包含序列特异性核糖核酸内切酶的组合物及其使用方法与流程

本公开提供了包含序列特异性核糖核酸内切酶的组合物及其在rna分析和rna合成中的使用方法。特别地，本公开涉及包含分离的iii型毒素-抗毒素系统核糖核酸内切酶的组合物和样品，该内切酶优选cptn亚家族和tenpn亚家族的核糖核酸内切酶。

背景技术：

1、核糖核酸内切酶是一组酶，根据酶的不同，其在单链rna或双链rna中切割相邻核苷酸之间的内部磷酸二酯键。核糖核酸内切酶可以是序列特异性的（例如限制性核糖核酸内切酶）或序列非特异性的。

2、已知许多核糖核酸内切酶，如rna酶 h，其是一个序列非特异性核糖核酸内切酶家族，催化rna/dna杂合底物中rna的切割。

3、核糖核酸内切酶在分子生物学研究中有多种应用。例如，dna提取过程和重组蛋白纯化中rna的去除、cdna合成、rna指纹分析以及rna修饰的检测，如mrna的5’加帽。

4、治疗性rna分子，如疫苗生产中编码抗原的mrna分子，代表了一类新兴药物。转染mrna的成功蛋白表达除取决于转染效率外，还取决于mrna的稳定性和翻译效率。5’帽结构和3’ poly(a)尾是获得高翻译效率的重要特征。因此，非常需要用于测定mrna的5’加帽效率或其他rna修饰的高效方法。

5、凝胶电泳、离子对反相高效液相色谱（ip rp hplc）或质谱（ms）等分析方法常用于分析rna修饰。

6、然而，长rna分子（即长于5-10个核糖核苷酸的rna分子）的加帽完整性的鉴定存在问题，因为加帽仅导致约600 da的分子量微小位移，这大致相当于一个核糖核苷酸。如此小的分子量位移使得无法对长mrna分子直接进行基于凝胶的下游分析或质谱（ms）分析，因为分辨率不足。

7、替代的加帽分子产生仅表现出微小分子量位移的不同产物：例如cap-1或cap-0、5’-三磷酸、5’-二磷酸、未甲基化的g帽、反向帽。

8、为了克服现有当前分析工具分辨率不足的问题，rna样品，特别是包括长rna分子的样品，需要在进一步分析之前被切割成更短的片段。

9、当今的rna切割标准是基于核糖核酸内切酶的切割，使用具有高切割频率的酶（例如rna酶 i）、基于rna酶 h的方法、基于核酶的方法或基于dna酶的方法。

10、像rna酶 i这样具有高切割频率的核糖核酸内切酶在每个g之后切割单链rna。这类酶对某些rna分析方法而言并非最优，因为它们会导致高度片段化。

11、切割rna/dna杂合体的rna酶 h依赖于特异性dna杂交（au2016297778），并且基于rna酶 h的方法存在对靶rna的非特异性和不完全切割的问题，即使dna探针已正确杂交。因此，基于rna酶 h的方法需要针对每个杂交的rna-dna寡核苷酸对优化条件，以实现rna的完全和特异性消化。

12、csy4核糖核酸内切酶依赖于向导rna来识别和切割其rna靶序列。

13、就在最近，核酶也被描述为适用于mrna的序列特异性切割，vlatkovic et al.,ribozyme assays for quantifying the capping efficiency of in vitrotranscribed mrna, pharmaceutics, 2022, vol.14, no.2, p.328, and wo2015101416，以及wo2015101416。

14、然而，核酶依赖于核糖核酸的合成，并且需要以相对于待分析底物浓度1-10倍的过量使用。核酶是催化性rna分子，因此生产成本更高，并且由于缺乏稳定性而更难操作。

15、dna酶是具有催化活性的dna寡核苷酸，类似于核酶。最丰富的脱氧核酶类别是核糖核酸酶，其催化核糖核苷酸磷酸二酯键的切割，hengesbach, m. et al. use ofdnazymes for site-specific analysis of ribonucleotide modification, rna,2008, vol.14, no.1, p.180-187。

16、尽管已存在核糖核酸内切酶，但仍然持续需要提供进一步的核糖核酸内切酶，其允许高效且简化的rna分析或rna合成方法，以克服现有技术的核糖核酸内切酶及方法的一个或多个缺点。

