一种采用细胞培养法生产高纯度SOD的制备方法与流程

本发明涉及天然产物分离，特别涉及一种基于无菌悬浮细胞两步培养、理化复合胁迫诱导、精细纯化制备高纯度超氧化物歧化酶的工业化生产方法。

背景技术：

1、超氧化物歧化酶（sod）是生物体内专一清除超氧阴离子自由基的核心功能性抗氧化酶，广泛应用于高端化妆品、医药抗炎制剂、功能食品、生物保鲜、皮肤修复等领域。而现有sod生产工艺存在显著技术缺陷。

2、传统植物大田提取法：依赖田间栽培，受季节、气候、病虫害、土壤重金属、农药残留影响大；天然植株sod本底含量极低，色素、多糖、杂蛋白杂质复杂，常规工艺成品纯度普遍低于85%，无法满足医药级、高端化妆品原料准入要求。

3、微生物发酵法：产物含大量菌体杂蛋白、代谢副产物、内毒素，纯化成本高；且酶蛋白结构适配性差、储存稳定性弱。

4、现有植物细胞培养技术缺陷：目前公开的植物细胞培养sod工艺多为单一恒定培养条件，无针对性产酶诱导机制，细胞仅基础表达sod，产量极低、活性差，无法工业化；少量胁迫诱导技术单一、无分步调控逻辑，无法兼顾“生物量积累”与“高活性酶富集”，整体技术效果差、无实质性产业化价值。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明的目的在于开发纯植物细胞、无微生物参与、全程无菌可控的高纯sod量产工艺，以突破以下现有技术瓶颈：

2、第一方面，传统植物来源sod杂质多、纯度低、安全性不可控；

3、第二方面，常规悬浮细胞培养无定向产酶诱导，sod表达量极低；

4、第三方面，单一胁迫方式无法实现双亚型sod同步高表达；

5、第四方面，常规纯化工艺损耗高、纯度不足，难以达到医药高纯级别；

6、第五方面，现有工艺批次差异大、无法标准化连续生产。

7、为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

8、本发明提供了提高生产过程中sod的产量、酶活性和/或纯度的方法，利用马齿苋制备sod，其中包括胁迫诱导马齿苋细胞的步骤；

9、所述胁迫诱导的条件包括以下至少一项：

10、（i）下调碳源供应；

11、（ii）提高培养基的盐度；

12、（iii）添加金属离子或提高金属离子浓度；

13、（iv）减少光照。

14、在本发明的一些具体实施方案中，上述方法：

15、所述下调碳源供应包括将培养基的碳源含量调至18 g/l、19 g/l、20 g/l、21 g/l或22 g/l；

16、所述碳源包括蔗糖；

17、所述提高培养基的盐度包括将培养基的盐的含量调至0.8 g/l、0.9 g/l、1.0 g/l、1.1 g/l或1.2 g/l；

18、所述盐包括氯化钠；

19、所述添加金属离子或提高金属离子浓度包括使培养基的cu2+浓度提高5 nm、6 nm、7 nm、8 nm、9 nm或10 nm，mn2+浓度提高0.1 μm、0.2 μm、0.3 μm、0.4 μm或0.5 μm；

20、所述减少光照包括将光照强度降至常规光照的30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%或40%；

21、所述常规光照为4500 lx。

22、在本发明的一些具体实施方案中，上述方法的所述马齿苋细胞的制备方法包括：

23、乙醇浸泡马齿苋幼嫩叶片，消毒，冲洗，然后接种至愈伤诱导培养基，黑暗培养，得到愈伤组织；

24、培养所述愈伤组织，继代2次或3次，得到马齿苋细胞。

25、在本发明的一些具体实施方案中，上述方法：

26、所述乙醇的浓度包括70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%或80%；

27、所述浸泡的时间为25 s、26 s、27 s、28 s、29 s、30 s、31 s、32 s、33 s、34 s或35s；

28、所述愈伤诱导培养基包括ms培养基、0.7 mg/l、0.71 mg/l、0.72 mg/l、0.73 mg/l、0.74 mg/l、0.75 mg/l、0.76 mg/l、0.77 mg/l、0.78 mg/l、0.79 mg/l、0.8 mg/l、0.81mg/l、0.82 mg/l、0.83 mg/l、0.84 mg/l、0.85 mg/l、0.86 mg/l、0.87 mg/l、0.88 mg/l、0.89 mg/l或0.9 mg/l的2,4-d和0.15 mg/l、0.16 mg/l、0.17 mg/l、0.18 mg/l、0.19 mg/l、0.20 mg/l、0.21 mg/l、0.22 mg/l、0.23 mg/l、0.24 mg/l或0.25 mg/l的naa；

29、所述黑暗培养的条件包括温度24℃、25℃或26℃；时间18 d、19 d、20 d、21 d或22d。

30、本发明还提供了sod的制备方法，其包括：

31、s1：悬浮培养马齿苋细胞10 d、11 d、12 d、13 d或14 d；

32、s2：对所述马齿苋细胞进行胁迫诱5 d、6 d、7 d或8 d，所述胁迫诱导的条件包括以下至少一项：

33、（i）下调碳源供应；

34、（ii）提高培养基的盐度；

35、（iii）添加金属离子或提高金属离子浓度；

36、（iv）减少光照；

37、s3：收集所述马齿苋细胞，分离得到sod。

38、在本发明的一些具体实施方案中，上述制备方法的所述悬浮培养的培养基包括ms培养基。

39、在本发明的一些具体实施方案中，上述制备方法的所述ms培养基的组分包括硝酸铵、硝酸钾、氯化钙、硫酸镁、磷酸二氢钾、碘化钾、硼酸、硫酸锰酸锌、钼酸钠、硫酸铜、氯化钴、硫酸亚铁、乙二胺四乙酸二钠、肌醇、甘氨酸、维生素b1、维生素b6、烟酸、蔗糖。

