一种磁性ZIF-90-噬菌体复合探针及其制备方法与应用

本发明涉及微生物生物传感快速检测，尤其涉及一种磁性zif-90-噬菌体复合探针及其制备方法与应用。

背景技术：

1、mrsa（耐甲氧西林金黄色葡萄球菌）是医院获得性感染中首要的高致病性多重耐药革兰阳性菌，可引发肺炎、血流感染等危重病症，icu患者感染死亡率超过40%，世界卫生组织已将其列为优先研发新型诊断技术的超级细菌之一。在临床感染评估中，活菌具备活跃的增殖与产毒能力，死菌则释放内毒素诱发炎症反应，仅检测总菌数无法准确评估实际感染风险，因而必须对活菌与死菌进行区分并分别定量，才能为抗感染治疗和预后判断提供可靠依据。

2、目前，主流检测手段均存在明显短板。平板培养法虽为金标准，但耗时长达24～72小时，且仅能检出活菌，无法反映死菌数量，难以满足急诊快速诊断需求；pcr及lamp等温扩增技术灵敏度高，却无法区分活菌与死菌，且核酸扩增易产生气溶胶污染，高度依赖大型实验室设备，不适用于现场即时检测；基于抗体或适配体的单一电化学传感器仅能捕获全部细菌，缺乏活菌特异性识别信号，同样无法区分死活状态；atp生物发光法依赖外源虫荧光素酶，试剂价格昂贵且须全程低温冷链储运，检测成本高，在基层医疗机构难以推广；而传统噬菌体修饰磁珠探针缺乏保护层，噬菌体在室温下约3个月即显著失活，且磁珠表面噬菌体负载量低，导致富集效率和检测灵敏度不足。

3、尽管已有少量双模式传感器的报道，但均未实现富集与检测的一体化电极设计，富集、清洗、检测各步骤分离操作，流程繁琐、耗时较长；同时，现有双模式体系普遍依赖外源标记酶或荧光分子作为信号源，增加了检测成本和操作复杂性，尚未出现利用细菌自身代谢酶产生内源荧光信号的低成本活死菌区分策略。因此，亟需开发一种探针稳定性高、操作便携、检测快速、成本可控，且能现场同步定量mrsa活菌与死菌的集成化传感体系，以突破当前临床和现场检测的技术瓶颈。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种磁性zif-90-噬菌体复合探针及其制备方法与应用。解决现有mrsa检测技术普遍面临噬菌体探针负载量低且常温稳定性差、富集与检测分离导致操作繁琐不便携、单一信号模式无法区分活死菌并易产生假阳性、活菌定量依赖昂贵外源酶试剂、以及复杂基质中富集效率低导致检出限偏高等多重缺陷。

2、为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

3、本发明提供了一种磁性zif-90-噬菌体复合探针，所述复合探针为fe3o4@zif-90@噬菌体核壳结构，包括：

4、氨基化fe3o4磁珠内核；

5、包覆于所述氨基化fe3o4磁珠表面的醛基功能化zif-90多孔壳层；以及

6、通过共价接枝负载于所述zif-90多孔壳层表面的mrsa特异性噬菌体外层。

7、优选的，所述zif-90多孔壳层为醛基功能化的沸石咪唑酯骨架结构，提供醛基位点用于噬菌体的共价接枝，并形成多孔微环境保护层。

8、优选的，所述zif-90壳层厚度60–80 nm，比表面积216 m²/g；包覆噬菌体后探针比表面积168 m²/g，保留介孔通道保证mrsa与噬菌体接触。

9、优选的，所述复合探针具有超顺磁性，单颗探针负载噬菌体数量为40~50株。

10、本发明提供了一种搅拌集成式电化学/荧光双模式传感器，包括：

11、一次性丝网印刷碳电极，所述一次性丝网印刷碳电极的背面设置有纽扣磁铁；

12、磁性固定于所述一次性丝网印刷碳电极工作电极表面的所述的磁性zif-90-噬菌体复合探针；

13、与所述一次性丝网印刷碳电极装配连接的手持式微型搅拌器；

14、与所述一次性丝网印刷碳电极电连接的电化学检测模块；以及

15、荧光检测模块。

16、优选的，所述一次性丝网印刷碳电极兼具搅拌富集功能和电化学传感检测功能，所述纽扣磁铁为直径3mm的钕磁铁，所述复合探针通过磁铁吸附固定于一次性丝网印刷碳电极工作电极表面；所述荧光检测模块为365nm led紫外激发光源及手机可视化荧光成像组件。

