一种用于抑制革兰阴性菌生长的培养基及其制备方法与流程

本发明涉及生物，尤其涉及a01g18/20领域，具体地说，涉及一种用于抑制革兰阴性菌生长的培养基及其制备方法。

背景技术：

1、培养基通常包括维持微生物营养和促使微生物增殖的基础营养物质，同时也为微生物生长和繁殖提供适宜生存环境。常见的培养基可以分成多种类型，包括自然培养基、合成培养基、半合成培养基、固体培养基、液体培养基、半固体培养基、筛选培养基等。不同类型的培养基用于不同种类的微生物基本生长需求。

2、在培养基中添加抑菌剂可以用来抑制不需要的微生物生长，确保目标微生物有更加适宜的生长环境。抗生素是常用的抑菌剂之一，它们被分为多个类别，如β-内酰胺类、氨基糖苷类、大环内酯类等。这些抗生素通过抑制蛋白质合成等方式发挥作用，对不同类型的细菌有不同的抑制效果。

3、革兰阴性杆菌是一类细菌，通常可以分为发酵菌和非发酵菌两大类，发酵菌主要以肠道杆菌为主，其中包括大肠埃希菌、志贺菌、沙门菌、肺炎克雷伯菌等，可引起肠道内或肠道外感染，可能会出现腹痛、腹泻等症状；非发酵菌包括铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌、嗜血杆菌等，主要会引起呼吸道、泌尿道、血液、皮肤软组织等部位的感染。

4、临床上在疑似感染由革兰阳性菌（如葡萄球菌、链球菌或肠球菌）引起，但样本中可能存在大量革兰阴性菌干扰时，可通过使用选择性培养基可以抑制革兰阴性菌生长，从而突出目标革兰阳性菌的分离。另外当样本来源易受革兰阴性菌污染时：如尿液、伤口分泌物等样本，可能混有肠道来源的革兰阴性菌（如大肠杆菌）。通过抑制革兰阴性菌，可以避免假阳性结果，更可靠地鉴定致病的革兰阳性菌。

5、临床中，常有复配抗生素用来治疗细菌感染的症状。如现有技术cn202080060861.2公开了一种用于治疗细菌感染的β-内酰胺抗生素和阿维巴坦衍生物的口服施用组合，但是将复配抗生素用来制备抑制革兰阴性菌的培养基，精准筛选目标菌种的相关报道较少。

技术实现思路

1、为了解决上述技术问题，本发明第一方面提供了一种用于抑制革兰阴性菌生长的培养基，原料包括：氮源、无机盐、碳源、凝固剂、抑菌药物、动物血液、水。

2、氮源

3、优选的，所述的氮源包括无机氮源和/或有机氮源。

4、优选的，所述的无机氮源包括：铵盐（nh4+）、硝酸盐(no3-)和氨水(nh3·h2o)中的一种或多种。

5、优选的，所述的有机氮源包括：酵母粉、牛肉膏、蛋白胨、氨基酸、蛋白质水解产物中的一种或多种。

6、进一步优选的，所述的氮源包括蛋白胨。

7、更优选的，所述的蛋白胨包括胰蛋白胨和特殊蛋白胨。

8、氮源在培养基中能提供微生物生长和代谢所必需的氮元素。本发明优选胰蛋白胨和特殊蛋白胨复配作为氮源，二者均富含维生素和生长因子，可以为微生物提供必需的氮源和氨基酸，维持微生物的生长和繁殖。

9、无机盐

10、无机盐在培养基中起着至关重要的作用，可以提供微生物生长和代谢所需的微量元素，维持细胞的渗透压，以及为细胞提供一个稳定的外部环境。本发明不对无机盐做出进一步限定，凡是可以为微生物提供必要的元素均可，包括但不限于氯化钠、氯化钾、氯化镁、磷酸二氢钾、硫酸镁、硫酸亚铁、碳酸钙等；本发明中优选无机盐为氯化钠。

11、碳源

12、优选的，所述的碳源包括：糖类、醇类、有机酸；本发明中碳源为糖类；糖类包括：葡萄糖、蔗糖、果糖、麦芽糖、淀粉中的一种或多种。

13、更优选的，所述的淀粉包括：玉米淀粉、红薯淀粉、土豆淀粉、小麦淀粉、绿豆淀粉、木薯淀粉、豌豆淀粉中的一种。

14、培养基中的碳源对微生物的生长和代谢过程起到至关重要的作用；碳源提供了微生物细胞生长所需的能量和碳，对微生物的生长速率和生理特性有决定性的作用。

15、凝固剂

16、优选的，所述的凝固剂包括琼脂粉和/或蛋白胨。

17、进一步优选的，所述的凝固剂为琼脂粉。

18、琼脂粉可是使本发明所述的培养基能够在高温下具有较高的稳定，不会因温度变化而改变培养基的形态，保证了微生物培养实验的准确性；此外，琼脂粉培养基的多孔性质使得它可用于测量微生物的运动性和迁移性，可以更加便捷的观察革兰阴性菌的抑制生长情况。

