一种耐盐鱼类品系的构建方法

本发明属于生物，涉及一种鱼类新品系构建方法，尤其涉及一种耐盐鱼类品系的构建方法。

背景技术：

1、当前，我国盐碱地区仅有不足2%的水域盐碱度相对较低，可以开发利用养殖常规的淡水和海水经济动物。盐碱水域的高碱可以通过调节ph来改善，然而高盐处理难度大且成本高，这极大地限制了盐碱地水产养殖业的发展。截至2024年，我国已认定了306种水产优良新品种，这些新品种的大规模推广应用促进了水产养殖业的快速发展，然而由于大多数优良鱼类新品种在培育过程中以生长单一性状为目标，并且培育的品种适用于正常水体，未考虑特殊养殖环境的要求，这使得在面临高盐环境带来的渗透压应激下，鱼体的生长、代谢甚至生存等多方面容易受到负面影响。这严重制约了高盐水域水产养殖业的高效和可持续健康发展，因此，亟需培育耐高盐的鱼类育种新材料。

2、slc24a是编码，依赖钾离子的钠/钙交换体家族（nckx）家族的关键基因，nckx家族一共包含五种蛋白nckx1-5，每一种蛋白都是不同slc24a基因的产物，例如nckx4（slc24a4）在视觉和嗅觉信号的终止和适应、黑皮质素依赖性饱腹感信号以及牙釉质的成熟中起关键作用。但是关于slc24a3基因对鱼类耐盐性能之间的关系还没有相关研究报道。

技术实现思路

1、针对现有技术中存在的问题和不足，本发明的目的旨在提供一种耐盐鱼类品系的构建方法。

2、本发明第一方面提供了slc24a3基因在提高鱼类耐盐性中的应用，所述应用为如下任意一种：

3、（a1）通过基因编辑技术使鱼类基因组中的slc24a3基因不表达或表达受抑制，构建耐盐鱼类品系；

4、（a2）通过基因编辑技术或/和rna干扰技术使鱼类基因组中的slc24a3基因不表达或表达受抑制，提升鱼类耐盐性。

5、根据上述应用，优选地，所述基因编辑技术为crispr-cas9技术；更加优选地，所述crispr-cas9技术使用的grna的靶位点序列如seq id no:1所示，seq id no:1为：5’-gtccagtttggccgagaattc-3’。

6、根据上述应用，优选地，所述grna的靶位点序列设计在slc24a3基因第一个外显子区域。

7、本发明第二方面提供了一种用于检测鱼类耐盐性相关slc24a3基因的产品的应用，所述应用为：利用所述产品对slc24a3基因敲除鱼类的后代群体进行slc24a3基因的基因型鉴定，选择slc24a3基因纯合敲除个体，即得耐盐鱼类品系。

8、本发明第三方面提供了用于抑制slc24a3基因表达或功能的试剂在制备耐盐鱼类品系中的应用。

9、根据上述应用，优选地，所述试剂为采用基因编辑技术使鱼类基因组中的slc24a3基因不表达或表达受抑制的试剂。优选地，所述基因编辑技术为crispr-cas9技术。更加优选地，所述crispr-cas9技术使用的grna的靶位点序列如seq id no:1所示，seq id no:1为：5’-gtccagtttggccgagaattc-3’。

10、根据上述应用，优选地，所述grna的靶位点序列设计在slc24a3基因第一个外显子区域。

11、本发明第四方面提供了 用于抑制slc24a3基因表达或功能的试剂在提高鱼类耐盐性能中的应用。

12、根据上述应用，优选地，所述试剂为采用基因编辑技术或/和rna干扰技术使鱼类基因组中的slc24a3基因不表达或表达受抑制的试剂。

13、根据上述应用，优选地，所述基因编辑技术为crispr-cas9技术。更加优选地，所述crispr-cas9技术使用的grna的靶位点序列如seq id no:1所示，seq id no:1为：5’-gtccagtttggccgagaattc-3’。

14、根据上述应用，优选地，所述grna的靶位点序列设计在slc24a3基因第一个外显子区域。

15、本发明第五方面提供了一种耐盐鱼类品系的构建方法，包括以下步骤：

16、（1）针对鱼类slc24a3基因设计并合成grna；

17、（2）将所述grna与cas9 mrna或cas9蛋白混合，注射到鱼类单细胞期受精卵中；

18、（3）将注射后的胚胎培养至成鱼，获得f0代鱼类；

19、（4）将f0代鱼类与野生型鱼交配，获得f1代鱼类；

20、（5）对f1代鱼类进行基因型鉴定，筛选出slc24a3基因杂合敲除个体；

21、（6）将具有相同突变类型的f1代杂合敲除个体互相交配，获得f2代鱼类；

22、（7）对f2代鱼类进行基因型鉴定，筛选出slc24a3基因纯合敲除个体，即获得耐盐鱼类品系。

23、根据上述构建方法，优选地，所述grna的靶位点序列如seq id no:1所示，seq idno:1为：5’-gtccagtttggccgagaattc-3’。

