一种富硒蔬菜专用菌肥及其制备方法与流程

一种富硒蔬菜专用菌肥及其制备方法
【技术领域】
1.本发明涉及微生物技术领域，特别涉及一种富硒蔬菜专用菌肥及其制备方法。


背景技术：

2.硒是生物体生命活动所必需的微量元素之一，具有营养和修补心肌、清除体内自由基、延缓衰老、调节人体微循环系统等重要功能。目前，随着人们生活水平的不断提高，人们对健康的追求更加迫切，对富硒食品的需求也越来越多。生物富硒是获取有机硒的有效途径，摄取富含硒的水果蔬菜等食物，是人体获取有机硒的最重要的方式。然而，天然水果蔬菜中硒元素含量较少，大多需要施用硒肥对作物进行强化补给，以生产出富硒农产品。土壤硒的生物有效性受环境中微生物的高度影响，微生物通过自身代谢作用可以实现硒形态、价态的转化，从而提高土壤硒的有效性。
3.目前大部分硒肥是通过在普通肥料中添加亚硒酸盐或富硒矿石制成。该方法虽然成本低廉，操作简单，却存在一些缺陷。硒酸盐和亚硒酸盐的本身毒性较大，如果施用不当，容易对土壤造成污染甚至对人体造成伤害；富硒矿石由于成分复杂，矿石中硒元素的并不容易为植物吸收利用，生物有效性低。因此，迫切需要开发安全可靠、生物有效性高的富硒肥料，对于促进硒肥产业可持续发展，发展功能农业具有重要意义。


技术实现要素：

4.鉴于上述内容，有必要提供一种富硒蔬菜专用菌肥能有效的提高土壤硒的有效性。
5.为达到上述目的，本发明所采用的技术方案是：
6.一种富硒蔬菜专用菌肥，所述菌肥由以下重量份的原料制备而成：粉碎农作物秸秆65～75 份、麸皮10～15份、豆腐渣40～50份、稻谷生物炭5～10份、糖蜜1～5份、复合微生物菌剂 3～5份；
7.所述复合微生物菌剂是由暗黑中华单胞菌(sinomonas atrocyanea)菌株txb1
‑
10冻干粉和反硝化无色杆菌(achromobacter denitrificans)菌株gpb1
‑
5冻干粉，按质量比1.0～1.5：1.0混合获得复合微生物菌剂；
8.所述暗黑中华单胞菌(sinomonas atrocyanea)菌株txb1
‑
10，其保藏编号为cctcc no： m 2020984；反硝化无色杆菌(achromobacter denitrificans)菌株gpb1
‑
5，其保藏编号为cctccno：m 2020344。
9.进一步说明，所述暗黑中华单胞菌(sinomonas atrocyanea)菌株txb1
‑
10中国广西藤县富硒区土壤中分离而得；所述反硝化无色杆菌(achromobacter denitrificans)菌株gpb1
‑
5 中国广西桂平富硒区土壤中分离而得。
10.进一步说明，所述暗黑中华单胞菌(sinomonas atrocyanea)菌株txb1
‑
10冻干粉和反硝化无色杆菌(achromobacter denitrificans)菌株gpb1
‑
5冻干粉是由以下步骤制备得到的：
11.(1)将暗黑中华单胞菌(sinomonas atrocyanea)菌株txb1
‑
10和反硝化无色杆菌 (achromobacter denitrificans)菌株gpb1
‑
5分别在lb培养液中进行规模化发酵培养2～3天，离心后得到菌泥；
12.(2)保护剂与蒸馏水混合得到保护剂溶液，然后与菌泥混匀得到菌泥
‑
保护剂溶液；
13.(3)菌泥
‑
保护剂溶液进行预冻处理，获得冻干预冻菌；
14.(4)然后采用冷冻干燥技术制备得冻干粉菌剂。
15.进一步说明，步骤(2)中，菌泥和保护剂溶液的体积比是3
‑
4:1。
16.进一步说明，所述的保护剂包括以下组分：8
‑
12mg/l脱脂牛奶、5
‑
8mg/l果糖和 0.05
‑
0.1mg/l聚
‑
γ
‑
谷氨酸。
17.本发明还提供一种富硒蔬菜专用菌肥的制备方法，步骤如下：
18.(1)将暗黑中华单胞菌(sinomonas atrocyanea)菌株txb1
