应用LFD-RPA技术检测葡萄白腐病菌的引物对、探针、试剂盒及其应用
本发明属于生物，具体涉及到一种应用重组酶聚合酶扩增侧流层技术(lfd-rpa)快速检测葡萄白腐病菌的引物对、探针、试剂盒及其应用。
背景技术：
1、葡萄白腐病是世界范围内的葡萄重要病害，每年导致30%-50%的经济损失，严重影响了葡萄产业的健康发展。葡萄白腐病菌（coniella vitis）是中国葡萄白腐病的主要病原菌，可导致果粒变褐软烂，干缩并形成僵果，果面密布灰色小粒点。
2、传统的病害检测速度较慢，且需要pcr仪等高精尖仪器设备，主要适用于实验室内检测，无法满足快速检测的需求，使其应用受到限制。重组酶聚合酶等温扩增技术（recombinase plolymerase amplification，rpa）是一项利用重组酶聚合酶等温扩增的技术，该技术不仅可以摆脱对高值仪器的需求，且反应时间短，通过与荧光基团标记，rpa技术可与侧流层析试纸条(lateral flow dipsticks，lfd)相结合，实现扩增产物的可视化检测，不需复杂仪器设备，适合现场快速检测，可以实现病原物高特异性、高灵敏度的可视化快速检测，具有极为广泛的应用前景。目前尚未有关于应用lfd-rpa技术检测葡萄白腐病菌的报道。
技术实现思路
1、本发明所要解决的技术问题是如何方便、快速、灵敏地检测葡萄白腐病菌，摆脱传统分子检测对专业仪器和专业技术人员的依赖，实现对葡萄白腐病菌的快速检测，弥补现有技术的不足。建立灵敏、高效的lfd-rpa最佳体系的关键是要设计出扩增效率高、特异性强的引物和探针。
2、为解决上述问题，本发明采用如下的技术方案。
3、一种应用lfd-rpa技术检测葡萄白腐病菌的引物对和探针，所述的引物基于葡萄白腐病菌的cal基因序列设计；
4、所述的引物对的上游引物cv-f序列如seq id no:1所示 ，ccacgtcttagcattttcgattatcctgtt（seq id no:1）
5、所述的引物对的下游引物cv-r序列如seq id no:2所示，caggacaaggatggcgatggtaagcaccta（seq id no:2）
6、所述的探针cv-probe序列如seq id no:3所示，ctcgccccttccatgtggcctgtctcgatatggcaatgcgcgtaggttgg（seq id no:3）。
7、在一个实施例中，所述的应用lfd-rpa技术检测葡萄白腐病菌的引物对和探针，所述的引物对的下游引物cv-r的5’端用生物素标记。
8、在一个实施例中，所述的应用lfd-rpa技术检测葡萄白腐病菌的引物对和探针，所述的探针cv-probe的5’端用fam基团标记，其5’端起第33位与第34位碱基中标记thf，其3’端用pho基团标记。
9、本发明的一个方面，本发明公开了一种含有上述所述的引物对和探针的试剂盒。
10、作为一个优选的实施方案，本发明前述试剂盒还包括lfd试纸条。
11、本发明的一个方面，本发明公开了所述的引物对和探针在葡萄白腐病菌检测中的应用。
12、本发明的一个方面，本发明公开了前述的引物和探针在制备用于检测葡萄白腐病菌的产品中的应用。
13、本发明的一个方面，本发明公开了前述的试剂盒在葡萄白腐病菌检测中的应用。
14、本发明的一个方面，本发明公开了前述的试剂盒在葡萄白腐病菌检测中的应用，其应用的方法，包括以下步骤：
15、利用待测样品的研磨液进行lfd-rpa检测；根据lfd试纸条的条带确定待测样品是否含有葡萄白腐病菌。
16、上述所述的试剂盒在葡萄白腐病菌检测中的应用，根据lfd试纸条的条带确定待测样品是否含有葡萄白腐病菌的方法为：如果lfd试纸条出现一条红色条带位于质控区内，一条红色条带位于检测区，则结果为阳性，表明待测样品中含有葡萄白腐病菌；如果lfd试纸条只出现一条红色条带，位于质控区内，则结果为阴性，表明待测样品中不含有葡萄白腐病菌。
17、在一个实施例中，所述lfd-rpa检测的反应体系为：向干粉管中加入29.4 ml adbuffer、12.5μl超纯水、10 μm引物cv-f 2 μl、10μm引物cv-r 2 μl、10 μm探针cv-probe0.6 μl、1 μl dna模板及2.5 μl b buffer。
18、在一个实施例中，所述检测葡萄白腐病菌的方法为在所述lfd-rpa检测体系下42℃恒温扩增20min，将扩增产物稀释20倍，并将侧流层析检测试纸条置于稀释液中，室温放置1min后观察。
19、有益效果
20、相比于现有技术，本发明的有益效果为：
21、本发明依据葡萄白腐病菌的cal基因序列，设计出特异性扩增引物cv-f、引物cv-r和探针cv-probe，建立了基于lfd-rpa的葡萄白腐病菌的检测方法。该方法对该病菌dna的检测灵敏度可达10-5 ng/μl，并且特异性好，与其他近缘种及其他属病原菌均无交叉反应，表明本发明提供的检测方法简捷、快速、灵敏、特异，可从不同的植物病原菌中特异性地检测到参试葡萄白腐病菌。
22、利用本发明的引物和探针进行lfd-rpa检测，扩增时间短、效率高、对设备的要求低，可以摆脱传统分子检测对昂贵仪器和严格反应条件的限制，快速、高效鉴定葡萄白腐病菌，且检测结果肉眼即可观察，适合于基层简易实验室的快速检测，在葡萄白腐病菌的早期诊断、田间诊断和辅助鉴定方面有很高的应用价值。
1.一种应用lfd-rpa技术检测葡萄白腐病菌的引物对和探针，其特征在于：所述的引物对基于葡萄白腐病菌的cal基因序列设计；所述的引物对的上游引物cv-f序列如seq idno:1所示，所述的引物对的下游引物cv-r序列如seq id no:2所示，所述的探针cv-probe序列如seq id no:3所示。
2.根据权利要求1所述的应用lfd-rpa技术检测葡萄白腐病菌的引物对和探针，其特征在于：所述的引物对的下游引物cv-r的5’端用生物素biotin标记。
3.根据权利要求2所述的应用lfd-rpa技术检测葡萄白腐病菌的引物对和探针，其特征在于：所述的探针probe的5’端用羧基荧光素fam基团标记，其5’端起第33位与第34位碱基中标记四氢呋喃thf，其3’端用磷酸基团pho标记。
4.一种含有权利要求1-3任意一项所述的引物对和探针的试剂盒。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒还包括lfd试纸条。
6.一种如权利要求1所述的引物对和探针在葡萄白腐病菌检测中的应用。
7.一种如权利要求1所述的引物对和探针在制备用于检测葡萄白腐病菌的产品中的应用。
8.一种如权利要求4所述的试剂盒在葡萄白腐病菌检测中的应用。
9.根据权利要求8所述的试剂盒在葡萄白腐病菌检测中的应用，其特征在于：
10.根据权利要求9所述的试剂盒在葡萄白腐病菌检测中的应用，其特征在于：