一种短链脱氢酶/还原酶，编码其基因的多核苷酸及其应用

：本发明属于医药，涉及一种短链脱氢酶/水解酶及编码该酶的核苷酸序列，具体讲，涉及一种专一性催化达玛烷型四环三萜化合物的c3β-oh氧化成c3-酮基的短链脱氢酶/还原酶bpsdr4及编码其的多核苷酸，以及应用。

背景技术

0、 背景技术：

1、短链脱氢酶/还原酶(short-chain dehydrogenase/reductase,sdr)超家族是最庞大且古老的蛋白质家族之一，广泛存在于各类生物体中。sdr超家族一般由250～350个氨基酸残基组成，成员间序列相似性仅为15％～30％。大部分sdr超家族成员是nad(p)(h)依赖型的氧化还原酶，催化功能多样，具有广泛的底物谱，是植物次生代谢途径中不可或缺的催化酶类。

2、桦木属植物的达玛烷型三萜化合物是其抗肿瘤活性的主要来源，包括桦叶烯三醇(betulafolienetriol)和桦叶烯四醇(betulafolienetetraol)等，这类化合物的生物合成途径尚未解析，该途径相关酶研究几近空白。桦木属植物达玛烷型三萜的主要特征基团为c3α-oh，可能由前体达玛烯二醇ⅱ的c3β-oh经过氧化成羰基后还原形成。类似的过程在其它物种中也有发现，真菌acremonium fusidioides来源的梭链孢烷抗生素夫西地酸、烟曲霉(aspergillusfumigatus)来源的烟曲霉酸、拟南芥(arabidopsis thaliana)来源的三萜类化合物thalianin的结构中也含有c3α-oh，均经过c3β-oh先氧化成c3-酮基后还原的过程形成，且氧化过程均由sdr催化。据此推测sdr在桦木属植物达玛烷型三萜的生物合成中起重要作用。

3、因此，筛选一种短链脱氢酶/还原酶高效地催化达玛烷型三萜化合物的c3β-oh氧化成c3-酮基，对促进达玛烷型桦木三萜的生物合成研究具有重要意义。

技术实现思路

0、 技术实现要素：

1、本发明解决的技术问题是提供一种短链脱氢酶/还原酶bpsdr4及其氨基酸序列，编码该酶的多核苷酸，以及含有所述多核苷酸的载体和重组细胞，并提供一种含有c3-酮基的新型达玛烷型四环三萜化合物的生产方法。

2、为了解决上述技术问题，本发明从白桦(b.platyphylla suk.)中克隆到短链脱氢酶/还原酶bpsdr4基因，经过表达具有催化达玛烷型四环三萜化合物的c3β-oh氧化成c3-酮基的活性，因此能够催化产生含有c3-酮基的新型达玛烷型四环三萜化合物。

3、因此，在第一个方面，本发明提供了短链脱氢酶/还原酶bpsdr4，bpsdr4具有如seqid no：1所示的氨基酸序列，或者如seq id no：1所示的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或多个氨基酸且具有相同功能的序列。

4、所述的短链脱氢酶/还原酶bpsdr4来源于白桦，具有催化达玛烷型四环三萜化合物的c3β-oh氧化成c3-酮基的活性；

5、

6、其中，r1和r2为h或羟基或氧-葡萄糖基，r3为h或葡萄糖基。

7、本发明的bpsdr4可以是天然蛋白、合成蛋白或重组蛋白。进一步的，本发明的蛋白可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核宿主或真核宿主(例如，细菌、酵母、植物)中产生。其中，所述的使用重组技术获得的本发明的蛋白可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的蛋白还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。

8、本发明的第一方面所述的seq id no：1所示的氨基酸序列可操作地连接有标签序列、信号序列或分泌信号序列。

9、例如，本发明的氨基酸序列的n端或c端可含有一个或多个寡肽片段和/或多肽片段，作为蛋白标签。任何合适的标签都可以用于本发明。例如，标签包括但不限于flag、ha、ha1、c-myc、poly-his、gst、poly-arg、strep-tagii、au1、ee、t7、4a6、ε、b、ge、以及ty1。这些标签可用于对蛋白进行纯化。优选的标签选自poly-his，更优选的标签为6×his。

10、根据本发明的一些实施方式，蛋白标签可与bpsdr4的氨基酸序列直接连接，还可利用间隔寡肽或多肽将蛋白标签连接至本发明的bpsdr4。

11、在第二个方面，本发明提供了编码所述bpsdr4的多核苷酸序列，其包含如seq idno：2所示的核苷酸序列。

12、所述的核苷酸序列可为从白桦中获得的dna。

13、本发明的多核苷酸可以是dna形式或rna形式。dna形式包括cdna、基因组dna或人工合成的dna。dna可以是单链的或是双链的。dna可以是编码链或非编码链。编码本发明蛋白的编码区序列可以与seq id no：2所示的核苷酸序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有seq id no：1所示的蛋白质，但与seq idno：2所示的核苷酸序列有差别的核苷酸序列。即，本发明的多核苷酸可为任何能够编码具有seq id no：1的氨基酸序列的多核苷酸序列。优选的核苷酸序列为seq id no：2。

14、本发明中，优选密码子经过优化的多核苷酸序列。

15、本发明中，可通过化学合成的方式获得本发明的编码短链脱氢酶/还原酶bpsdr4的多核苷酸(例如，带有或不带有编码纯化标签的dna序列及任选的编码间隔序列的dna序列)。

