一种用于外源基因定点整合的UNTR基因座及其在重组蛋白生产中的应用

本发明涉及生物，具体地涉及一种用于外源基因定点整合的untr基因座及其在重组蛋白生产中的应用。

背景技术：

1、抗体药物、重组疫苗及病毒相关生物制品等领域快速发展，推动了重组治疗性蛋白需求的不断增长。与此同时，监管机构对生物制品的安全性、稳定性及批次一致性提出了更高要求。在重组蛋白生产过程中，宿主细胞表达系统不仅影响目标蛋白的产量，还会影响其翻译后修饰及生物学活性，因此构建高效稳定的细胞表达平台对于生物制造尤为关键。

2、哺乳动物细胞拥有完备的蛋白加工与翻译后修饰机制，能够实现复杂糖基化修饰、二硫键组装及蛋白正确折叠，目前绝大多数治疗性重组蛋白均采用哺乳动物细胞进行生产。其中中国仓鼠卵巢细胞（cho）凭借工艺成熟、易规模化培养等优势，已成为应用最普遍的工业宿主细胞。但是cho细胞属于非人源细胞，其蛋白糖基化模式与人体天然蛋白仍存在一定差异，部分情况下可能影响重组蛋白的稳定性、药效及免疫原性。相较而言，人源hek293细胞由于能够提供更接近人体天然蛋白的修饰特征，在病毒载体、复杂糖蛋白及部分抗体类产品生产中具有明显优势。其中hek293f细胞，因其适用于无血清悬浮培养，同时具有生长迅速、转染效率高及易于规模化放大等特点，已逐渐成为重组蛋白表达重要宿主系统。

3、目前，hek293f稳转细胞株构建仍以随机整合为主。该策略操作简便，但外源基因插入位点随机、拷贝数无法精准控制，易受基因组位置效应干扰，造成单克隆间表达水平差异显著。同时长期传代培养过程中，外源基因易发生表达下调、基因沉默甚至片段丢失，严重影响细胞株遗传稳定性与生产批次均一性。为筛选符合工业化要求的高表达稳定细胞株，往往需要开展大量单克隆筛选及多轮稳定性验证，不仅拉长研发周期、增加制备成本，也大幅降低了细胞株开发效率。

4、因此，本领域迫切需要开发一种适用于hek293f细胞兼具高表达能力、良好遗传稳定性及细胞生长兼容性的整合位点，对于提升重组蛋白表达水平、构建高稳定性工程细胞株具有重要的理论价值与应用意义。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种适用于hek293f细胞兼具高表达能力、良好遗传稳定性及细胞生长兼容性的整合位点，对于提升重组蛋白表达水平、构建高稳定性工程细胞株具有重要的理论价值与应用意义。

2、本发明第一方面提供了一种分离的核酸分子，所述核酸分子包含位于人6号染色体的untr基因座的至少一部分序列，所述序列能够作为外源基因定点整合的靶标区域；所述序列包含untr基因的内含子1、内含子2和/或内含子3区域的全部或部分核苷酸序列；其中，所述untr基因对应于ensembl数据库中的ensg00000296922基因。

3、在另一优选例中，所述基因座包含untr基因的内含子1、内含子2和/或内含子3区域。

4、在另一优选例中，所述内含子1区域包含位于人6号染色体第156,680,547位点至第156,779,943位点之间的整合位点。

5、在另一优选例中，所述内含子1区域包含位于人6号染色体第156,686,098位点至第156,727,577位点之间（较佳地为第156,686,098位点）的整合位点。

6、在另一优选例中，所述内含子2区域包含位于人6号染色体第156,663,443位点至第156,680,371位点之间的整合位点。

7、在另一优选例中，所述内含子2区域包含位于人6号染色体第156,672,106位点附近的整合位点。

8、在另一优选例中，所述内含子3区域包含位于人6号染色体第156,633,791位点至第156,663,324位点之间的整合位点。

9、在另一优选例中，所述内含子3区域包含位于人6号染色体第156,637,408位点至第156,658,607位点之间的整合位点。

10、在另一优选例中，所述内含子1区域包含选自下组的一个或多个整合位点：

11、（a）对应于seq id no: 4所示sgrna靶向的整合位点；

12、（b）对应于seq id no: 5所示sgrna靶向的整合位点；

13、（c）对应于seq id no: 6所示sgrna靶向的整合位点。

14、在另一优选例中，所述内含子2区域包含对应于seq id no: 3所示sgrna靶向的整合位点。

15、在另一优选例中，所述内含子3区域包含选自下组的一个或多个整合位点：

16、（a）对应于seq id no: 1所示sgrna靶向的整合位点；

17、（b）对应于seq id no: 2所示sgrna靶向的整合位点。

18、在另一优选例中，所述外源基因编码目标蛋白，所述目标蛋白包括多肽、抗体、抗原、融合蛋白、酶、激素、细胞因子或其他功能性蛋白质；

19、在另一优选例中，所述外源基因编码的蛋白为病毒样颗粒或重组病毒颗粒的组成蛋白。

20、在另一优选例中，所述组成蛋白在细胞内表达后能够进一步组装形成病毒样颗粒或重组病毒颗粒。

21、在另一优选例中，所述核酸分子包含选自seq id no: 1-6中任一项所示的sgrna靶向的核苷酸序列；较佳地为选自seq id no: 3-6中任一项所示的sgrna靶向的核苷酸序列

