一种基于重编程诱导的分泌组制剂及其应用

本发明涉及生物医药领域，尤其涉及一种基于重编程诱导的分泌组制剂及其应用。

背景技术：

1、皮肤衰老是一个受遗传因素（内源性衰老）和环境因素（外源性衰老，如光老化）共同影响的复杂生物学过程，主要表现为真皮层成纤维细胞数量减少、合成活性下降，以及细胞外基质（ecm）中胶原蛋白和弹性蛋白的系统性流失与断裂。为了从根本上逆转或延缓皮肤衰老，传统的补充性美容手段已逐渐向细胞级别的源头再生工艺转变。

2、在早期阶段，基于成体干细胞（如脐带间充质干细胞、脂肪间充质干细胞）及其分泌物的应用曾在皮肤组织修复中取得了一定的成果。然而，成体干细胞在转化应用中暴露出诸多难以克服的天然缺陷。首先，成体干细胞的增殖能力和分泌活性随着供体年龄的增长、健康状态的波动以及传代次数的增加而发生显著的退化，导致原材料的均一性和质量控制面临极大挑战。其次，由于成体干细胞的组织来源异质性强，其批量化生产时的工艺重现性较差，难以满足制药级别或高端医美制剂对标准化、规模化的核心诉求。

3、诱导性多能干细胞（ipsc）技术的诞生，为彻底解决细胞来源瓶颈提供了全新的范式。利用重编程技术将外周血单个核细胞（pbmc）等体细胞逆转为具备多能性的干细胞，不仅建立了几乎无限的细胞增殖来源，还消除了传统胚胎干细胞转化中所涉及的伦理争议。更重要的是，多能干细胞处于生命起源的最初期，其携带的细胞生物学年龄被彻底清零，具备最旺盛的代谢活性与物质合成潜能。

4、当前，行业内普遍达成共识：直接将活体干细胞输入皮肤具有较高的临床安全风险（如免疫原性潜在触发、非靶向分化或长期潜在的致瘤性）。因此，利用多能干细胞定向分化衍生出的“分泌组（secretome）”或“外泌体（exosomes）”进行无细胞化治疗，成为了更具实用价值和安全性的转化路线。细胞外泌体作为一种由双层脂质膜包裹的纳米级囊泡（粒径通常在30nm-150nm之间），其内部富含特异性的蛋白质、微小rna（mirna）以及多种生长因子，能够直接穿透生物屏障，通过胞吞或膜融合方式精准调控受体细胞的基因表达，激活皮肤固有细胞的内源性修复机制。

5、然而，现有的多能干细胞重编程及衍生外泌体收割工艺在走向工业化和高安全性皮肤给药时，仍存在难以调和的系统性屏障。现行的常规路线通常需要将ipsc经过极其漫长的体外培养并分化为完全成熟的终末皮肤成纤维细胞，再进行分泌物的收集。在这一漫长的分化周期中，由于长期暴露于多种复杂的体外人工诱导环境及化学添加物中，细胞的促再生分泌表型往往会发生自发性的漂移与衰退，导致最终收集到的外泌体在抗衰老、胶原再生等核心活性指标上出现断崖式下跌，失去了多能干细胞源性物质本应具备的高活性优势。

技术实现思路

1、本发明的第一个目的是提供一种分泌组制剂的制备方法，包括以下步骤：

2、s1种子细胞制备：利用对外周血单个核细胞运用sendai-virus技术进行重编程，制备得到诱导性多能干细胞；

3、s2窗口期锁定：将所述诱导性多能干细胞置于仿生软基质上，换用中胚层谱系诱导培养基进行定向不完全分化培养48-96小时；

4、当检测到细胞表面早期成纤维标志物转为阳性且尚未出现终末成纤维细胞形态时，移去所述中胚层谱系诱导培养基并用缓冲液清洗，以终止定向分化程序，使细胞处于不完全分化窗口期；

