利用澳洲坚果废弃物作为基质促进桑黄增加Hispidin的培养方法

本申请涉及微生物发酵，特别是涉及一种利用澳洲坚果废弃物作为基质促进桑黄增加hispidin的培养方法。

背景技术：

1、澳洲坚果作为一种广泛种植的经济作物，在种植和收获过程中产生大量修剪枝条、果皮、果壳等废弃物。目前这些废弃物主要用于制作肥料或生物基质燃料，利用效率低下，不仅造成资源浪费，还可能引发环境问题。

2、hispidin（牛奶树碱）是一种具有广泛生物活性的苯乙烯基吡喃酮类化合物，存在于桑黄等真菌中，具有细胞毒性、降血糖、抗菌抗炎、抗肥胖、抗病毒及神经保护等特性，尤其在抗肿瘤领域展现出良好应用前景。hispidin 的合成途径已被部分阐明，其前体为咖啡酸，而桑黄中木质素降解相关酶（如漆酶、多酚氧化酶）可将木质素分解为咖啡酸，进而促进hispidin 合成。

3、同时，现有 hispidin 生产主要依赖桑黄传统培养方式，存在培养基成本高、hispidin 产量低等问题，限制了其规模化应用。因此，研究一种低成本、高效率的hispidin 生产方法，同时实现澳洲坚果废弃物的资源化利用，具有重要的现实意义。

技术实现思路

1、本发明要解决的技术问题是针对现有的不足，提出一种利用澳洲坚果废弃物作为基质促进桑黄增加hispidin的培养方法，通过澳洲坚果的废弃物作为培养基，从而促进废弃物的利用，增加桑黄中hispidin的含量，并且成本低、易于实现。

2、为解决上述技术问题，本发明提出一种利用澳洲坚果废弃物作为基质促进桑黄增加hispidin的培养方法，技术方案如下：

3、本利用澳洲坚果废弃物作为基质促进桑黄增加hispidin的培养方法，将澳洲坚果废弃物制成固体培养基培养桑黄，具体方法包括：

4、（1）菌丝体培养：当my 固体培养基的冷却至45-60℃时，在培养基一次性添加含60-120ppm卡拉霉素和60-120ppm氨苄青霉素的10-30μl混合溶液，充分混匀后倒平板，待凝固。在无菌环境下，在桑黄菌包上喷洒10-20ml的75%酒精静置30-40min进行消毒，并用消毒过的工具挑取0.2-0.5cm菌丝，接种至60-90mm my 固体培养基中，在25-30℃暗培养 8-12天，长出黄色菌丝体，备用。

5、（2）液体菌种制备：取步骤（1）培养的菌丝体，使用破碎10000-15000r/min的转速的粉碎机粉碎30-60s，将粉碎后的菌丝体，按菌丝体与液体培养基的体积比为1:25，接种至mygmk 液体培养基中，在25-30℃下摇床暗培养 8-12 天，一次性添加100μl浓度为10000ppm的氮杂胞苷母液（终浓度为10ppm）后继续在25-30℃培养3- 6天，制得液体菌种。期间，摇床为不间断旋，其频率为100-180rpm。

6、（3）固体培养基制备：将无霉变、无病虫害的澳洲坚果废弃物清洗后，在在50-80℃的温度下干燥1-4h或在自然条件下干燥4-6天后粉碎至20-40目，制得澳洲坚果废弃物粉末。

7、按2：2:3的比例分别取澳洲坚果废弃物粉末、大米粉粉末、 nmk 液体，混合均匀，在100-140 ℃的温度下灭菌15-30 min，制得固体培养基。

8、（4）发酵培养：将步骤（2）的液体菌种接种至步骤（3）的固体培养基，液体菌种与固体培养基的比例为1：25，25-30℃暗培养 23-28 天，收集菌丝体提取粗提取物，根据常规检测方法检测hispidin含量。

9、hispidin的检测方法可采取色谱类方法、光谱类方法和生物检测法，比如高效液相色谱法、超高效液相色谱、薄层色谱扫描法、酶联免疫吸附测定法和物理与化学常数测定等。本方法中发酵物提取流程、化合物检测方法、化合物鉴定方法是常规方法，仅根据化合物特征进行洗脱机优化。