19、抑菌药物

20、优选的，所述的抑菌药物包括氨曲南和/或阿维巴坦。

21、进一步优选的，所述的抑菌药物包括氨曲南和阿维巴坦。

22、更优选的，所述的氨曲南和阿维巴坦的质量比为（8-64）：（1-8）。

23、氨曲南属于单环β-内酰胺类抗生素药物，其抗菌作用主要是通过抑制细菌细胞壁的合成，从而达到杀菌的目的。氨曲南对革兰阴性菌，如铜绿假单胞菌、大肠埃希菌等，具有较强的抗菌活性；氨曲南对于革兰阳性菌这种耐药菌种的抑制性相对较差。但是本发明人同时发现，部分革兰阴性菌能够分泌β-内酰胺酶，也均有一定的抗药性，因此氨曲南对于能够分泌β-内酰胺酶的耐药革兰阴性菌抑制效果相对较差。

24、阿维巴坦是一种β-内酰胺酶抑制剂，阿维巴坦本身对革兰阴性菌没有抗生作用，但可以对革兰阴性菌产生的各种耐药酶等产生抑制作用，可以抑制那些产酶的革兰阴性耐药菌，起到对革兰阴性菌的进一步抑制作用。

25、本发明人在实际的研发过程中发现，当使用氨曲南和阿维巴坦复配，尤其是当氨曲南和阿维巴坦在本培养基中质量比为（8-64）：（1-8）时，氨曲南能够提高阿维巴坦抑制革兰阴性菌分泌β-内酰胺酶的作用，从而使培养基起到更好的抑制革兰阴性菌的作用，二者复配可以最终将大部分的革兰阴性菌（常规阴性菌+耐药阴性菌）全部抑制，同时又不影响目标培养菌（革兰阳性菌）的生长，从而使本培养基起到定向筛选微生物的作用。

26、动物血液

27、优选的，所述的动物血液包括羊血和/或马血。

28、动物血液中含有水、无机盐、维生素、糖类、脂肪、氨基酸等，能够为体外培养的微生物提供必要的营养。尽管这些营养物质的含量在动物血液中含量相对较少，但它们对于微生物的生长和代谢至关重要。

29、优选的，所述的培养基中，每1l培养基包括：特殊蛋白胨15~20g、胰蛋白胨5~10g、氯化钠5g、玉米淀粉1~3g、琼脂粉10~15g、氨曲南8~64mg、阿维巴坦1~8mg、动物血液50~70ml、以及余量的水。

30、本发明第二方面提供了一种用于抑制革兰阴性菌生长的培养基的制备方法，包括：

31、s1、将氮源、无机盐、碳源、凝固剂、抑菌药物和水按比例加入到烧瓶中；

32、s2、将烧瓶置于高压灭菌锅中，高温灭菌；

33、s3、将培养基冷却，加入动物血液并搅拌均匀；

34、s4、立即将搅拌均匀的培养基分装倒入培养皿中冷却凝固，即得。

35、优选的，所述的s2步骤中高温灭菌的温度为110-135℃，高温灭菌的时间为10-20min。

36、优选的，所述的s3步骤中冷却温度为50-65℃。

37、有益效果

38、（一）本发明提供的培养基可以有效地抑制革兰阴性菌的生长，相较于其他常见的培养基有更好的抑菌作用。

39、（二）本发明提供的培养基对于其他的非革兰阴性菌菌种抑制作用不明显，可以实现特定混合菌种的定向筛选。

40、（三）本发明中选择的抑菌药物包括氨曲南和阿维巴坦，氨曲南能够提高阿维巴坦抑制革兰阴性菌分泌β-内酰胺酶的作用，从而使培养基起到更好的抑制革兰阴性菌的作用，二者复配可以最终将大部分的革兰阴性菌（常规阴性菌+耐药阴性菌）全部抑制，同时又不影响目标培养菌（革兰阳性菌）的生长，从而使本培养基起到定向筛选微生物的作用。

41、（四）本发明中选择特定的碳源、氮源、凝固剂、无机盐，可以保证微生物的生长和繁殖均有适宜的生存环境。

42、（五）本发明中培养基的原料来源较广、成本较低，并且制备方法较为简单，有望实现规模级量产，预计能产生可观的市场收益。