一种耐盐基因工程芽孢杆菌、培养方法及其用途与流程

本发明属于属于生物基因工程领域，具体涉及一种耐盐基因工程芽孢杆菌、培养方法及其用途。

背景技术：

1、在土木工程领域，建筑材料（主要包括混凝土、石材等）在其服役周期内长期承受多重物理荷载、化学侵蚀及生物作用的复合影响。这一复杂工况导致材料内部不可避免地产生微裂缝（micro-cracks），此类现象已成为土木工程界普遍存在的典型特征。特别是在潮湿服役环境下，裂缝的存在使得内部钢筋等金属构件暴露于腐蚀介质中，加速电化学腐蚀进程，进而影响结构的长期服役寿命。针对混凝土结构损伤问题，现有技术主要采用人工修缮方式进行处理，主要包括表面封闭修补法、灌注胶注射修补法等。然而，此类传统修复方法存在以下固有局限性。近年来，基于微生物的自修复混凝土技术逐渐受到学术界与产业界的关注。

技术实现思路

1、本发明的目的在于针对现有技术提供一种不仅能在海水环境下生存，且能在潮汐交替导致盐度极速浓缩环境下，依然维持高效的代谢活性、生物量增长以及蛋白分泌能力，从而实现海工混凝土构筑物裂缝的长效、高效自修复的耐盐基因工程芽孢杆菌。

2、本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种耐盐基因工程芽孢杆菌，该芽孢杆菌的宿主菌为枯草芽孢杆菌wb800，且其基因组中整合了耐盐相关基因，该耐盐相关基因选自以下基因组：核苷酸序列为 seq id no:1 的aapal基因；核苷酸序列为 seq idno:2 的ipasr基因；该aapal基因和ipasr基因的组合。通过构建出一种在保留 wb800 极低胞外蛋白酶活性的同时，具备显著增强耐盐能力的工程菌株，解决了高盐胁迫环境下宿主菌生长受限、生物量低下以及分泌能力锐减的需求。通过在基因组中整合aapal和ipasr，重新配置了宿主菌在盐胁迫下的渗透压调节机制与代谢流分配，使其能够维持细胞内稳态。

3、为优化上述技术方案，采取的措施还包括：该耐盐相关基因仅为aapal基因。aapal基因为宿主菌提供基础的耐盐能力，使其在一定浓度的 nacl 环境下仍能保持细胞活力并实现基础代谢。aapal 基因编码的蛋白通过直接调节细胞内外离子的转运或诱导兼容性溶质的积累，降低了高盐环境下细胞膜的渗透压压力，防止细胞脱水。

4、该耐盐相关基因仅为ipasr 基因。ipasr 作为转录调节因子，通过正向调控上调内源性耐盐基因的表达水平，提升菌株对盐分胁迫的响应灵敏度，使其在环境盐度波动时能够快速启动防御机制。

5、该aapal基因和ipasr 基因同时整合在该宿主菌的基因组中。 采用双功能基因协同的方式，使其在高盐浓度环境下依然能够保持高效生长，且避免了单基因过表达带来的代谢负担。ipasr 能够精准调控 aapal 的表达强度，使其在低盐环境下低水平表达以节省能量，在高盐胁迫时迅速激活高水平表达，实现了能量利用的最优化。通过调控因子和功能蛋白构建闭环控制系统，其取得了高耐盐和海工混凝土裂缝的显著修复能力。

6、该耐盐相关基因整合在枯草芽孢杆菌wb800基因组中，且在整合位置形成了由宿主菌wb800基因组序列与pax载体序列组成的特异性接点序列，该接点序列的核苷酸序列为seq idno:13。 利用同源重组机制在基因组特定坐标点创建人工嵌合序列，该序列在自然界及野生型宿主菌中不存在，具有唯一的物理指纹特性。实现了目标基因在基因组中的绝对定点整合，消除了随机插入带来的遗传不稳定性和表达波动，确保了工程菌株在多代培养中的表型一致性，在生产过程中可以采用该特征进行质检，且可以溯源生产路径。