技术实现思路

1、本公开提供了水溶液形式的组合物，其适于切割靶rna分子，如待进行体外操作或分析的rna分子。所述水溶液可以包含cptn核糖核酸内切酶和/或tenpn核糖核酸内切酶，因此，靶rna当然不同于cptn核糖核酸内切酶和tenpn核糖核酸内切酶的相应抗毒素。这些酶以游离形式提供，即不与相应抗毒素（cpti或tenpi rna）形成复合物。此外，这些酶优选以分离的形式提供（即从生物材料纯化的酶或通过化学合成生产的酶，但更方便地通过重组技术生产）。已发现，当水性组合物包含合适浓度的一价阳离子时，可以实现切割特异性识别的序列基序处的rna的最佳活性/特异性。还发现，一定浓度（>3mm）的二价阳离子的存在对序列基序特异性和催化活性有益。

2、本公开提供了一种用于切割靶rna分子的水溶液，其中水溶液包含

3、cptn核糖核酸内切酶和/或tenpn核糖核酸内切酶，

4、0至500 mm的一价阳离子，

5、以及

6、0至20 mm的二价阳离子。

7、所述水溶液可以包含游离形式的分离的cptn核糖核酸内切酶。

8、所述水溶液可以包含游离形式的分离的tenpn核糖核酸内切酶。

9、所述水溶液可以包含10至400 mm的na+。

10、所述水溶液可以包含20至300 mm的na+。

11、所述水溶液可以包含50至200 mm的na+。

12、所述水溶液可以包含10至400 mm的k+。

13、所述水溶液可以包含20至300 mm的k+。

14、所述水溶液可以包含50至200 mm的k+。

15、所述水溶液可以包含3至18 mm的mg2+。

16、所述水溶液可以包含5至15 mm的mg2+。

17、所述水溶液可以包含3至18 mm的mn2+。

18、所述水溶液可以包含5至15 mm的mn2+。

19、水溶液可以优选地包含3至15 mm的二价阳离子，如3至10 mm的二价阳离子。

20、所述水溶液可以包含10至400 mm的nh4+，如20至300 mm的nh4+，如50至200 mm的nh4+。

21、水溶液的ph可以在6.5至9.0的范围内。

22、水溶液的ph可以在7.0至8.5的范围内。

23、水溶液的ph可以在7.5至8.0的范围内。

24、所述水溶液可以包含由seq id no: 1或seq id no: 2表示的核糖核酸内切酶，或与其具有超过90%序列同一性的核酸内切酶。

25、本公开还提供了水溶液用于切割单链靶rna的用途，所述单链靶rna包含cptn核糖核酸内切酶和/或tenpn核糖核酸内切酶的相应切割位点。

26、本公开还提供了一种用于切割单链靶rna的方法，包括以下步骤：

27、a) 提供包含单链靶rna的样品，所述单链靶rna具有cptn核糖核酸内切酶和/或tenpn核糖核酸内切酶的切割位点，

28、b) 将步骤a)的样品与水溶液中的任一种接触，条件是该样品包含能够切割所述单链靶rna的核糖核酸内切酶。

29、本文的水溶液可以含有一价阳离子，如na+、k+、nh4+ 和li+。

30、本文的水溶液可以含有二价阳离子，如mg2+、mn2+和ca2+。

31、本文的水溶液可以含有阴离子，如cl-、so42-、po43-、乙酸根、柠檬酸根、碳酸根等。

32、因此，本公开还提供了一种用于切割靶rna分子的水溶液，其中水溶液包含

33、cptn核糖核酸内切酶和/或tenpn核糖核酸内切酶、

34、20至200 mm的一价阳离子，

35、以及

36、3至20 mm的二价阳离子。

37、因此，本公开还提供了一种用于切割靶rna分子的水溶液，其中水溶液包含

38、cptn核糖核酸内切酶和/或tenpn核糖核酸内切酶、

39、30至150 mm的一价阳离子，

40、以及

41、3至15 mm的二价阳离子。

42、因此，本公开还提供了一种用于切割靶rna分子的水溶液，其中水溶液包含

43、cptn核糖核酸内切酶和/或tenpn核糖核酸内切酶、

44、30至150 mm的一价阳离子，

45、以及

46、3至15 mm的二价阳离子。

47、因此，本公开还提供了一种用于切割靶rna分子的水溶液，其中水溶液包含

48、cptn核糖核酸内切酶和/或tenpn核糖核酸内切酶、

49、30至120 mm的一价阳离子，

50、以及

51、3至12 mm的二价阳离子。

52、然而，已发现由seq id no: 10表示的cptn酶即使在不添加盐的水溶液中也具有所需活性。

53、在第一方面，提供了一种组合物，其包含分离的iii型毒素-抗毒素系统的核糖核酸内切酶，其中组合物中一价盐的浓度为≤400 mm，如约≤200 mm，并且其中所述一价盐优选为碱金属盐或铵盐，并且其中所述核糖核酸内切酶选自cptn核糖核酸内切酶或tenpn核糖核酸内切酶。