‑
10冻干粉和反硝化无色杆菌(achromobacter denitrificans)菌株gpb1
‑
5冻干粉，按质量比1.0～1.5：1.0混合获得复合微生物菌剂；
19.(2)制备过120～150目的粉碎农作物秸秆、豆腐渣、稻谷生物炭、糖蜜混合发酵料，将粉碎农作物秸秆65～75份、麸皮10～15份、豆腐渣40～50份、稻谷生物炭5～10份、糖蜜1～5 份重量份混合发酵；
20.(3)待发酵料降温至50℃以下加入步骤(1)中所述复合微生物菌剂继续发酵，期间每 24～48小时翻堆一次，至发酵物湿度在12％左右，发酵完成。
21.进一步说明，所述步骤(2)的发酵温度为30℃～60℃，发酵时间为15d～20d。
22.与现有技术相比较，本发明具有如下有益效果：
23.本发明的富硒蔬菜专用菌肥能够在不需要额外添加外源硒，对土壤无硒污染风险，施用该富硒蔬菜专用肥，蔬菜硒含量在推荐标准范围内，所生产的富硒蔬菜为天然富硒蔬菜。食用天然富硒蔬菜为安全、有效补硒的途径。在制备复合微生物菌剂时，采用的保护剂组分按照：8
‑
12mg/l脱脂牛奶、5
‑
8mg/l果糖和0.05
‑
0.1mg/l聚
‑
γ
‑
谷氨酸将暗黑中华单胞菌 (sinomonas atrocyanea)菌株txb1
‑
10和反硝化无色杆菌(achromobacter denitrificans)菌株gpb1
‑
5制成冻干粉，能有效提交菌株的存活率和富硒效果。
【附图说明】
24.图1为本技术实施例的暗黑中华单胞菌(sinomonas atrocyanea)菌株txb1
‑
10菌株在平皿上的形态图；
25.图2为本技术实施例的反硝化无色杆菌(achromobacter denitrificans)菌株gpb1
‑
5菌株在平皿上的形态图。
26.【具体实施方式】
27.本说明书中公开的所有特征，或公开的所有方法或过程中的步骤，除了互相排斥的特征和/或步骤以外，均可以以任何方式组合。
28.本说明书(包括任何附加权利要求、摘要)中公开的任一特征，除非特别叙述，每个特征只是一系列等效或类似特征中的一个例子而已。
29.实施例1：
30.本实施例暗黑中华单胞菌(sinomonas atrocyanea)菌株txb1
‑
10；反硝化无色杆菌 (achromobacter denitrificans)菌株gpb1
‑
5的筛选方法：
31.从广西永福(砂页岩红壤，全硒0.567mg/kg)、玉林(砂页岩赤红壤，全硒1.804mg/kg)、桂平(砂页岩赤红壤，全硒1.188mg/kg)、藤县(砂页岩赤红壤，全硒0.580mg/kg)等多个富硒区采集土壤样品，称取10g土样采用加硒液体培养基进行耐硒细菌筛选，利用稀释涂布平板法、平板划线法分离而得，并通过生长曲线确定4株耐硒细菌作为候选的菌株，分别命名为ylb1
‑
6(玉林)、txb1
‑
10(藤县)、txb2
‑
5(藤县)和gpb1
‑
5(桂平)，经16srdna序列分析及系统发育树分析，ylb1
‑
6为bacillus cereus，txb1
‑
10为sinomonasatrocyanea，txb2
‑
5为bacillus thuringiensis，gpb1
‑
5为achromobacter denitrifycans，这些富硒细菌对硒的转化率为55.31％～74.22％，各菌株处理能显著提高土壤可交换态硒含量，对土壤硒起到较强活化作用。在土壤微生物硒强化中具有潜在的应用价值。
32.菌株活化后按5％接种量转接于100ml液体培养基的三角瓶中，在菌株适宜硒浓度、适宜加硒时间及其合适培养时间条件下进行摇床培养。将培养好的菌悬液4 000r/min离心 30min，取上清液经消解反应后用原子荧光光度计测量荧光强度值，由标准曲线可得样液的硒浓度，由硒转化率公式获悉菌株的富硒能力。
33.硒转化率(％)＝(总硒含量
‑