5、s3氨基酸饥饿诱导：在所述不完全分化窗口期内，吸除步骤s2的残余液体，置换为剥夺了精氨酸和赖氨酸的营养缺陷型基础培养基；

6、向所述营养缺陷型基础培养基中加入10-30μm的尿石素a与5-20μm的麦冬皂苷d进行饥饿诱导，共孵育4-24小时；

7、s4原位洗脱与物理收割：对饥饿诱导结束后的细胞进行原位洗脱；随后换入无血清收集液，并在流体剪切力物理刺激下维持培养24-96小时，收集培养上清液；

8、s5纯化制剂化：将所述培养上清液顺序引入预澄清膜和具有目标粒径截留孔径的超滤体系进行分级精制，富集获得粒径分布在5nm-120nm之间的组分。

9、优选的，所述步骤s2中，所述仿生软基质为脱细胞真皮基质凝胶或甲基丙烯酰化明胶水凝胶；

10、所述中胚层谱系诱导培养基为在无血清基础培养基中添加有中胚层诱导小分子组合的培养基；

11、所述中胚层诱导小分子组合包括：1-5μm的gsk-3β抑制剂chir99021与2-10μm的tgf-β信号通路抑制剂sb431542。

12、优选的，所述步骤s2中，所述早期成纤维标志物为cd73和pdgfr-α；

13、当检测到细胞群体中cd73与pdgfr-α均为阳性且双阳性细胞比例达到75%-85%时，移去所述中胚层谱系诱导培养基以终止分化；

14、定向不完全分化培养的环境为37℃、二氧化碳体积百分比为5.0%，且氧气体积百分比为2%-5%。

15、优选的，所述步骤s3中，所述尿石素a在饥饿诱导期间的最低维持浓度≥10μm，所述麦冬皂苷d在饥饿诱导期间的最低维持浓度≥5μm；

16、所述营养缺陷型基础培养基为去精氨酸且去赖氨酸的dmem基础培养基，或去精氨酸且去赖氨酸mem基础培养基；

17、饥饿诱导的环境为36.5℃、二氧化碳体积百分比为5.0%，且氧气体积百分比为18%-21%。

18、优选的，所述步骤s3中，在孵育结束后进行测定，当细胞内线粒体自噬体的阳性率≥80%视为合格，进行下一个步骤。

19、优选的，所述步骤s4中，原位洗脱的标准为体系内残存的所述尿石素a与麦冬皂苷d的总质量浓度≤10ng/ml。

20、优选的，所述步骤s4中，所述流体剪切力的流体力学参数为0.5-1.2dyn/cm2。

21、优选的，所述步骤s4中，无血清收集液包括以下组分：

22、d-葡萄糖1000-2000mg/l、

23、氯化钠6000-8000mg/l、

24、碳酸氢钠1000-2200mg/l，

25、以及不含钙镁离子的磷酸盐缓冲对；

26、所述无血清收集液的渗透压平衡在290-310mosm/kg，ph值在7.2-7.4；

27、培养环境为37.0℃、二氧化碳体积百分比为5.0%，且氧气体积百分比为18%-21%。

28、优选的，所述步骤s5获得所述组分后，向其中引入复合制剂保护剂进行混匀；以质量百分比计，最终制得的所述分泌组制剂中包含：

29、4%-8%的二糖类非还原糖；

30、0.1%-0.5%的重组人源化蛋白，所述重组人源化蛋白的分子量≥30kda；

31、0.01%-0.05%的非离子型表面活性剂；

32、其余为海藻糖缓冲液或磷酸盐缓冲液。

33、本发明的第二个目的是提供前述制备方法所获得的分泌组制剂在制备皮肤抗衰产品中的应用。

34、本发明分泌组制剂的形成机制来源于细胞发育状态调控、代谢应激重塑以及机械刺激诱导释放三者的协同作用。

35、在分化调控阶段，人外周血单个核细胞经重编程获得诱导性多能干细胞后，被接种于仿生软基质环境中进行培养。仿生软基质能够模拟真皮组织较低刚度的微环境特征，降低细胞受到的异常机械刺激，并有利于细胞维持稳定的发育可塑性。在chir99021与sb431542组成的中胚层谱系诱导体系作用下，诱导性多能干细胞向早期间充质样或成纤维前体方向发生定向转变。当细胞群体中cd73与pdgfr-α双阳性细胞达到预设比例后立即终止诱导程序，使细胞停留于未完全成熟的特定发育阶段。该阶段细胞兼具较高代谢活性、较强分泌能力以及良好的环境响应能力，可作为后续分泌组工程化调控的功能性细胞底物。

36、在应激调控阶段，本发明通过构建精氨酸与赖氨酸双缺失的营养限制环境，对细胞代谢状态进行重塑。氨基酸供应受限后，细胞内营养感知系统发生响应，蛋白合成活动受到抑制，并促进细胞由生长状态向稳态维持状态转变。在此基础上加入尿石素a与麦冬皂苷d进行联合诱导。其中，尿石素a能够促进细胞线粒体质量控制相关通路的激活，提高细胞对受损线粒体的识别与清除能力；麦冬皂苷d则有助于增强细胞在代谢限制条件下的环境适应性，并与尿石素a形成协同调节作用。两者共同作用下，细胞逐步建立以稳态维持和应激响应为特征的代谢状态，从而促进与组织修复、细胞通讯及微环境调节相关活性成分向分泌组中的富集。

37、在收割阶段，首先通过原位洗脱工艺去除培养体系中的外源小分子诱导物，降低后续产品中游离残留物带来的干扰。随后采用无血清收集液维持细胞短期培养。所述无血清收集液不含外源蛋白及游离氨基酸，可显著减少来源于培养体系的背景杂质，同时利用葡萄糖作为主要外源能量来源维持细胞基础生命活动。在此条件下施加低水平流体剪切力刺激，能够模拟组织液微循环环境中的机械信号，激活细胞膜机械敏感响应机制，促进胞吐活动和分泌组释放，提高目标组分的收集效率，同时降低因剧烈机械扰动导致的细胞破裂风险。

38、最终，通过预澄清与切向流超滤分级纯化工艺，获得粒径主要分布于5nm-120nm范围内的目标组分。该工艺能够有效去除细胞碎片、游离蛋白以及低分子杂质，提高所得分泌组制剂的纯度、稳定性和批次一致性，从而为其在皮肤组织修护、屏障维持及抗衰老相关产品中的应用提供稳定的物质基础。

39、本发明具有以下有益效果：

40、（1）化学与背景蛋白残留量低：最终制剂中尿石素a与麦冬皂苷d的残留总质量浓度控制在10ng/ml以下，且制剂中不含外源添加的大分子蛋白与游离氨基酸杂质，符合微针皮肤导入的纯度与安全性要求。

41、（2）目标组分富集度与释放产率提升：工艺实现了细胞内线粒体自噬体阳性率不低于80%的靶向打包，并在0.5-1.2dyn/cm²流体剪切力作用下提升了胞吐作用的收集效率，增加了单位体积培养上清液中分泌组的产出总量。

42、（3）粒径分布窄均且批次一致性高：经分级精制后，目标组分的粒径分布明确限定在5nm-120nm范围内，清除了小于5nm的游离蛋白与大于120nm的细胞碎片，保障了制剂的物理规格统一性。

43、（4）物理结构稳定，抗聚集与复溶性能良好：复合制剂保护剂为5nm-120nm的囊泡结构提供了空间位阻与界面保护，阻断了脂质膜在储存期间的融合与聚集沉淀，维持了终端应用时的粒径分布特征。