22、在本发明第二方面，提供了一种重组载体或载体组合，所述载体或载体组合包含：

23、（a）用于靶向本发明第一方面所述的核酸分子的核酸引导序列；和/或

24、（b）含有外源基因的表达盒，所述表达盒两侧设有与所述核酸分子同源的臂序列。

25、在另一优选例中，所述载体或载体组合还包含编码定点核酸酶的序列。

26、在另一优选例中，所述定点核酸酶为crispr相关核酸酶、锌指核酸酶或转录激活样效应因子核酸酶。

27、在另一优选例中，所述crispr相关核酸酶包括cas9核酸酶或其变体。

28、在另一优选例中，所述核酸引导序列为向导rna（grna）或单向导rna（sgrna）。

29、在另一优选例中，所述核酸引导序列为如seq id no:1-6任一所示。

30、在本发明第三方面，提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞包含本发明第一方面所述的分离的核酸分子，且所述untr基因座的至少一部分区域内整合有外源基因。

31、在另一优选例中，所述区域包含所述untr基因座的内含子1、内含子2和/或内含子3区域。

32、在另一优选例中，所述外源基因定点整合于所述untr基因座的内含子1、内含子2和/或内含子3区域。

33、在另一优选例中，所述内含子1区域包含选自下组的一个或多个整合位点：

34、（a）对应于seq id no: 4所示sgrna靶向的整合位点；

35、（b）对应于seq id no: 5所示sgrna靶向的整合位点；

36、（c）对应于seq id no: 6所示sgrna靶向的整合位点。

37、在另一优选例中，所述内含子2区域包含对应于seq id no: 3所示sgrna靶向的整合位点。

38、在另一优选例中，所述内含子3区域包含选自下组的一个或多个整合位点：

39、（a）对应于seq id no: 1所示sgrna靶向的整合位点；

40、（b）对应于seq id no: 2所示sgrna靶向的整合位点。

41、在另一优选例中，所述宿主细胞为人胚肾细胞。

42、在另一优选例中，所述宿主细胞包括hek293细胞或其衍生细胞。

43、在另一优选例中，所述宿主细胞为hek293f细胞。

44、在本发明第四方面，提供了一种生产目标蛋白的方法，所述方法包括：

45、（a）提供本发明第三方面所述的宿主细胞；

46、（b）在适于所述目标蛋白表达的条件下培养所述宿主细胞；以及

47、（c）从培养体系中分离或回收所述目标蛋白。

48、在另一优选例中，所述目标蛋白为igg抗体。

49、在另一优选例中，所述培养为fed-batch培养。

50、在本发明第五方面，提供了一种构建重组细胞株的方法，所述方法包括：

51、将外源基因通过定点整合方式插入untr基因座的内含子1、内含子2和/或内含子3区域中，获得整合有所述外源基因的宿主细胞；其中，所述untr基因座对应于ensembl数据库中的ensg00000296922基因所在的区域。

52、在另一优选例中，所述方法还包括对所述宿主细胞进行单克隆化筛选的步骤。

53、在另一优选例中，所述定点整合通过选自下组的系统来实现的：crispr/cas系统、talen系统、zfn系统和/或重组酶介导的整合系统。

54、在另一优选例中，所述crispr/cas系统为crispr/cas9系统。

55、在本发明第六方面，提供了如本发明第一方面所述的核酸分子、或如本发明第三方面述的宿主细胞在制备重组蛋白或构建重组细胞株中的应用。

56、在另一优选例中，所述重组蛋白选自下组：抗体、融合蛋白、细胞因子、酶、或病毒样颗粒（vlp）及腺相关病毒（aav）的组成蛋白。

57、在另一优选例中，所述重组细胞株为用于生产目标蛋白的hek293细胞或hek293f细胞。

58、在本发明第七方面，提供了如本发明第一方面所述的核酸分子、或如本发明第三方面所述的宿主细胞在生产目标蛋白或药物中的应用。

59、在另一优选例中，所述目标蛋白为igg抗体、病毒样颗粒、或重组病毒颗粒的组成蛋白。

60、在另一优选例中，所述药物为包含所述目标蛋白的药物组合物，所述药物用于治疗肿瘤或自身免疫性疾病，或用作疫苗。

61、应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。