一种用于肺炎克雷伯菌检测的光控RPA-CRISPR/Cas12a检测试剂盒及其应用

本发明涉及分子生物学检测，具体是一种基于光控crispr/cas12a的重组酶聚合酶扩增（rpa）检测试剂盒，应用于肺炎克雷伯菌的快速检测。该试剂盒结合了rpa扩增技术与crispr/cas12a系统，通过紫外光激活笼化crispr rna（crrna），触发cas12a核酸酶的特异性切割反应，从而实现高灵敏度、高特异性的分子检测。该技术具有快速、简便、低成本的特点，可广泛应用于临床现场的病原微生物快速诊断。

背景技术：

1、肺炎克雷伯菌（

klebsiella pneumoniae）是一种重要的医院相关感染致病菌，广泛存在于呼吸道、尿路等部位，能够引起肺炎、尿路感染及其他多种感染。尤其在免疫功能低下患者中，肺炎克雷伯菌的感染容易导致严重的并发症，甚至威胁生命。因此，早期准确诊断肺炎克雷伯菌感染，对于及时治疗和提高患者生存率具有重要意义。

2、目前，肺炎克雷伯菌的检测方法主要包括传统的培养法、pcr技术、免疫层析法等。尽管pcr技术在灵敏度和特异性方面具有显著优势，但其操作复杂、周期长、设备要求高，无法满足临床快速诊断的需求。而免疫层析法虽然操作简便，但灵敏度较低，无法在低浓度菌株或初期感染时提供有效检测。近年来，crispr/cas技术的出现为病原微生物的快速检测提供了新的思路。特别是crispr/cas12a核酸酶，能够通过识别特定的靶标序列并切割报告分子，从而实现高灵敏度的检测。然而，现有的crispr/cas12a检测技术大多依赖于复杂的试剂和操作，且多需要复杂的设备。

3、为了解决上述问题，本发明提供了一种结合rpa扩增技术与光控crispr/cas12a系统的一管式检测方法，能够在较短时间内完成肺炎克雷伯菌的灵敏检测，且操作简便，设备要求低，具有较强的抗干扰能力。通过在crispr/cas12a反应体系中引入光控机制，采用紫外光激活笼化crrna，从而触发cas12a的特异性切割反应，进一步提高了检测的灵敏度与特异性，确保了在复杂临床样本中能够准确识别肺炎克雷伯菌dna。

技术实现思路

1、本发明旨在解决现有肺炎克雷伯菌检测方法存在的以下问题：检测过程耗时、操作复杂、特异性和灵敏度不足以及反应不可控。为此，本发明提供了一种光控一管式rpa-crispr/cas12a检测试剂盒及其检测方法，能够实现肺炎克雷伯菌的快速、精准、可控检测，具有简便、灵敏、高特异性的优点。

2、为实现这一目的，本发明提供了以下技术方案：

3、技术方案

4、1.rpa引物设计：针对肺炎克雷伯菌的特异性rcsa基因设计rpa引物，经筛选确定最优引物对rcsa pair3。该引物对用于扩增rcsa基因的150-300 bp片段，为后续的crispr/cas12a检测提供准确的靶标。

5、2.笼化crrna设计：根据rcsa基因扩增区域的pam位点（tttn）设计crrna1，其序列为uaauuucuacuaaguguagaucucagugacaaugucgguaa（41 nt）。在间隔区嵌入三个6-硝基辣椒酰氧基甲基化胸苷（npom-dt）修饰，构建可控的笼化crrna，其在未光照条件下活性被抑制，紫外光照射后恢复活性。

6、3.光控crispr/cas12a系统：结合crispr/cas12a系统，通过光敏修饰的笼化crrna与cas12a蛋白结合，利用紫外光激活笼化crrna的活性，触发cas12a核酸酶对目标dna的特异性切割。cas12a被激活后对报告分子进行反式切割，使荧光基团与淬灭基团分离并产生荧光信号，用于灵敏检测。

7、4.报告分子：使用fam-bhq1标记的ssdna探针（序列为5'-fam-ttatt-bhq1-3'）作为报告分子，cas12a激活后会切割该探针，释放荧光信号，实时监测反应进程。

8、5.反应体系：本发明提供的反应体系包括rpa扩增缓冲液、crispr反应缓冲液、镁离子溶液、cas12a蛋白、笼化crrna和报告分子等组成，所有成分在一个反应管中完成，简化了操作步骤，方便现场快速检测。

9、本发明的检测试剂盒的核心组分

10、rpa引物对：针对肺炎克雷伯菌

rcsa基因设计的rpa引物对rcsa pair3，包括：

11、正向引物（f）：taaccccaaaagaccttgatgttattc（27 bp）；反向引物（r）：tcacctgcttattatgcgtttgtattt（27 bp）

12、笼化crrna：基于rcsa pair3扩增区域的pam位点（tttn）设计crrna1，序列为uaauuucuacuaaguguagaucucagugacaaugucgguaa（41 nt）。通过在间隔区嵌入三个npom-dt修饰构建可调控的笼化crrna。

13、cas12a蛋白：具备rna介导的dna特异性识别及反式切割单链dna的活性。

14、报告分子：fam-bhq1标记的ssdna探针，序列为5'-fam-ttatt-bhq1-3'（5 nt），在cas12a激活后切割该探针，释放荧光信号。

15、辅助试剂：

16、rpa反应缓冲液：含2×rpa缓冲液和无酶水；crispr反应缓冲液：10×nebuffer；镁离子溶液：用于启动rpa扩增反应；阳性对照：肺炎克雷伯菌标准菌株基因组dna；阴性对照：无酶水。

17、检测方法步骤

18、1.样本dna提取：采用商业化dna提取试剂盒从待检测样本（如临床菌株、标本或环境样本）中提取基因组dna。

19、2.反应体系配制：在pcr管中配制17 μl反应体系，具体组分如下：

20、表1反应体系组分

21、

22、3.样本加样：向反应体系中加入2 μl待检测dna（或阳性/阴性对照dna），轻轻混匀。

23、4.rpa扩增：将反应管置于37℃恒温设备中孵育20分钟，进行rpa等温扩增。

24、5.光激活：采用365 nm紫外光照射反应管30秒，激活笼化crrna的活性。

25、6.荧光检测：继续在37℃下孵育30分钟，通过荧光检测仪实时采集荧光信号（每分钟1次）。

26、7.结果判断：若荧光信号显著增强（荧光阈值≥2710 rfu），则判定为肺炎克雷伯菌阳性；若荧光信号与阴性对照无显著差异，则判定为阴性。

27、反应条件优化

28、本发明通过优化以下反应条件，确保检测性能：

29、rpa扩增优化：引物浓度400nm、扩增时长20分钟时，扩增效率和荧光信号强度最佳。

30、光控crispr/cas12a优化：笼化crrna浓度300nm、cas12a蛋白浓度300nm时，特异性切割效率最高。

31、光激活优化：365nm紫外光照射30秒，完全激活笼化crrna，且无明显非特异性激活。

32、本发明通过结合rpa扩增技术与光控crispr/cas12a系统，不仅提高了检测的灵敏度和特异性，还简化了操作流程，降低了设备要求，具有广泛的临床应用价值，尤其适用于肺炎克雷伯菌的快速诊断。