一种抗稻瘟病基因Pi57TS及其编码蛋白与应用

本发明属于植物基因工程，涉及一种抗稻瘟病基因

pi57ts及其编码蛋白与应用。

背景技术：

1、作物病害是造成农作物产量损失的主要因素之一。在全球人口持续增长背景下，培育抗病作物品种、稳固粮食产能、筑牢粮食安全防线，具有极强的现实价值与战略意义。水稻作为全球最重要的粮食作物之一，供养世界半数以上人口。由稻瘟病菌

magnaporthe

oryzae侵染引发的稻瘟病，是全球各水稻主产区发生范围最广、危害程度最重的真菌性病害。发病田块一般减产10%～30%，发病严重的田块甚至绝收，严重制约水稻产量与品质提升。生产实践表明，选育并推广抗病品种是防控稻瘟病最经济、高效且环境友好的途径，而抗稻瘟病基因的发掘、解析与开发利用，是开展水稻抗病育种的核心基础。

2、国内外科研团队通过大量遗传研究，已从稻种资源中鉴定定位 100 余个抗稻瘟病基因，其中近半数以基因簇或复等位基因形式集中分布于水稻第 6、11、12 号染色体，已有30余个抗性基因完成克隆。已克隆抗病基因中，绝大多数编码核苷酸结合位点-亮氨酸重复（nbs-lrr）结构蛋白，也是植物抗病基因最主要的蛋白类型。但田间稻瘟病菌存在高度遗传变异与生理小种多样性，新致病小种的不断产生易导致栽培品种抗性快速退化丧失，极大限制了现有抗性基因在育种中的持续应用。同时，传统常规杂交育种存在明显技术短板：优良抗病基因常与不良农艺性状基因存在遗传连锁，易产生连锁累赘；多数已报道的抗稻瘟病基因抗谱偏窄，难以兼顾高抗病性与综合农艺性状优良的育种目标，品种抗性易丧失的问题也长期存在。因此，挖掘和扩充稻瘟病抗病种质资源，发掘具有广谱抗病特性的新的抗性基因并应用于品种选育，是当前水稻抗病育种亟待解决的关键技术问题。

3、随着高通量测序技术迭代升级，作物基因组数据持续丰富，大量控制重要农艺性状的功能基因被成功克隆。基于已知抗病基因序列的等位基因挖掘技术，已成为发掘优异功能等位基因的高效手段。稻属包含 23 个物种，含 21 个野生稻种及 2 个栽培稻种；其中与亚洲栽培稻（

oryza sativa l.）同属 aa 基因组的野生近缘种包括普通野生稻、尼瓦拉野生稻、长雄野生稻、短舌野生稻、展颖野生稻、南方野生稻，以及非洲栽培稻，共同构成改良亚洲栽培稻的天然优异基因库。亚洲栽培稻又可分为热带粳稻、温带粳稻、籼稻、

aus及

basmati 五大亚群，遗传变异资源丰富。

4、通过等位基因挖掘，既可解析目标抗病基因的遗传进化规律、明确其与病原菌无毒基因互作的关键功能氨基酸位点，又可获得抗谱分化的优异等位变异；所发掘的抗病基因既可通过基因聚合导入感病水稻材料，定向提升品种综合抗病性，也可通过不同抗谱等位基因融合创制广谱抗性新基因，显著提升抗病育种效率。

5、本研究通过序列分析、基因扩增、遗传转化及转基因植株抗性鉴定，从水稻种质tien som 中鉴定获得

pi57基因的全新功能等位基因，命名为

pi57ts。经现有技术检索，目前尚无

pi57ts抗稻瘟病基因序列及相关应用的公开报道。

技术实现思路

1、针对以上技术问题，本发明提供一种抗稻瘟病基因

pi57ts及其编码蛋白与应用。

2、本发明的技术方案如下：

3、一种抗稻瘟病基因

pi57ts，所述的抗稻瘟病基因

pi57ts的核苷酸序列如seq idno：1所示。

4、本发明还保护所述抗稻瘟病基因

pi57ts cdna编码区序列，其核苷酸序列如seqid no：2所示。

5、本发明还保护抗稻瘟病基因

pi57ts的编码蛋白，所述抗稻瘟病基因

pi57ts编码蛋白的氨基酸序列如seq id no：3所示。

6、本发明还保护所述的抗稻瘟病基因

pi57ts的制备方法，以抗病供体亲本水稻品种tien som的基因组dna为模板，根据

pi57ts基因通过等位基因的序列信息，设计基因的特异性引物，经pcr扩增，扩增结束后经 1% 琼脂糖凝胶电泳检测，回收目的片段并测序验证，得到如seq id no：1所示的抗稻瘟病基因

pi57ts；所述特异性引物的正向引物的碱基序列如seq id no：4所示：ggtgtttagcggaggaaggatcg和反向引物的碱基序列如seq id no：5所示：atcaagagatacaacacgcgttggga。