10、所述my固体培养基为本领域常规营养培养基，其主要成分包括麦芽提取物、酵母提取物、琼脂和蒸馏水。

11、所述的mygmk 液体培养基制备方法：按6-9:10-25:0.1-1：1-2:1-2的比例取麦芽浸粉肉汤、甘露醇、硫酸铵、硫酸镁和磷酸二氢钾，加纯净水定容1l，混合均匀，在100-140℃的温度下灭菌15-30 min。此液体培养基是根据其主要成名的首字母进行命名。

12、所述的nmk 溶剂的制备方法：按0.1-1：1-2：1-2的比例取硫酸铵、硫酸镁、磷酸二氢钾，加纯净水定容1l，混合均匀，在100-140 ℃的温度下灭菌15-30 min。此液体培养基是根据其主要成名的首字母进行命名。

13、所述的澳洲坚果废弃物可采用为无霉变、无病虫害的澳洲坚果树的修剪枝条、果皮或果壳中的一种或两两混合组合或三种混合组合。

14、当澳洲坚果废弃物由澳洲坚果树修剪枝条和果皮混合时，其比例为3-4：1-2；当澳洲坚果废弃物由澳洲坚果树修剪枝条和果壳混合时，其比例为3-4：1-2；当澳洲坚果废弃物由果皮和果壳混合时，其比例为1:1；当澳洲坚果废弃物由澳洲坚果树修剪枝条、果皮和果壳混合时，其比例为6-8:1-2:1-2。

15、本发明培育中的所使用的各物质的重量比和各工艺参数均可根据实际需要具体确定。

16、本发明首次将澳洲坚果种植过程中的修剪枝条、果皮、果壳等废弃物作为桑黄培养基质，解决了传统废弃物利用效率低（如肥料或燃料）的问题，实现了农业废弃物的高值化转化。同时，本培养方法，简单易行，原料环保、易取，成本低廉。

1.一种利用澳洲坚果废弃物作为基质促进桑黄增加hispidin的培养方法，其特征在于：将澳洲坚果废弃物制成固体培养基培养桑黄，具体方法包括：

2.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于：所述步骤（3）中，澳洲坚果废弃物为无霉变、无病虫害的澳洲坚果树修剪枝条、果皮或果壳中的一种或两种混合组合或三种混合组合。

3.根据权利要求2所述的培养方法，其特征在于：所述澳洲坚果废弃物混合组合为比例3-4：1-2的澳洲坚果树修剪枝条和果皮或比例3-4：1-2的澳洲坚果树修剪枝条和果壳或比例1:1果皮和果壳的或6-8:1-2:1-2的澳洲坚果树修剪枝条、果皮和果壳。

4.根据权利要求1-3任一项权利要求所述的培养方法，其特征在于：所述澳洲坚果废弃物为干燥的澳洲坚果废弃物，其含水率为10-20%。

5.根据权利要求1-3任一项权利要求所述的培养方法，其特征在于：所述澳洲坚果废弃物在50-80℃的温度下干燥1-4h或在自然条件下干燥4-6天后粉碎至20-40目。

6.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于：所述步骤（1）中，在桑黄菌包上喷洒10-20ml的75%酒精静置30-40min，挑选0.2-0.5cm的菌丝接种至60-90mm的my 固体培养基。

7.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于：所述步骤（2）中，按6-9:10-25:0.1-1：1-2:1-2的比例取麦芽浸粉肉汤、甘露醇、硫酸铵、硫酸镁和磷酸二氢钾，加纯净水定容1l，混合均匀，制得mygmk 液体培养基；将菌丝体用10000-15000r/min的转速的粉碎机粉碎30-60s；氮杂胞苷的浓度为10ppm。

8.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于：所述步骤（3）中，按0.1-1：1-2：1-2的比例取硫酸铵、硫酸镁、磷酸二氢钾，加纯净水定容1l，混合均匀制得nmk 溶剂。

9.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于：所述my 固体培养基、mygmk 液体培养基、 nmk 溶剂和固体培养基均在100-140 ℃的温度下灭菌15-30 min。