猴痘病毒RPA-CRISPR-Cas12b检测系统及其检测方法与流程

本发明属于猴痘病毒检测的，具体为猴痘病毒rpa-crispr-cas12b检测系统及其检测方法。

背景技术：

1、猴痘病毒（mpxv）感染在全球范围内，尤其是中非和西非等地区性流行国家，持续构成严重的公共卫生威胁。近年来，随着全球人员流动增加，猴痘疫情已呈现跨区域传播趋势，引起国际社会高度关注。mpxv感染可引发发热、皮疹、淋巴结肿大等症状，严重者可并发肺炎、脑炎及继发性细菌感染，导致死亡率上升。尽管目前已有减毒活疫苗被批准用于猴痘的预防，但其适用范围、免疫持久性及对当前流行毒株的保护效力仍存在局限。因此，实现对猴痘病毒感染的早期、快速、准确诊断，对于疫情控制、病例管理和防控策略制定具有重要意义。

2、核酸恒温扩增技术因无需反复热循环、对仪器依赖程度低、反应时间短，在病原体快速检测领域展现出显著优势。目前已有多种恒温扩增技术被广泛应用，其中重组酶聚合酶扩增（rpa）可在37~42℃条件下，短时间内实现对靶标核酸的指数级扩增，适用于资源受限环境下的分子诊断。与此同时，crispr/cas系统凭借其精准的基因识别能力，已成为新兴的高灵敏、高特异检测平台，广泛应用于传染病病原体、耐药基因及肿瘤标志物等检测领域。具体而言，cas12a、cas12b等蛋白在引导rna（grna）识别靶标dna后，可激活其非特异性反式切割活性，高效切割荧光标记的单链dna报告探针，从而实现信号放大与检测结果的快速读出。将rpa与crispr/cas系统联用，有望构建适用于猴痘病毒现场快速检测的高性能分子诊断平台。

3、因此，亟需建立一种兼具高灵敏度、高特异性、操作便捷及适用性广的检测技术，以满足现场快速筛查、基层疾控网络部署及边境口岸检疫等多元场景需求。

技术实现思路

1、针对目前现有技术存在的不足，本发明提供了一种猴痘病毒rpa-crispr-cas12b检测系统及其检测方法。

2、为了实现上述目的，本发明提供以下技术方案：

3、本发明选择猴痘病毒保守区域作为扩增及检测靶标，以猴痘病毒的p3l基因，genbank索引号：op959058.1（45123-45584）作为靶标检测区域，基因的核苷酸序列如seqid no .1所示。

4、第一个方面，本发明提供了一种用于检测猴痘病毒的sgrna探针，所述sgrna包含如seq id no .2所示的特异性靶标序列。

5、进一步地，所述sgrna的核苷酸序列如seq id no .3所示。

6、第二个方面，本发明提供了上述的sgrna探针在制备检测猴痘病毒的试剂盒中的应用。

7、第三个方面，本发明提供了一种猴痘病毒rpa-crispr/cas12b检测系统，包括rpa扩增反应体系和cas12b检测反应体系；所述cas12b检测反应体系包括如seq id no .3所示的sgrna。

8、进一步地，所述rpa扩增反应体系包括序列如seq id no .4~5所示的rpa引物对。

9、第四个方面，本发明提供了一种检测猴痘病毒的试剂盒，包括核苷酸序列如seqid no .3所示的sgrna和序列如seq id no .4-5所示的rpa引物对。

10、进一步地，所述试剂盒还包括aacas12b酶蛋白、10×aacas12b buffer、ssdna 报告分子（fam-ttttttt-bq1）、rnase free ddh2o（无核酸酶水）。

11、本发明还提供了上述试剂盒在制备猴痘病毒检测试剂中的应用。

12、与现有技术相比，本发明的有益效果是：

13、本发明开发了基于rpa和crispr的等温扩增检测方法，通过体系建立和验证，mpx靶标的总体检测时间均缩短至半小时以内，同时对mpx靶标检测技术进行了灵敏度、特异性以及实际样本的验证，结果显示，本发明所开发的检测方法均具有较好的灵敏度和特异性，且实际样本验证结果与金标准检测方法结果一致。mpx靶标详细验证数据如下：确定mpx靶标sgrna用mpx-sgrna-3，结合引物mpx-rpa-f1/r3效果较好，最低检出限可达到1e1copies/t；且满足实际样品现场即时检测的应用需求。

1.一种猴痘病毒rpa-crispr/cas12b检测系统，包括rpa扩增反应体系和cas12b检测反应体系；所述cas12b检测反应体系包括sgrna，其特征在于，所述sgrna的核苷酸序列如seqid no .3所示；所述rpa扩增反应体系包括序列如seq id no .4~5所示的rpa引物对。

2.权利要求1所述猴痘病毒rpa-crispr/cas12b检测系统在制备检测猴痘病毒的试剂盒中的应用。

3.一种检测猴痘病毒的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的sgrna和rpa引物对；所述sgrna的核苷酸序列如seq id no .3所示；所述rpa引物对的序列如seq id no .4~5所示。

4.根据权利要求3所述的一种检测猴痘病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括aacas12b酶蛋白、10×aacas12b buffer、ssdna报告分子、无核酸酶水。