orf10基因是SEQ ID NO1中的10186至11148碱基的核苷酸；orf11基因是SEQ ID NO1中的11355至12272碱基的核苷酸；orf12基因是SEQ ID NO1中的12247至13176碱基的核苷酸；
4.按照权利要求1或2所述的对鲍氏志贺氏菌7型的O-抗原特异的核苷酸，其特征在于，其是源于所述的wzx基因、wzy基因或糖基转移酶基因的orf8、orf10、orf11、orf12基因；或糖合成路径基因中的寡核苷酸；以及它们的混合或它们的重组。
5.按照权利要求4所述的对鲍氏志贺氏菌7型的O-抗原特异的核苷酸，其特征在于，所述的源于wzx基因的寡核苷酸对是SEQ ID NO1中的6782至6799碱基的核苷酸和7449至7466碱基的核苷酸；SEQ ID NO1中的6971至6989碱基的核苷酸和7481至7498碱基的核苷酸；SEQ ID NO1中的7035至7053碱基的核苷酸和7588至7607碱基的核苷酸；源于orf8基因的寡核苷酸对是SEQ ID NO1中的8065至8082碱基的核苷酸和8789至8806碱基的核苷酸；SEQ ID NO1中的8134至8152碱基的核苷酸和8685至8704碱基的核苷酸；SEQ ID NO1中的8198至8215碱基的核苷酸和8459至8476碱基的核苷酸；源于wzy基因的寡核苷酸对是SEQ ID NO1中的9091至9108碱基的核苷酸和9457至9474碱基的核苷酸；SEQ ID NO1中的9357至9376碱基的核苷酸和9704至9721碱基的核苷酸；SEQ ID NO1中的9120至9137碱基的核苷酸和9945至9962碱基的核苷酸；源于orf10基因的寡核苷酸对是SEQ ID NO1中的10271至10288碱基的核苷酸和11060至11077碱基的核苷酸；SEQ ID NO1中的10375至10393碱基的核苷酸和10790至10808碱基的核苷酸；SEQ ID NO1中的10510至10528碱基的核苷酸和11090至11108碱基的核苷酸；源于orf11基因的寡核苷酸对是SEQ ID NO1中的11737至11754碱基的核苷酸和12013至12030碱基的核苷酸；SEQ ID NO1中的11367至11384碱基的核苷酸和12154至12171碱基的核苷酸；SEQ ID NO1中的11482至11598碱基的核苷酸和11839至11856碱基的核苷酸；源于orf12基因的寡核苷酸对是SEQ ID NO1中的12274至12291碱基的核苷酸和13016至13033碱基的核苷酸；SEQ ID NO1中的12489至12506碱基的核苷酸和13101至13120碱基的核苷酸；SEQ ID NO1中的12384至12401碱基的核苷酸和12959至12976碱基的核苷酸。
6.权利要求1所述的对鲍氏志贺氏菌7型的O-抗原特异的核苷酸在检测表达O-抗原的细菌、在诊断中鉴定细菌O-抗原和细菌的其它多糖抗原的应用。
7.权利要求1所述的对鲍氏志贺氏菌7型的O-抗原特异的核苷酸的重组分子，而且通过插入表达可提供表达鲍氏志贺氏菌7型的O-抗原，并成为细菌疫苗。
8.按照权利要求1所述的对鲍氏志贺氏菌7型的O-抗原特异的核苷酸的应用，其特征在于，其作为引物用于PCR、作为探针用于杂交反应与荧光检测、或者用于制造基因芯片或微阵列，检测人体和环境中的细菌。
9.按照权利要求1所述的对鲍氏志贺氏菌7型的O-抗原特异的核苷酸的分离方法，其特征在于，其包括下述步骤(1)提取基因组。在LB培养基中37℃过夜培养志贺氏菌，离心收集细胞，用Tris-HCl(pH8.0)和EDTA重悬细胞，37℃温育20分后加入溶菌酶裂解细菌，加入蛋白酶K和SDS降解蛋白质，再加入RNase去除RNA；然后用等体积酚及等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)抽提去除其中的酶和蛋白，再用等体积的乙醚抽提除去残余的酚；用2倍体积乙醇沉淀DNA，用玻璃丝卷出DNA后用70％乙醇洗DNA，最后将DNA重悬于30ulTE中，基因组DNA通过0.4％的琼脂糖凝胶电泳检测；(2)通过Long PCR扩增鲍氏志贺氏菌7型中的O-抗原基因簇。首先根据经常发现于O-抗原基因簇启动子区的JumpStart序列设计上游引物(#1523-ATT GTG GCT GCA GGG ATC AAA GAA AT)，再根据O-抗原基因簇下游的gnd基因设计下游引物(#1524-TAG TCG CGT GNG CCT GGA TTA AGT TCG C)；用Boehringer Mannheim公司的Expand Long Template PCR方法扩增O-抗原基因簇，PCR反应程序如下在94℃预变性2分；然后94℃变性10秒；60℃退火30秒，68℃延伸15分，这样进行30个循环；最后，在68℃继续延伸7分，得到长度为15796个碱基的PCR产物；合并6管long PCR产物，并用Promega公司的Wizard PCR Preps纯化试剂盒纯化PCR产物；(3)构建O-抗原基因簇文库。