一种精神分裂症样斑马鱼模型的构建方法及其应用

本发明涉及基因工程与实验动物模型构建，具体而言，涉及一种精神分裂症样斑马鱼模型的构建方法及其应用。

背景技术：

1、精神分裂症是高发、高致残的重型神经精神疾病，全球终生患病率约1%，遗传度60%～85%，临床分为阳性症状、阴性症状与认知损伤，病程迁延、致残率高，给社会和家庭造成沉重负担。多项gwas及靶向测序研究证实人bnip3l是精神分裂症易感基因，基因内及周边多个变异位点显著提升患病风险，但

bnip3l基因突变诱发精神分裂的病理机制尚不明确。

2、现阶段精神分裂症体内研究多采用啮齿类动物模型，存在饲养成本高、繁育周期长、难以大批量开展表型检测等弊端。斑马鱼

bnip3lb是人bnip3l同源基因，跨物种氨基酸同源性68.78%，基因结构保守；斑马鱼繁育速度快、胚胎透明、脑组织及行为检测体系完善，是神经发育疾病理想模式生物。但由于目前缺少

bnip3lb稳定敲除、携带精神分裂相关病理与行为表型的斑马鱼品系，因此限制了bnip3l介导精神分裂发病机制的体内实验研究。

技术实现思路

1、鉴于此，本发明提出了一种精神分裂症样斑马鱼模型的构建方法，以解决上述现有技术存在的问题。

2、为实现上述目的，本发明提出以下技术方案：

3、一种精神分裂症样斑马鱼模型的构建方法，包括以下步骤：

4、敲除斑马鱼内源性的bnip3lb基因，使斑马鱼脑组织出现突触结构损伤和/或髓鞘发育异常，并表现出精神分裂症相关的行为学表型。

5、进一步地，所述敲除斑马鱼内源性的bnip3lb基因包括：使斑马鱼bnip3lb基因第4外显子发生突变，导致bnip3lb蛋白截短失活。

6、进一步地，所述突变采用crispr/cas9基因编辑技术实现，所述crispr/cas9系统包括靶向斑马鱼

bnip3lb基因第4外显子的sgrna；优选地，所述sgrna的序列如seq id no:1所示。

7、进一步地，所述方法包括以下步骤：

8、（1）制备包含cas9蛋白与所述sgrna的核糖核蛋白复合物；

9、（2）将所述核糖核蛋白复合物显微注射入斑马鱼单细胞期受精卵中，培养获得f0代嵌合体斑马鱼；

10、（3）将阳性f0代嵌合体斑马鱼与野生型斑马鱼杂交，筛选获得f1代杂合突变体斑马鱼；

11、（4）将f1代杂合突变体斑马鱼互交，筛选获得f2代纯合突变体斑马鱼，即得所述精神分裂症样斑马鱼模型。

12、进一步地，所述精神分裂症相关的行为学表型包括以下一种或多种：

13、自发活动量降低、焦虑样行为增加、社交偏好降低、攻击性减弱、重复刻板行为增加。

14、进一步地，所述突触结构损伤包括突触后膜长度减少、突触后密度增加和/或突触囊泡数量减少。

15、进一步地，所述髓鞘发育异常包括髓鞘异常增厚。

16、进一步地，所述精神分裂症样斑马鱼模型的基因组中

bnip3lb基因第4外显子携带导致编码蛋白截短失活的突变。

17、进一步地，所述突变包括碱基缺失突变。

18、本发明进一步提出了上述方法构建的精神分裂症样斑马鱼模型在bnip3l基因突变诱发精神分裂症发病机制研究中的应用，从脑发育、神经行为、突触结构、线粒体代谢和神经递质通路多个维度解析bnip3l在精神分裂症发生过程中的作用机理。

19、与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

20、本发明通过crispr-cas9技术靶向敲除斑马鱼

bnip3lb基因第4外显子，成功构建了稳定遗传的bnip3lb纯合突变体品系，填补了现有技术中缺乏bnip3l同源基因稳定敲除斑马鱼模型的空白。该模型在分子水平表现为bnip3lb基因mrna显著下调及蛋白截短失活，在形态学水平表现为幼鱼眼间距缩短、头部尺寸变小及成鱼间脑体积缩小，在行为学水平表现为自发活动减少、焦虑样行为增强、社交功能障碍及攻击性减弱，并出现绕墙运动、来回运动和小圈盘旋等异常重复刻板行为，在超微病理水平表现为神经元突触结构破损、突触囊泡减少及髓鞘异常增厚，从脑发育、神经行为、突触结构和髓鞘发育多个维度复刻了精神分裂症相关病理与行为表型。该模型繁育周期短、饲养成本低、胚胎透明且脑组织及行为检测体系完善，可大批量开展表型检测，适用于bnip3l基因突变诱发精神分裂症的体内发病机制研究，为深入解析bnip3l在精神分裂发生过程中的作用机理提供了可靠的实验动物平台。

1.一种精神分裂症样斑马鱼模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述敲除斑马鱼内源性的bnip3lb基因包括：使斑马鱼bnip3lb基因第4外显子发生突变，导致bnip3lb蛋白截短失活。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述突变采用crispr/cas9基因编辑技术实现，所述crispr/cas9系统包括靶向斑马鱼bnip3lb基因第4外显子的sgrna；优选地，所述sgrna的序列如seq id no:1所示。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述精神分裂症相关的行为学表型包括以下一种或多种：

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述突触结构损伤包括突触后膜长度减少、突触后密度增加和/或突触囊泡数量减少。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述髓鞘发育异常包括髓鞘异常增厚。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述精神分裂症样斑马鱼模型的基因组中bnip3lb基因第4外显子携带导致编码蛋白截短失活的突变。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述突变包括碱基缺失突变。

10.一种如权利要求1-9任一项所述方法构建的精神分裂症样斑马鱼模型在bnip3l基因突变诱发精神分裂症发病机制研究中的应用，其特征在于，从脑发育、神经行为、突触结构、线粒体代谢和神经递质通路多个维度解析bnip3l在精神分裂症发生过程中的作用机理。