17、本发明提供了一种采用所述复合探针或所述传感器的mrsa活菌与死菌同步定量检测方法，包括以下步骤：

18、（1）将磁性zif-90-噬菌体复合探针固定于丝网印刷碳电极工作电极表面，将电极浸入待测样品中，搅拌富集，使复合探针特异性捕获样品中的mrsa；

19、（2）采用电化学阻抗谱法检测电极界面电荷转移阻抗变化，根据阻抗信号定量样品中全部mrsa的总浓度；

20、（3）向电极表面滴加微球菌核酸酶底物mup，孵育使mrsa活菌分泌的微球菌核酸酶催化mup水解生成荧光物质mu，采用365nm紫外光激发并检测荧光强度，根据荧光信号定量样品中mrsa活菌的浓度；

21、（4）将步骤（2）所得总菌浓度减去步骤（3）所得活菌浓度，计算得到样品中mrsa死菌的浓度。

22、优选的，步骤（1）中所述搅拌富集的条件为：搅拌转速400~500rpm，富集时间15~25min；富集后用pbs缓冲液冲洗电极以去除游离杂菌。

23、优选的，步骤（2）中所述电化学阻抗谱法的检测频率范围为10²～105hz，归一化阻抗值与mrsa总菌对数浓度呈线性相关；步骤（3）中所述mup底物的浓度为90~110μm，孵育的时间为13~17min。

24、优选的，步骤（2）电极滴加40μl 0.01 mol/l k3fe(cn)6-pbs检测液，电化学工作站采集10-109 cfu/ml阻抗谱，以nyquist半圆半径rct归一化阻抗值(y=(z-z)/z)拟合标准曲线y=1.670x+4.37 r2=0.991，计算样品总mrsa浓度（图9）。

25、优选的，步骤（3）荧光定量活菌：同一spce滴加40μl含100μm mup的pbs-lb底物液，室温孵育10~20 min；365 nm led照射电极，便携式荧光仪读取荧光强度，标准曲线 y=0.32x- 0.20 r2 = 0.992计算活菌浓度；

26、全程检测总时长≤50 min，检测线性范围10-109 cfu/ml，检出限30 cfu/ml。

27、本发明提供了所述的磁性zif-90-噬菌体复合探针在非诊断目的的血液样本中mrsa分离净化中的应用。

28、本发明提供了所述的搅拌集成式电化学/荧光双模式传感器或所述的方法在非诊断目的的临床icu污水、牛乳或血液样本中mrsa活菌与死菌现场同步快速筛查中的应用。

29、本发明所提供的线两条标准曲曲线检测原理与坐标定义区分 ① 方程 y=1.670x+4.37 为电化学阻抗检测标准曲线：横坐标为log(mrsa) (cfu/ml)，纵坐标为阻抗相对变化值(z-z0)/z0；采用 mrsa 浓度10-109 cfu/ml共 9 个梯度点标定，最小二乘法线性拟合，r²=0.991。

30、② 方程 y=0.32x- 0.20 为荧光检测标准曲线：横坐标同为log(mrsa) (cfu/ml)，纵坐标为荧光相对变化值(f-f0)/f0；采用 mrsa 浓度10-109 cfu/ml共 9 个梯度点标定，最小二乘法线性拟合，r²=0.992。

31、两条标准曲线所有浓度梯度样品均设置 3 份生物学平行 + 3 次仪器技术重复检测，单浓度平行测定次数统一为n=6，且均采用分析化学定量检测通用的最小二乘法一元线性回归进行拟合。

32、本发明公开了一种基于磁性zif-90-噬菌体复合探针（mp探针）的集成式双模式传感器，用于耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（mrsa）活/死菌的现场同步定量检测。该探针采用fe3o4@zif-90@噬菌体核壳结构，其中zif-90多孔醛基骨架不仅大幅提升噬菌体负载量，还能在常温下长效保护其生物活性，彻底解决了传统探针低负载、易失活的痛点。将mp探针磁性固定于丝网印刷碳电极（spce）背面的磁铁上，使同一电极同时具备搅拌富集、电化学阻抗总菌检测和荧光活菌检测三重功能，实现了“富集-检测”一体化现场便携操作。