24、根据上述构建方法，优选地，所述grna的靶位点序列设计在slc24a3基因第一个外显子区域。

25、本发明第六方面提供了一种用于敲除鱼类slc24a3基因的grna，所述grna的靶位点序列如seq id no:1所示，seq id no:1为：5’-gtccagtttggccgagaattc-3’。

26、本发明第七方面提供了上述第六方面所述grna在构建耐盐鱼类品系或提高鱼类耐盐性能中的应用。

27、本发明中所述鱼类优选为鲤科鱼类，更加优选为斑马鱼。

28、本发明中所述slc24a3基因在ncbi数据库中的基因id为557196。更加优选地，slc24a3基因序列参考基因组版本为grcz12ab，登录号：gcf 052040795.1，slc24a3基因位于第13号染色体nc 141033的129575438至29738081位置。

29、与现有技术相比，本发明取得的积极有益效果如下：

30、（1）本发明首次揭示了slc24a3基因敲除能够显著提升鱼类的耐盐性，为鱼类耐盐性研究提供了新的基因靶点。

31、（2）本发明利用crispr-cas9技术在鱼类模式动物斑马鱼中成功敲除了slc24a3基因，构建了耐盐斑马鱼品系，该耐盐斑马鱼品系为稳定遗传的耐盐品系，为耐盐鱼类育种提供了重要的遗传材料。另外，本发明耐盐斑马鱼品系构建方法操作简单，可极大地缩短育种周期，并且可以获得稳定遗传的耐盐品系，后代性状受环境影响较小，不影响生长性状，对于当前绝大多数养殖鱼类都能适用，具有较好的推广应用前景。

1. slc24a3基因在提高斑马鱼耐盐性中的应用，所述应用为如下任意一种：

2. 根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述基因编辑技术为crispr-cas9技术；所述crispr-cas9技术使用的grna的靶位点序列如seq id no:1所示，

3.一种用于检测斑马鱼耐盐性相关slc24a3基因的产品的应用，所述应用为：利用所述产品对slc24a3基因敲除斑马鱼的后代群体进行slc24a3基因的基因型鉴定，选择slc24a3基因纯合敲除个体，即得耐盐斑马鱼品系；

4. 用于抑制slc24a3基因表达或功能的试剂在制备耐盐斑马鱼品系中的应用，所述试剂为采用基因编辑技术使斑马鱼基因组中的slc24a3基因不表达或表达受抑制的试剂；所述slc24a3基因在ncbi数据库中的基因id为557196，slc24a3基因序列参考基因组版本为grcz12ab，登录号：gcf 052040795.1，slc24a3基因位于第13号染色体nc 141033的129575438至29738081位置。

5. 用于抑制slc24a3基因表达或功能的试剂在提高斑马鱼耐盐性能中的应用，所述试剂为采用基因编辑技术或/和rna干扰技术使斑马鱼基因组中的slc24a3基因不表达或表达受抑制的试剂；所述slc24a3基因在ncbi数据库中的基因id为557196，slc24a3基因序列参考基因组版本为grcz12ab，登录号：gcf 052040795.1，slc24a3基因位于第13号染色体nc141033的129575438至29738081位置。

6.一种耐盐斑马鱼品系的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

7. 根据权利要求6所述构建方法，其特征在于，所述grna的靶位点序列如seq id no:1所示，seq id no:1为：5’-gtccagtttggccgagaattc-3’。

8. 一种用于敲除斑马鱼slc24a3基因的grna，其特征在于，所述grna的靶位点序列如seq id no:1所示，seq id no:1为：5’-gtccagtttggccgagaattc-3’；所述grna的序列与靶位点序列一致，所述slc24a3基因在ncbi数据库中的基因id为557196，slc24a3基因序列参考基因组版本为grcz12ab，登录号：gcf 052040795.1，slc24a3基因位于第13号染色体nc141033的129575438至29738081位置。

9.权利要求8所述grna在构建耐盐斑马鱼品系或提高斑马鱼耐盐性能中的应用。