残留无机硒含量)/总硒含量
×
100
34.经富硒试验后，ylb1
‑
6、txb1
‑
10、txb2
‑
5和gpb1
‑
5残留无机硒含量分别为1.547、 1.358、2.681和2.936μg/ml，菌株硒转化率依次为74.22％、66.05％、55.31％和63.30％， ylb1
‑
6与txb1
‑
10、gpb1
‑
5和txb2
‑
5菌株之间的硒转化率差异均达极显著水平。4个耐硒菌富硒能力由大到小排序为：ylb1
‑
6＞txb1
‑
10＞gpb1
‑
5＞txb2
‑
5。
35.详细删选步骤和鉴定方案参照中国专利cn201811201689.9一种高效转化土壤硒的菌株培养方法。
36.所述暗黑中华单胞菌(sinomonas atrocyanea)菌株txb1
‑
10菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学，保藏编号为cctccno：m 2020984，保藏日期为2020年12月28日。
37.所述反硝化无色杆菌(achromobacter denitrificans)菌株gpb1
‑
5菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学，保藏编号为cctccno：m 2020344，保藏日期为2020年07月23日。
38.本发明所述暗黑中华单胞菌(sinomonas atrocyanea)菌株txb1
‑
10菌株在平皿上的形态特征如图1所示，该菌株菌落呈圆形，直径0.8mm—1.2mm，乳白色，表面光滑并突起、湿润，边缘整齐，易挑起；所述反硝化无色杆菌(achromobacter denitrificans)菌株gpb1
‑
5 菌株在平皿上的形态特征如图2所示，该菌株菌落较小，呈圆形，白色，透明，表面光滑、湿润，中间凸起呈半球状，边缘整齐，易挑起。
39.实施例2：
40.暗黑中华单胞菌(sinomonas atrocyanea)菌株txb1
‑
10冻干粉和反硝化无色杆菌 (achromobacter denitrificans)菌株gpb1
‑
5冻干粉是由以下步骤制备得到的：
41.(1)将暗黑中华单胞菌(sinomonas atrocyanea)菌株txb1
‑
10和反硝化无色杆菌 (achromobacter denitrificans)菌株gpb1
‑
5分别在lb培养液中进行规模化发酵培养2～3天，离心后得到菌泥；
42.(2)保护剂与蒸馏水混合得到保护剂溶液，菌泥和保护剂溶液按照体积比是3:1混匀得到菌泥
‑
保护剂溶液；保护剂包括以下组分：8mg/l脱脂牛奶、5mg/l果糖和0.05mg/l聚
‑
γ
‑ꢀ
谷氨酸；
43.(3)菌泥
‑
保护剂溶液进行预冻处理，获得冻干预冻菌；
44.(4)然后采用冷冻干燥技术制备得冻干粉菌剂。
45.lb培养液的配方是：胰蛋白胨10.0g，酵母粉5.0g，氯化钠10.0g，蒸馏水1l，ph7.0
±ꢀ
0.2(灭菌)。
46.实施例3：
47.与实施例2的制备方法基本相同，不同点是：保护剂包括以下组分：10mg/l脱脂牛奶、 6mg/l果糖和0.08mg/l聚
‑
γ
‑
谷氨酸。
48.实施例4：
49.与实施例2的制备方法基本相同，不同点是：保护剂包括以下组分：12mg/l脱脂牛奶、 8mg/l果糖和0.1mg/l聚
‑
γ
‑
谷氨酸。
50.对比例1：
51.与实施例2的制备方法基本相同，不同点是：保护剂包括以下组分：10mg/l脱脂牛奶和 0.08mg/l聚
‑
γ
‑
谷氨酸。
52.对比例2：
53.与实施例2的制备方法基本相同，不同点是：保护剂包括以下组分：10mg/l脱脂牛奶和 6mg/l果糖。
54.对比例3：
55.与实施例2的制备方法基本相同，不同点是：保护剂包括以下组分：6mg/l果糖和0.08mg/l 聚