7、本发明还公开了一种上述耐盐基因工程芽孢杆菌的培养方法，其包括以下步骤：1）构建阶段：通过 pcr 扩增目标耐盐相关基因及载体片段，构建整合表达载体；2）整合阶段：将该整合表达载体的目标耐盐相关基因导入枯草芽孢杆菌wb800中，通过同源重组将其定点整合至基因组中，并通过抗性筛选和 pcr 鉴定获得工程菌株；3）培养阶段：将该工程菌株接种于含有nacl的培养基中进行活化与培养。将基因工程的定点改造、异源宿主扩增与环境适应性培养相结合，使菌株在获得遗传改良后迅速进入生理适配状态。 利用无缝克隆技术构建整合表达载体，实现从分子构建到活化培养的全流程覆盖，确保了工程菌从基因设计到工业生产的连续性和一致性。

8、为优化上述技术方案，采取的措施还包括：步骤1）中，该目标耐盐相关基因及载体片段的扩增采用 superpfu pcr mix，扩增条件为：94℃ 2-10 分钟，随后进行 25-35 个扩增循环，最后降温至 4-12℃；该扩增循环的每个单循环控制条件为94℃ 15-60 秒、50-65℃ 20-60 秒、68℃ 1-5 分钟。利用 superpfu 聚合酶的高保真度（具有强校对活性），确保在高温循环中维持序列的正确，避免了在构建之初引入碱基突变。通过具体化操作方法，使本发明技术方案具有确定性和可重复性。

9、步骤1）中构建整合表达载体的具体步骤为：（a）将扩增的目标基因片段与反扩的pax01 载体片段按照 1:1 至 10:1 的摩尔比（例如 6μl : 2μl）与 1-5μl 的 infusioncloning mix 混匀，冰上放置 15-60 分钟；（b）将组装产物转化至大肠杆菌 dh5α 感受态细胞中，并在含有 50-200 μg/ml 氨苄青霉素（amp）的平板上进行筛选；（c）通过挑取单克隆，利用 pax01-f 和 pax01-r 引物进行菌落 pcr 鉴定，获得正确的整合表达载体。利用in-fusion 技术通过末端同源重叠实现片段的高效组装，实现了高效、精准的无缝克隆，防止易出现的序列缺失或方向错误问题。

10、步骤2）中制备 wb800 转化感受态细胞的步骤为：（a）将 wb800 培养至 od600 为0.6-1.2，离心收集菌体；（b）使用由 0.1-1.0m 山梨醇、0.1-1.0m 甘露醇和 5-20% 葡萄糖组成的电转培养基对菌体进行漂洗 2-6 次；（c）将洗涤后的菌体吹悬于电转培养基中。通过高浓度的山梨醇和甘露醇营造高渗透压环境，使细胞膜处于稳定状态，在电击时能更有效地允许 dna 进入。提升了 wb800 对大片段 dna 的电转化效率并提高芽孢杆菌转化率。

11、步骤2）中载体导入 wb800 的电击参数为 1.5-3.0kv，电击 1-3 次，随后立即加入由 0.1-1.0m 山梨醇和 0.1-1.0m 甘露醇组成的 rm 培养基中复苏 1-6 小时。2.0kv的电压能够有效打破细胞膜电位，而 rm 培养基的渗透压缓冲作用可减轻电击后的细胞损伤。在保证细胞存活率的前提下，最大化 dna 的导入效率，并确保菌株在复苏阶段迅速恢复代谢活性。

12、步骤2）中通过涂布红霉素（emr）平板，并利用 pax01-f 和 pax01-r2 引物进行菌落 pcr 鉴定，筛选出目标基因定点整合的工程菌株。利用 红霉素（emr）进行初步筛选，再通过特异性接点引物验证同源重组的正确性。双重筛选（抗性筛选 + 接点鉴定）确保最终获得的菌株不仅携带目标基因，且基因精准整合在基因组特定位置。