用被修改的Novagen DNaseI shot gun法构建O-抗原基因簇文库，反应体系是300ng PCR纯化产物，0.9ul 0.1M MnCl2，1ul 1∶2000稀释的1mg/ml的DNaseI，反应在室温中进行；选择合适的反应时间使酶切后的DNA片段大小集中在1kb-3kb之间，而后加入2ul 0.1M EDTA终止反应，合并4管同样的反应体系，分别用等体积的酚和酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)抽提一次，再用等体积的乙醚抽提两次后，用2.5倍体积的无水乙醇沉淀DNA，并用70％乙醇洗沉淀，最后重悬于18ul水中；随后在此混合物中加入2.5ul dNTP(1mMdCTP，1mMdGTP，1mMdTTP，10mMdATP)，1.25ul100mM DTT和5单位的T4DNA聚合酶，11℃30分，将酶切产物补成平端，75℃终止反应后，加入5单位的Tth DNA聚合酶及其相应的缓冲液并将体系扩大为80ul，使DNA的3’端加dA尾，此混合物经氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提和乙醚抽提后与Promega公司的3×10-3的pGEM-T-Easy载体于16℃连接24小时，总体积为90ul，其中有9ul的10×buffer和25单位的T4DNA连接酶，最后用无水乙醇沉淀连接混合物，70％乙醇洗后溶于30ul水中得到连接产物；用Bio-Rad公司的电转化感受态细胞的制备方法制备感受态大肠杆菌DH5α细胞，取2-3ul连接产物与50ul感受态大肠杆菌DH5α混合后，转到Bio-Rad公司的0.2cm的电击杯中电击，电压为2.5千伏，时间为5.0毫秒-6.0毫秒，电击后立即在杯中加入1ml的SOC培养基使菌复苏，然后将菌涂在含有氨苄青霉素、X-Gal和IPTG的LB固体培养基上37℃过夜培养，次日得到蓝白菌落。将得到的白色菌落即白色克隆转到含有氨苄青霉素的LB固体培养基上培养，同时从每个克隆中提取质粒并用EcoRI酶切鉴定其中的插入片段的大小，得到的白色克隆构成了鲍氏志贺氏菌7型的O-抗原基因簇文库；(4)对文库中的克隆测序。从文库中挑选插入片段在700bp以上的120个克隆由上海生物工程有限公司用ABI377型DNA自动测序仪对克隆中的插入片段单向进行测序，使序列达到80％的覆盖率。剩余20％的序列再根据已得到的序列设计引物，两对引物，如下所示5’-GCATGGGTTACTGTACTAGC-3’和3’-AATGGCATCAATACCCGC-5’及5’-TGGCGGTATTGAGAGAGT-3’和3’-TTACAGGCTACTTCTCTTC-5’，再从鲍氏志贺氏菌7型的基因组DNA中直接PCR并对PCR产物测序，从而获得O-抗原基因簇的所有序列。(5)核苷酸序列的拼接及分析。用英国剑桥MRC(Medical ResearchCouncil)分子生物学实验室出版的Staden package软件包的Pregap4和Gap4软件拼接和编辑所有的序列，从而得到鲍氏志贺氏菌7型的O-抗原基因簇的核苷酸全长序列(见序列列表)。序列的质量主要由两个方面来保证1)对鲍氏志贺氏菌7型的基因组作6个Long PCR反应，然后混合这些产物以产生文库。2)对每个碱基，保证3个以上高质量的覆盖率。在得到鲍氏志贺氏菌7型O-抗原基因簇的核苷酸序列后，用美国国家生物技术信息学中心(TheNational Center for Biotechnology Information，NCBI)的orffinder发现基因，找到13个开放的阅读框，用blast系列软件与GenBank中的基因比较以发现这些开放的阅读框的功能并确定它们是什么基因，再用英国sanger中心的Artemis软件完成基因注释，用Clustral W软件做DNA和蛋白质序列间的精确比对，最后得到鲍氏志贺氏菌7型的O-抗原基因簇的结构，(6)特异基因的筛选。针对鲍氏志贺氏菌7型的O-抗原基因簇中的wzx、wzy、orf8、orf10、orf11、orf12基因设计引物；在每个基因内各设计了三对引物，每对引物分布在相应基因内的不同地方，以确保其特异性；用这些引物以166株大肠杆菌和43株志贺氏菌的基因组为模板进行PCR，在其他组中都没有扩增到任何大小正确的带，即在大多数组中没有得到任何PCR产物带，虽然在少数组中得到PDR产物带，但其大小不符合预期大小，所以wzx、wzy、orf8、orf10、orf11、orf12基因对鲍氏志贺氏菌7型的O-抗原都是高度特异的。
全文摘要
本发明提供一种鲍氏志贺氏菌7型的O－抗原特异的核苷酸，其是鲍氏志贺氏菌7型(Shigella boydii 7)中控制O－抗原合成的基因簇的核苷酸全序列，还包括O－抗原基因簇的结构以及源于鲍氏志贺氏菌7型的O－抗原基因簇中的糖基转移酶基因和寡糖单位处理基因(包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy相似功能的基因)的寡核苷酸，并且包括获得细菌O－抗原基因簇的方法，本发明通过PCR证实它们对鲍氏志贺氏菌7型的O－抗原都有高度的特异性，本发明还公开了用本发明的寡核苷酸检测和鉴定人体及环境中的鲍氏志贺氏菌7型的方法。
文档编号C07H21/00GK1429832SQ0310053
公开日2003年7月16日 申请日期2003年1月20日 优先权日2003年1月20日
发明者王磊, 陶江, 冯露 申请人:南开大学
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