7、进一步地，所述的pcr 扩增采用 primestar® gxl dna polymerase，扩增体系为25 μl，包括 5×primestar ®gxl buffer 5 μl、dntp mixture（2.5 mm each） 2 μl、正向引物 1 μl、反向引物 1 μl、50 ng/μl模板 dna 1 μl、primestar® gxl dna polymerase0.5 μl，其余用 milli-q灭菌超纯水补足至25 μl；pcr扩增条件为：95℃预变性3 min，98℃10 s，68℃退火延伸 10 min，共30个循环。

8、也可以根据本文公开的核苷酸序列，采用 dna 化学合成方法直接合成得到所述抗稻瘟病基因

pi57ts。

9、本发明还保护一种抗稻瘟病基因

pi57ts cdna编码区序列的制备方法，以抗病供体亲本水稻品种tien som的反转录cdna为模板，采用特异性引物进行pcr扩增，获得seq idno：2所示

pi57ts cdna编码区序列，所述的特异性引物的正向引物如seq id no：4所示，反向引物如seq id no：5所示。

10、本发明还保护所述的抗稻瘟病基因

pi57ts或所述的制备方法制备的抗稻瘟病基因

pi57ts在培育抗稻瘟病水稻品种和稻瘟病抗性检测中的应用。

11、进一步地，将所述的水稻抗稻瘟病基因

pi57ts cdna编码区序列片段转入到感稻瘟病的水稻品种中，获得具有稻瘟病抗性的转基因水稻植株；所述转基因水稻植株可稳定遗传该抗性基因，且对稻瘟病菌株具有广谱抗性。

12、本发明还保护一种利用所述抗稻瘟病基因

pi57ts培育抗稻瘟病水稻的方法，包括以下步骤：

13、s1以抗病供体水稻品种tien som的cdna为模板，使用特异性引物扩增获得

pi57ts基因 cdna编码区序列片段；所述的特异性引物为载体构建专用引物，其正向引物如seq idno：6所示，反向引物如seq id no：7所示；

14、s2构建含抗稻瘟病基因

pi57ts的植物表达载体，采用

asc i 和

bam  hi对载体pu1301进行双酶切，回收线性化载体片段，与扩增并纯化的

pi57ts cdna编码区序列片段进行无缝克隆连接，获得重组植物表达载体；

15、s3采用农杆菌介导的遗传转化法将所述植物表达载体转入感病水稻受体品种，获得转基因植株；

16、s4采用所述的基因特异性引物对转基因植株进行 pcr 鉴定，筛选阳性植株；所述的特异性引物为：正向引物的核苷酸序列如seq id no：8所示：acactacatggcgtgatttcat，反向引物的核苷酸序列如seq id no：9所示：tccactatcggcgagtacttct；

17、s5用阳性抗病植株进行连续自交，获得携带纯合

pi57ts抗性基因、稻瘟病抗性稳定的水稻株系。

18、与现有技术相比，本发明存在以下有益技术效果：

19、1.本发明的抗性基因

pi57ts与该位点的等位基因

pi57对水稻稻瘟病菌具有不同的抗谱特征，是一个新的抗稻瘟病基因，是水稻抗稻瘟病育种的优异抗源。

20、2. 利用本发明所提供的抗稻瘟病基因

pi57ts，可借助遗传转化技术将该基因导入感病水稻品种，定向创制新的抗稻瘟病水稻种质及品种。克隆获得该抗病基因后，可突破传统育种中物种间基因难以交流转育的技术瓶颈；通过基因工程转化手段，不仅能够大幅缩短育种周期，还可规避传统育种因靶标优良基因与不良性状基因连锁累赘所带来的选育难题。本发明经基因转化获得的抗病水稻植株及其后代种子，可通过常规有性杂交方式，实现

pi57ts 抗稻瘟病基因向育种材料的稳定转育与世代遗传。鉴于

pi57ts 具备广谱抗稻瘟病特性，利用该基因选育的水稻新品种抗病性优异，适宜大面积推广种植与产业化应用。