33、在检测机理上，本发明利用mrsa活菌自身分泌的微球菌核酸酶（mn），该酶可特异性催化mup底物水解产生荧光物质mu，内源荧光强度直接定量活菌；而电化学阻抗信号则用于定量经mp探针捕获的全部mrsa（活菌+死菌），两者差值即为死菌数量。全程无需外源昂贵酶标记物，检出限低至30 cfu/ml，检测总耗时≤50分钟，且双模式信号可交叉验证，有效降低假阳性风险，兼具低成本、高特异性和强抗基质干扰能力。

34、该发明广泛适用于icu污水、牛乳、血液等复杂样本的现场快速筛查，尤其可实现红细胞悬液中mrsa的分离净化，兼顾检测与细菌清除双重功能。mp探针室温下稳定保存超过6个月，显著优于现有试剂储运方案。相比传统培养法周期长、pcr无法区分活死菌、atp发光试剂成本高等行业难题，本发明为临床感染防控、食品安全监测及血液病原菌净化提供了高效、便捷、可靠的解决方案，具有广阔的转化应用前景。

35、与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：

36、其一，在探针材料层面，本发明通过zif-90多孔醛基骨架构建fe3o4@zif-90@噬菌体核壳结构，充分利用zif-90的大比表面积和丰富醛基官能团，为噬菌体提供了大量共价接枝位点，使单位探针的噬菌体负载量得到成倍提升，显著增强了探针对目标菌的捕获能力。同时，zif-90多孔壳层在磁珠表面形成物理微环境屏障，能够有效隔绝外界氧气、湿度及温度波动的干扰，对噬菌体活性起到长期保护作用，使探针在室温条件下的储存稳定性大幅度延长，从根本上解决了传统噬菌体探针因缺乏保护层而负载量低、常温短期即失活的技术问题。

37、其二，在检测装置与操作流程层面，本发明将丝网印刷碳电极直接集成于手持搅拌部件，使同一电极同时发挥搅拌桨与传感界面的双重功能，在富集阶段完成特异性捕获后无需转移即可直接进行电化学检测，省去了独立的富集设备和繁琐的样品转移、清洗步骤，极大地简化了操作流程。整套装置小巧轻便、集成度高，无需外接大型辅助设备，真正突破了实验室固定场景的限制，能够便捷地应用于icu病房、急诊室、野外应急等现场即时检测场景，满足了临床快检对设备便携性和操作简便性的迫切需求。

38、其三，在检测信号与性能层面，本发明利用mrsa活菌自身分泌的微球菌核酸酶催化底物产生内源荧光信号，检测信号直接来源于靶标活菌的代谢活性，完全摆脱了外源昂贵酶标记试剂的依赖，不仅大幅降低了单次检测的试剂成本，也免去了冷链储运环节的额外负担。与此同时，电化学阻抗信号用于定量总菌、内源荧光信号用于特异性定量活菌，二者相互独立、互为印证，能够有效消除单一信号模式易受基质干扰而导致的假阳性或假阴性结果。搅拌富集操作进一步放大了电极界面的目标菌捕获量，使检测灵敏度获得显著提升，全流程检测时间大幅短于传统培养法，真正实现了"快检"与"准检"的统一。

39、其四，在应用广度与功能拓展层面，本发明在牛奶、icu污水、全血及红细胞悬液等多种复杂样本基质中均表现出良好的抗干扰能力和检测可靠性，能够有效应对实际样本中蛋白质、脂质、血细胞及杂菌等干扰成分的影响，具备广泛的样本适应性。值得一提的是，mp探针兼具检测与分离净化双重功能，在完成mrsa定量检测的同时，还可通过磁性分离从血液等样本中高效清除致病菌，且不损伤红细胞等正常有形成分，为临床感染样本的"检-净一体化"处理提供了可行方案。此外，该平台具有高度灵活的可拓展性—仅需替换特异性噬菌体种类，即可便捷地推广至沙门氏菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌等其他重要食源性和临床致病菌的检测，展现出作为通用型快速检测平台的巨大应用潜力和推广价值。