13、步骤3）中工程菌株的活化方法为：挑取单克隆接种于含有 1-100 g/l nacl 及1-50 μg/ml emr 的 lb 液体培养基中活化。通过低浓度抗生素压力维持基因组稳定性，通过nacl 预处理降低后续高盐诱导时的应激冲击。确保工程菌在活化过程中不丢失整合基因，并使其提前适应中低盐浓度环境。

14、步骤3）中，该工程菌株的耐盐性能通过添加浓度为 0.1%-10% 的木糖进行诱导激活。木糖作为诱导剂激活载体上的特定启动子，从而触发 aapal 和 ipasr 的转录表达，启动耐盐响应机制。实现了对耐盐相关基因表达的精准开关控制，显著提升了菌株在高盐环境下的生物量和生存能力。

15、步骤3）中，培养温度为 25-42℃，且接种量按 1:1000 至 1:10 的比例转接。该培养基的 ph 值控制在 6.0-8.5 范围内。菌株的长期保存方法为将 1ml 过夜培养的菌液加入终浓度为 5-30% 的甘油中混匀，并在 -80℃ 下保存。该培养基为含有 5-20 g/l 蛋白胨、2.5-10 g/l 酵母提取物和 1-100 g/l nacl 的 lb 培养基。

16、该耐盐相关基因由seq id no: 4、seq id no: 5、seq id no: 6驱动表达；和/或，该耐盐相关基因由seq id no: 7、seq id no: 8、seq id no: 9驱动表达。

17、本发明还公开了上述耐盐基因工程芽孢杆菌用于修复混凝土裂缝的用途。

18、本发明通过上述技术手段，实现了以下的技术效果：

19、（1）构建了高稳定性、可溯源的定点整合体系： 通过利用 pax 载体将目标基因精准整合至 wb800 基因组的 amye 和 laca 位点，避免了随机插入带来的遗传不稳定性和表达波动。通过创建唯一的“宿主-载体”接点序列（如 seq id no: 15），实现了对工程菌株的绝对物理定位和生产路径的精准溯源，确保了工业化生产过程中菌株表型的高度一致性。

20、（2）实现了由“静态耐盐”向“动态调控”的质变： 实验证明，单一导入 aapal 基因仅能提供基础耐盐力，在长期高盐胁迫下易出现代谢耗竭；而通过多位点协同整合，构建了动态调控机制。ipasr 在感知到环境盐度增加后能迅速激活 aapal 的表达，使菌株能够在12% nacl 的极端环境下依然保持高水平的生长和极高的存活率，彻底解决了单基因方案在极端环境下生长停滞的瓶颈。

21、（3）极大地提升了目的蛋白的分泌效率与稳定性： 通过双基因协同作用与 hs-sim 协同诱导培养基的配合，工程菌在极高盐环境下的目的蛋白分泌量（112.4 mg/l）较单一基因方案提升了 5 倍以上。这证明了本方案在维持宿主低蛋白酶活性的同时，极大地增强了蛋白质的合成与分泌通量，为高盐环境下的工业蛋白生产提供了高效平台。

22、（4）实现了海工混凝土裂缝的长效自修复突破： 在模拟海工混凝土的自修复实验中，本发明的双基因协同系在 90 天后的修复率远高于单基因 aapal 系和单基因 ipasr系。结果显示，本发明方案将自修复效果从“短期有效、随后失效”转化为“随时间递增、长效稳定”，证明了该菌株在实际工程应用中具备极强的环境适应力与矿化修复能力。

23、（5）优化了极端环境下的活化与表达工艺： 通过引入木寡糖 (xos) 缓释诱导、外渗蛋白及甘氨酸甜菜碱渗透压协同增强剂，构建了 hs-sim 培养体系。该体系有效地降低了高盐诱导初期的细胞应激，使工程菌在 12% nacl 的极端压力下依然能够实现生物量的爆发式增长，为工程菌的工业化量产提供了可靠的工艺支撑。