‑
γ
‑
谷氨酸。
56.本技术人还设计了对照组，对照组为：
57.(1)将暗黑中华单胞菌(sinomonas atrocyanea)菌株txb1
‑
10和反硝化无色杆菌 (achromobacter denitrificans)菌株gpb1
‑
5分别在lb培养液中进行规模化发酵培养2～3天，离心后得到菌泥；
58.(2)菌泥和蒸馏水溶液按照体积比是3:1混匀得到菌泥溶液；
59.(3)菌泥溶液进行预冻处理，获得冻干预冻菌；
60.(4)然后采用冷冻干燥技术制备得冻干粉菌剂。
61.将实施例2、3、4和对比例1、2、3和对照组制备得到的冻干粉进行存活率和富硒能力的测定，测定结果见表1：
62.表1不同冻干粉保护菌株的存活率和富硒能力的记录表
[0063][0064]
由表1可知，对照组的存活率均低于加入有保护剂的冻干粉的菌株，说明了在生产冻干粉的时候加入适合的保护剂是能提高菌株的存活率。而对于txb1
‑
10菌株来说，存活率高低为实施例3＞实施例2＞实施例4＞对比例2＞对比例1＞对比例3；对于gpb1
‑
5菌株来说，存活率高低为实施例3＞实施例4＞实施例2＞对比例3＞对比例1＞对比例2。
[0065]
从硒转化率看，txb1
‑
10菌株来说，硒转化率高低为实施例3＞实施例4＞实施例2＞对比例2＞对比例1＞对比例3；对于gpb1
‑
5菌株来说，硒转化率高低为实施例3＞实施例4 ＞实施例2＞对比例3＞对比例1＞对比例2。
[0066]
实施例5：富硒蔬菜试验：
[0067]
组1方案：一种富硒蔬菜专用菌肥的制备方法，步骤如下：
[0068]
(1)将暗黑中华单胞菌(sinomonas atrocyanea)菌株txb1
‑
10冻干粉和反硝化无色杆菌(achromobacter denitrificans)菌株gpb1
‑
5冻干粉，按质量比1.0：1.0混合获得复合微生物菌剂；
[0069]
(2)制备过120目的粉碎农作物秸秆、豆腐渣、稻谷生物炭、糖蜜混合发酵料，将粉碎农作物秸秆65份、麸皮10份、豆腐渣40份、稻谷生物炭5份、糖蜜1份重量份混合发酵，发酵期间保持发酵温度为30℃，发酵20d；
[0070]
(3)待发酵料降温至50℃以下加入步骤(1)中所述复合微生物菌剂3份继续发酵，期间每24小时翻堆一次，至发酵物湿度在12％左右，发酵完成。
[0071]
组2方案：一种富硒蔬菜专用菌肥的制备方法，步骤如下：
[0072]
(1)将暗黑中华单胞菌(sinomonas atrocyanea)菌株txb1
‑
10冻干粉和反硝化无色杆菌(achromobacter denitrificans)菌株gpb1
‑
5冻干粉，按质量比1.5：1.0混合获得复合微生物菌剂；
[0073]
(2)制备过150目的粉碎农作物秸秆、豆腐渣、稻谷生物炭、糖蜜混合发酵料，将粉碎农作物秸秆75份、麸皮15份、豆腐渣50份、稻谷生物炭10份、糖蜜5份重量份混合发酵，发酵期间保持发酵温度为60℃，发酵15d；
[0074]
(3)待发酵料降温至50℃以下加入步骤(1)中所述复合微生物菌剂5份继续发酵，
期间每48小时翻堆一次，至发酵物湿度在12％左右，发酵完成。
[0075]
组3方案：一种富硒蔬菜专用菌肥的制备方法，步骤如下：
[0076]
(1)将暗黑中华单胞菌(sinomonas atrocyanea)菌株txb1
‑
10冻干粉和反硝化无色杆菌(achromobacter denitrificans)菌株gpb1
‑
5冻干粉，按质量比1.0：1.0混合获得复合微生物菌剂；
[0077]
(2)制备过120～150目的粉碎农作物秸秆、豆腐渣、稻谷生物炭、糖蜜混合发酵料，将粉碎农作物秸秆70份、麸皮12份、豆腐渣45份、稻谷生物炭8份、糖蜜3份重量份混合发酵，发酵期间保持发酵温度为40℃，发酵18d；
[0078]