40、在本发明的一些具体实施方案中，上述制备方法的所述马齿苋细胞的制备方法包括：

41、乙醇浸泡马齿苋幼嫩叶片，消毒，冲洗，然后接种至愈伤诱导培养基，黑暗培养，得到愈伤组织；

42、培养所述愈伤组织，继代2次或3次，得到马齿苋细胞。

43、在本发明的一些具体实施方案中，上述制备方法：

44、所述乙醇的浓度包括70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%或80%；

45、所述浸泡的时间为25 s、26 s、27 s、28 s、29 s、30 s、31 s、32 s、33 s、34 s或35s；

46、所述愈伤诱导培养基包括ms培养基、0.7 mg/l、0.71 mg/l、0.72 mg/l、0.73 mg/l、0.74 mg/l、0.75 mg/l、0.76 mg/l、0.77 mg/l、0.78 mg/l、0.79 mg/l、0.8 mg/l、0.81mg/l、0.82 mg/l、0.83 mg/l、0.84 mg/l、0.85 mg/l、0.86 mg/l、0.87 mg/l、0.88 mg/l、0.89 mg/l或0.9 mg/l的2,4-d和0.15 mg/l、0.16 mg/l、0.17 mg/l、0.18 mg/l、0.19 mg/l、0.20 mg/l、0.21 mg/l、0.22 mg/l、0.23 mg/l、0.24 mg/l或0.25 mg/l的naa；

47、所述黑暗培养的条件包括温度24℃、25℃或26℃、时间18 d、19 d、20 d、21 d或22d。

48、在本发明的一些具体实施方案中，上述制备方法：

49、所述下调碳源供应包括将培养基的碳源含量调至18 g/l、19 g/l、20 g/l、21 g/l或22 g/l；

50、所述碳源包括蔗糖；

51、所述提高培养基的盐度包括将培养基的盐的含量调至0.8 g/l、0.9 g/l、1.0 g/l、1.1 g/l或1.2 g/l；

52、所述盐包括氯化钠；

53、所述添加金属离子或提高金属离子浓度包括使培养基的cu2+浓度提高5 nm、6 nm、7 nm、8 nm、9 nm或10 nm，mn2+浓度提高0.1 μm、0.2 μm、0.3 μm、0.4 μm或0.5 μm；

54、所述减少光照包括将光照强度降至常规光照的30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%或40%。

55、在本发明的一些具体实施方案中，上述制备方法：

56、所述收集马齿苋细胞包括离心收集马齿苋细胞；

57、所述离心收集之后，还包括重悬的步骤；

58、所述离心的条件包括温度4℃、离心转速5500~6500 rpm；

59、所述重悬包括使用4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃、10℃、11℃、12℃、13℃、14℃、15℃、16℃、17℃、18℃、19℃或20℃ ph 6.8、6.9、7.0、7.1或7.2磷酸盐缓冲液重悬；

60、所述分离包括破壁、除杂、纯化的步骤；

61、所述破壁包括对收集得到的马齿苋细胞进行间歇超声破壁得到粗酶液；

62、所述除杂包括对所述粗酶液进行离心，取上清，得到澄清透明粗酶液；

63、所述纯化包括梯度分步盐析、透析和层析，包括：

64、a）对所述澄清透明粗酶液进行低盐析，硫酸铵饱和度为32%、33%、34%、35%、36%、37%或38%；

65、b）对进行低盐析后的所述澄清透明粗酶液进行高盐析，硫酸铵饱和度为58%、59%、60%、61%、62%、63%或64%；

66、c）用10 kda截留分子量透析袋2℃、3℃、4℃、5℃或6℃透析；

67、d）经sephadex g-75葡聚糖凝胶层析，收集得到sod。

68、本发明有以下有益效果：

69、现有技术中，尚无通过“先增殖、后复合理化胁迫产酶”两步悬浮细胞培养耦合梯度精制工艺制备97%以上高纯度sod的完整技术方案。本发明开发了纯植物细胞、无微生物参与、全程无菌可控的高纯sod量产工艺，突破了现有技术瓶颈，具体而言包括：

70、本发明属于纯植物细胞体系，全程无任何微生物参与：摒弃菌种诱导、发酵共生等外源生物干预，完全依靠植物细胞内源代谢调控，体系干净、安全等级高；

71、本发明独创两步差异化培养体系：严格区分“细胞增殖期”与“酶富集诱导期”，先保证高生物量，再通过复合理化胁迫定向激活抗氧化通路，sod产量较常规细胞培养提升8倍以上；

72、本发明实行多重复合理化胁迫双亚型同步增产：通过弱光、微盐碱、微量金属离子协同温和胁迫，同步诱导cu/zn-sod、mn-sod高效累积，产物抗氧化活性全面优于单一亚型sod。

73、本发明实行低温梯度分级精制工艺：通过双段盐析、透析脱杂、凝胶层析精准除杂，成品纯度稳定≥97%，达到行业顶级医药级标准。

74、本发明可实现全年无菌工厂化生产：不受季节、环境、气候限制，无农残、无重金属污染，批次一致性极强，适合大规模标准化量产。