基于RPA-CRISPRCas12a检测登革病毒电化学传感器、制备方法及其检测方法与流程

本申请涉及登革病毒检测，特别是一种基于rpa-crispr cas12a检测登革病毒电化学传感器、制备方法及其检测方法。

背景技术：

1、登革热由登革病毒（denv）感染引起，登革病毒是单链rna病毒属黄病毒属黄病毒科，分为四个血清型（denv 1-4）。登革热主要分布在热带及亚热带气候地区，每年数以亿计的人感染轻重登革热。登革热主要通过蚊子叮咬传播，还可通过输血、组织或器官移植和母乳喂养传播。

2、登革病毒感染的症状可分为登革热（df）、登革热出血热（dhf）、登革热休克综合征（dss），临床上轻度症状的诊断是非常困难的。

3、目前，血清学检测包括igm抗体的酶联免疫吸附试验（elisa）、病毒分离和分子生物学分析都可用于denv的诊断。然而，denv与基孔肯雅病毒、西尼罗河病毒和流行型b型脑炎病毒等，其他虫媒病毒之间存在抗原的串扰，严重影响了病毒基于elisa诊断的准确性。

4、虽然病毒分离可以作为诊断denv的金标准，但由于培养和鉴定时间长，其在临床诊断中的应用受到了极大的限制。因此，随着分子诊断技术发展迅速，逆转录-聚合酶链反应（rt-pcr）由于其灵敏度高、特异性高和自动化程度，已成为检测denv核酸的常规方法。

5、然而，rt-pcr的临床应用仍受到复杂的设备、复杂的热循环步骤和高假阳性率的限制。因此，开发一种方便、灵敏的检测方法，对denv的早期诊断和治疗具有重要意义。

6、等温核酸扩增技术广泛应用于核酸的敏感生物检测和长双链dna结构的组装，不需要任何酶催化。通过灵活的序列设计，这种技术可以实现不同目的的开发。

7、crispr-cas12a是一种常用的基因组编辑系统，已被用于切割dna链，用于设计核酸检测策略。

8、公开于背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域普通技术人员所公知的现有技术。

技术实现思路

1、本申请针对上述技术问题提供了一种基于rpa-crispr cas12a检测登革病毒电化学传感器、制备方法及其检测方法，该方法提高了检测结果的特异性和灵敏度，降低了操作的复杂程度，可实现低浓度的目标物检测；制备方法简单，性能稳定，电化学检测重复性好，适用于登革病毒感染早期的检测和生物传感器产业化的实际应用；生物传感器的制备工艺成本低，适合工业化生产。

2、本申请提供了一种基于rpa-crispr cas12a检测登革病毒电化学传感器，包括：金沉积的石墨印刷电极；石墨印刷电极上负载探针；

3、所用探针序列如seq id no：9所示；检出限为待测样本中登革病毒浓度在10copies/ul以下。

4、本申请的另一方面还提供了一种如上述基于rpa-crispr cas12a检测登革病毒电化学传感器的制备方法，按以下步骤制得：

5、1）在石墨印刷电极上，采用时间-电流法进行金沉积，沉积时间60~200s，电压设置为-0.2v，干燥，在电极上加入质量浓度为0.1~2%氯金酸溶液，扫描cv曲线进行活化直到得到稳定的伏安曲线，清洗、氮气干燥；

6、2）将稀释后的探针溶液滴加到石墨沉积金电极表面，黑暗中反应，清洗，电极浸入2 mm 6-巯基己醇中4℃过夜，漂洗、干燥得到负载探针的电极，组装得到传感器。

7、优选地，在电极上加入质量浓度为1~2%的氯金酸溶液；沉积时间为120~200s。

8、优选地，步骤2）中：37℃黑暗中反应5h；稀释后的探针溶液中探针的浓度为0.5~5um。

9、优选地，稀释后的探针溶液中探针的浓度为1μm。

10、本申请的另一方面还提供了一种登革病毒的检测方法，包括以下步骤：

11、在cas12a-crrna中孵育待测样本后得到孵育样本，用方波伏安法在如上述的基于rpa-crispr cas12a检测登革病毒电化学传感器中检测孵育样本，获得△i%；

12、当所得△i%%>25.57%时，判断待测样本为阳性结果；当△i%≤为25.57%时，判断待测样本为阴性结果

13、cas12a-crrna中含有rpa引物对；

14、孵育样本时，首先使用rpa引物对扩增待测样本中所含登革病毒dna；所用rpa引物对为：rpa-f1如seq id no：1所示和rpa-f2如seq id no：2所示；

15、crrna序列如seq id no：8所示。

16、优选地，方波伏安法中使用10 mm tris缓冲液作为电解液。

17、优选地，方波伏安法测试条件为：电压范围为- 0.6到- 0.1v，电位增量为4 mv，频率为25赫兹，幅度为25 mv。

18、优选地，cas12a-crrna中cas12a和crrna浓度均为100nml。

19、本申请能产生的有益效果包括：

20、1）本申请所提供的基于rpa-crispr cas12a检测登革病毒电化学传感器，本申请基于等温扩增技术和电化学检测技术，避免了复杂温度变化操作，同时电化学器件更加小型化，所得设备更加简便且易于便携，具备广泛的现场应用潜力，特别适合资源有限的环境。

21、2）本申请所提供的基于rpa-crispr cas12a检测登革病毒电化学传感器，通过将crispr-cas12a与恒温扩增技术结合，主要是为了解决单一恒温扩增技术在实际应用中面临的特异性瓶颈和灵敏度不足的问题，两者结合后，crispr-cas12a系统提高了检测结果特异性，能显著提升检测的准确性和灵敏度。

1.一种基于rpa-crispr cas12a检测登革病毒电化学传感器，其特征在于，包括：金沉积的石墨印刷电极；石墨印刷电极上负载探针；

2.一种如权利要求1所述基于rpa-crispr cas12a检测登革病毒电化学传感器的制备方法，其特征在于，按以下步骤制得：

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在电极上加入质量浓度为1~2%的氯金酸溶液；沉积时间为120~200s。

4.根据权利要求2所述的方法 ，其特征在于，步骤2）中：37℃黑暗中反应5h；稀释后的探针溶液中探针的浓度为0.5~5um。

5.根据权利要求2所述的方法 ，其特征在于，稀释后的探针溶液中探针的浓度为1μm。

6.一种登革病毒的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

7.根据权利要求6所述的登革病毒的检测方法，其特征在于，方波伏安法中使用10 mmtris缓冲液作为电解液。

8.根据权利要求6所述的登革病毒的检测方法，其特征在于，方波伏安法测试条件为：电压范围为- 0.6到- 0.1v，电位增量为4 mv，频率为25赫兹，幅度为25 mv。

9.根据权利要求6所述的登革病毒的检测方法，其特征在于，cas12a-crrna中cas12a和crrna浓度均为100nm。