(3)待发酵料降温至50℃以下加入步骤(1)中所述复合微生物菌剂4份继续发酵，期间每36小时翻堆一次，至发酵物湿度在12％左右，发酵完成。
[0079]
组4方案：与组3方案基本相同，不同点是，微生物菌剂仅仅包括暗黑中华单胞菌 (sinomonas atrocyanea)菌株txb1
‑
10冻干粉。
[0080]
组5方案：与组3方案基本相同，不同点是，微生物菌剂仅仅包括反硝化无色杆菌 (achromobacter denitrificans)菌株gpb1
‑
5冻干粉。
[0081]
对照组1方案：与组3方案基本相同，不同点是，发酵料中没有加入微生物菌剂。
[0082]
对照组2方案：与组3方案基本相同，不同点是，微生物菌剂是由以下步骤制备得到的：
[0083]
(1)将暗黑中华单胞菌(sinomonas atrocyanea)菌株txb1
‑
10和反硝化无色杆菌 (achromobacter denitrificans)菌株gpb1
‑
5分别在lb培养液中进行规模化发酵培养2～3天，离心后得到菌泥；(2)菌泥和蒸馏水溶液按照体积比是3:1混匀得到菌泥溶液；(3)菌泥溶液进行预冻处理，获得冻干预冻菌；(4)然后采用冷冻干燥技术制备得冻干粉菌剂。
[0084]
将上述的对照组1、对照组2、组1、2、3、4、5制备得到的肥料备好待用。选择土壤硒含量为1.10mg/kg；种植作物为甜菜心；进行盆栽种植对比试验。盆栽按每千克土壤施入0.15 g氮(n)、0.1g磷(p2o5)和0.15g钾(k2o)作为基肥，每盆播种10粒菜籽，10d后定苗至6株。待菜籽定苗后按每千克土壤分别施入1.00g对照组1、对照组2、组1、2、3、 4、5制备得到的肥料，并浇灌适量水。甜菜心采收时采样分析其硒含量。
[0085]
表2甜菜心干样硒含量
[0086][0087]
由表2可知，各菌肥处理有效地提高了甜菜心茎叶硒含量。对照组1的甜菜心地上部分样品(干样)的总硒含量为0.2237
±
0.0204mg/kg，施用组4(txb1
‑
10)、组5(gpb1
‑
5) 以及混合菌株菌肥(组1、2、3)的处理，其甜菜心地上部分样品(干样)的总硒含量分别为
0.3673
±
0.0012mg/kg、0.3520
±
0.0046mg/kg、0.3742
±
0.0085mg/kg、0.4314
±
0.0317mg/kg、0.4083
±
0.0071mg/kg，分别比对照1提高64.2％、57.4％、67.3％、92.9％、82.5％；对照组2 的甜菜心地上部分样品(干样)的总硒含量为0.3109
±
0.0107，施用组4(txb1
‑
10)、组5 (gpb1
‑
5)以及混合菌株菌肥(组1、2、3)的处理，其甜菜心地上部分样品(干样)的总硒含量分别比对照2提高18.2％、13.2％、20.3％、38.8％、31.3％。
[0088]
从根部的数据看，采用本方法的菌肥处理也能有效地提高甜菜心根部的硒含量。对照组 1的甜菜心根部样品(干样)的总硒含量为0.4513
±
0.0125mg/kg，施用组4(txb1
‑
10)、组 5(gpb1
‑
5)以及混合菌株菌肥(组1、2、3)的处理，其甜菜心根部样品(干样)的总硒含量分别为0.6449
±
0.0115mg/kg、0.5672
±
0.0479mg/kg、0.6796
±
0.0247mg/kg、0.6869
±
0.0186 mg/kg、0.6544
±
0.0175mg/kg，分别比对照1提高42.9％、25.7％、50.6％、52.2％、45.0％；对照组2的甜菜心根部样品(干样)的总硒含量为0.5393
±
0.0154mg/kg，施用组4(txb1
‑
10)、组5(gpb1
‑
5)以及混合菌株菌肥(组1、2、3)的处理，其甜菜心根部样品(干样)的总硒含量分别比对照2提高19.6％、5.2％、26.0％、27.4％、21.3％。