16、根据本发明的优选实施方式，多核苷酸可为编码在n端或c端带有标签的bpsdr4。例如，标签可为poly-his标签。

17、在第三个方面，本发明提供了含有本发明第二方面所述的多核苷酸的载体。

18、根据本发明的实施方式，载体可包括表达载体、穿梭载体或整合载体。例如，载体可为可商购的载体，或任何具有相同功能的载体。在一个优选实施方式中，载体为表达载体。

19、利用本领域技术人员熟知的方法构建含本发明的bpsdr4编码dna序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体、穿梭载体或整合载体。这些方法包括体外重组dna技术、dna合成技术、体内重组技术等。

20、例如，可使用本领域技术人员熟知的多种大肠杆菌细胞表达载体，包括但不限于pet-32(a)和pet-28(a)。优选地，大肠杆菌表达载体为pet-28(a)。例如，可使用本领域技术人员熟知的多种酵母细胞表达载体，包括但不限于pesc-his、pesc-leu、pesc-ura、pesc-trp、pyes2或paur123。优选地，酵母表达载体为pesc-his、pesc-leu、pesc-ura和pesc-trp。

21、在第四个方面，本发明提供了重组细胞，该重组细胞含有本发明第三方面所述的载体，或基因组中整合有本发明第二方面所述的多核苷酸。

22、根据本发明的一些实施方式，重组细胞为原核细胞或真核细胞。优选地，所述重组细胞为大肠杆菌(escherichia coli)细胞、酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)细胞或毕赤酵母(pichia pastoris)细胞。

23、在一个优选实施方式中，重组细胞为大肠杆菌。在又一优选实施方式中，重组细胞为酵母细胞，优选为酿酒酵母细胞。

24、根据本发明的优选实施方式，所述细胞为含有dm、ppd的细胞。

25、在一个优选实施方式中，所述细胞含有dm合成代谢途径中的关键基因，所述关键基因包括但不限于：达玛烯二醇合酶基因(tansakul p,shibuya m,kushiro t,etal.dammarenediol-ii synthase,the first dedicated enzyme for ginsenosidebiosynthesis,in panax ginseng[j].febs lett,2006,580(22):5143-9.)。在另一优选实施方式中，所述细胞含有ppd合成代谢途径中的关键基因，所述关键基因包括但不限于：达玛烯二醇合酶基因、原人参二醇合酶基因、和烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸-细胞色素p450还原酶基因，或其组合(zhou c,chen t,gu,et al.combining protein and metabolicengineering to achieve green biosynthesis of 12β-o-glc-ppd in saccharomycescerevisiae[j].green chemistry,2023,25(4):1356-1367.)。

26、可根据重组细胞的类型选择将载体或多核苷酸导入细胞的合适方法。这些方法都是本领域技术人员熟知的。例如，可采用本领域已知的方法将载体转化到大肠杆菌细胞或酿酒酵母细胞中，或将多核苷酸片段通过同源重组整合进酿酒酵母的基因组中。其中，转化酿酒酵母的方法可使用本领域技术人员熟知的各种转化方法，例如电转化法、醋酸锂化学转化法等。

27、在第五个方面，本发明提供了将羟基氧化为羰基的方法，该方法包括：在辅因子nadp+或nad+存在下，使用短链脱氢酶/还原酶bpsdr4进行氧化反应。

28、根据本发明的一些实施方式，该方法使达玛烷型四环三萜化合物的c3β-oh氧化成c3-酮基。其中，达玛烷型四环三萜化合物优选自达玛烷型人参皂苷前体。

29、除非另有说明，本文中的术语“达玛烷型人参皂苷前体”是指在人参皂苷生物合成途径中具有达玛烷型四环三萜母核的所有化合物。例如，达玛烷型人参皂苷前体包括但不限于dm、ppd或ppt。

30、在一个优选实施方式中，当式(1)的化合物为dm，式(2)的化合物为dammar-24-ene-20s-ol-3-one。在一个优选实施方式中，当式(1)的化合物为ppd，式(2)的化合物为dammar-24-ene-12β,20s-diol-3-one。

31、在一些优选实施方式中，该方法包括，分别制备本发明所述的短链脱氢酶/还原酶bpsdr4，以及底物式(1)的化合物，然后在辅因子的存在下进行反应。

32、在另一些优选实施方式中，该方法包括将编码短链脱氢酶/还原酶bpsdr4的核苷酸序列与各底物合成代谢途径中的关键基因在宿主细胞中共表达，从而获得所述式(2)的化合物，所述关键基因包括但不限于：达玛烯二醇合酶基因、原人参二醇合酶基因、及烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸-细胞色素p450还原酶基因，或其组合。

33、在该方法中，短链脱氢酶/还原酶bpsdr4可以分离的形式提供，优选被纯化至均质。对此，可使用本领域中常规使用的方法制备分离的短链脱氢酶/还原酶bpsdr4。该酶也可以与重组细胞的其它成分一起提供，例如含有bpsdr4的细胞裂解液等。

34、本发明所述的氧化方法的ph可为ph 3.0～11.0、优选ph 5.0～9.0、最优选ph8.0。本发明所述的氧化方法的温度可为10℃～60℃、优选20℃～40℃、最优选30℃。

35、在一个优选实施方式中，所述宿主细胞为酵母菌或大肠杆菌。

36、在第六个方面，本发明提供了bpsdr4用于生产含有c3-酮基的非天然人参皂苷的用途。

37、有益技术效果：

38、本发明的短链脱氢酶/还原酶bpsdr4能够催化达玛烷型四环三萜化合物的c3β-oh氧化，从而生成含有c3-酮基的新型达玛烷型四环三萜化合物。该酶是首次发现的能够催化达玛烷型四环三萜类化合物的c3β-oh氧化成c3-酮基的酶。