[0089]
综上，各处理甜菜心富硒效果以组2技术方案最佳。
[0090]
将上述的对照组1、对照组2、组1、2、3、4、5制备得到的肥料备好待用。选择土壤总硒含量0.51mg/kg；种植作物为小白菜；在富硒菜园进行种植对比试验。菜园按常规施基肥，播种。待菜籽出苗后在菜园土壤中分成的6块试验区分别均匀撒施对照组1、对照组2、组1、 2、3、4、5制备得到的肥料150～200kg/亩，并浇灌适量水。小白菜采收时采样分析其硒含量。
[0091]
表3小白菜干样硒含量
[0092][0093]
由表3可知，采用本发明的种植方法得到的小白菜茎叶及根部硒含量均明显增高。对照组1的小白菜茎叶样品(干样)的硒含量为0.0833
±
0.0027mg/kg，根部样品(干样)硒含量为0.0968
±
0.0018mg/kg；施用组1、2、3、4、5菌剂后小白菜茎叶样品(干样)的硒含量分别为0.1838
±
0.0051mg/kg、0.1931
±
0.0037mg/kg、0.1750
±
0.0021mg/kg、0.1662
±
0.0041 mg/kg、0.1506
±
0.0075mg/kg，根部样品(干样)硒含量为0.1320
±
0.0057mg/kg、0.1560
±ꢀ
0.0042mg/kg、0.1475
±
0.0078mg/kg、0.1410
±
0.0057mg/kg、0.1145
±
0.0035mg/kg。采用本发明的种植方法后，组1、2、3、4、5小白菜茎叶硒含量分别为对照1分别提高120.6％、131.8％、 110.0％、99.5％、80.8％，根部则分别为对照1分别提高36.4％、61.2％、52.4％、45.7％、18.9％。
[0094]
对照组2的小白菜茎叶样品(干样)的硒含量为0.1310
±
0.0070mg/kg，根部样品(干样) 硒含量为0.1046
±
0.0013mg/kg；采用本发明的种植方法后，组1、2、3、4、5小白菜茎
叶硒含量分别为对照2分别提高40.3％、47.4％、33.6％、26.9％、15.0％，根部则分别为对照2分别提高26.2％、49.1％、41％、34.8％、9.5％。
[0095]
综上，各处理小白菜富硒效果以组2技术方案最佳。在小白菜茎叶或根部样品(干样) 的硒含量比较上看，对照组1略比对照组2低。对照组2中加入了未处理的菌剂与本方法处理后的菌剂相比较明显在促进小白菜富硒上有所降低，也正好证明了采用本发明的方法与表 1中的结果相同。
[0096]
综上，本方法可以在不施加外源硒的条件下，能明显提高小白菜地上部茎叶硒含量，且施用菌肥的小白菜处理硒含量均符合中华人民共和国行业标准富硒农产品gh/t 1135
‑
2017中蔬菜类(以干重计)硒含量标准(0.10
‑
1.00mg/kg)，可见本发明的菌肥对于定量强化蔬菜硒含量具有较为明显的效果。
[0097]
以组2效果最佳，还做了田间试验。具体方案见下：
[0098]
富硒菜园开展施用本发明的富硒蔬菜专用菌肥的田间试验。土壤总硒含量0.51mg/kg，种植作物为小白菜。菜园按常规施基肥，直播方式播种，适时间苗，种植密度为100株苗/m2左右。待菜籽出苗后，以不施用菌肥作为对照，在菜园土壤中均匀撒施本发明组2方案得到的富硒蔬菜专用菌肥2250～3000kg/ha，并浇灌适量水。试验3次重复，各小区面积为20m2，小白菜采收时采样测量其产量。
[0099]
表4小白菜小区产量
[0100]
处理小区产量(kg)比对照增加(％)对照52.62
±
0.91
‑‑
菌肥处理64.37
±
3.0522.3
[0101]
小区试验结果表明，菌肥处理的产量较对照处理增产22.3％。
[0102]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明的保护范围应以所附权利要求为准。