54、在第一方面的一个实施方式中，组合物包含浓度约≤300 mm的碱金属盐或铵盐，如约≤200 mm，如约10 mm至约400 mm，如约20 mm至约300 mm，如约50 mm至约200 mm。

55、在第一方面的一个实施方式中，组合物是用于施加到包含至少一个多核糖核酸（rna）分子的样品的溶液。

56、在第一方面的一个实施方式中，所述样品的体积为约≥0.1µl。

57、在第一方面的一个实施方式中，所述样品的体积为约0.1µl至约500µl，优选约0.1µl至约300µl，优选约0.1µl至约250µl，优选约0.1µl至约200µl，更优选约0.1µl至约150µl，更优选约0.1µl至约100µl，更优选约0.1µl至约75µl，更优选约0.1µl至约50µl。

58、在第一方面的一个实施方式中，组合物或样品的一价盐是包含碱金属离子或铵离子的无机盐。

59、因此，一价盐优选为碱金属盐或铵盐。

60、在第一方面的一个实施方式中，盐的碱金属离子选自na+、k+、li+、rb+、cs+和fr+或它们的任何组合。

61、在第一方面的一个实施方式中，碱金属离子选自na+、k+、li+和rb+。

62、在第一方面的一个实施方式中，选择铵（nh4+）作为阳离子。

63、在第一方面的一个实施方式中，包含碱金属离子或铵离子的盐的阴离子优选选自氟（f）、氯（cl）、溴（br）、碘（i）、硫酸盐、磷酸盐或氢氧化物、乙酸盐、柠檬酸盐、碳酸盐或其任何合适的组合。

64、在第一方面的一个实施方式中，碱金属盐选自nacl、kcl、na2so4、k2so4、koh、naoh、na-磷酸盐、k-磷酸盐、乙酸铵、氯化铵或其任何合适的组合。

65、在第一方面的一个实施方式中，组合物包含浓度约≤20 mm的二价金属离子，如约≤18 mm，如约0.1 mm至约20 mm，如约1 mm至约18 mm，如约3 mm至约15 mm。

66、二价金属阳离子优选为mg2+或mn2+。

67、在第一方面的一个实施方式中，组合物或样品基本上不含二价金属阳离子。

68、二价金属阳离子优选为mg2+或mn2+。

69、在第一方面的一个实施方式中，组合物或样品基本上不含二价金属阳离子，即组合物中二价金属阳离子的浓度为约≤3mm，优选约≤2mm，更优选约≤1mm。

70、在第一方面的一个实施方式中，组合物或样品基本上不含二价金属阳离子，即包含二价金属阳离子的浓度与组合物中二价离子螯合剂的浓度的比率，使得组合物中存在的游离二价金属阳离子的浓度为约≤3mm，优选约≤2mm，更优选约≤1mm。

71、在第一方面的一个实施方式中，组合物或样品包含浓度约≤10mm的二价离子螯合剂。

72、二价离子螯合剂优选为edta或egta。

73、在第一方面的一个实施方式中，分离的cptn核糖核酸内切酶或其酶活性片段包含seq id no.1的氨基酸序列，或包含与seq id no.1具有至少30%同一性的氨基酸序列。

74、在第一方面的一个实施方式中，分离的cptn核糖核酸内切酶或其酶活性片段包含seq id no.1的氨基酸序列，或包含与seq id no.1具有至少70%同一性的氨基酸序列。

75、在第一方面的一个实施方式中，分离的cptn核糖核酸内切酶或其酶活性片段包含seq id no.1的氨基酸序列，或包含与seq id no.1具有至少75%、80%、85%、90%、92%、94%、95%、98%或99%同一性的氨基酸序列。

76、在第一方面的一个实施方式中，分离的tenpn核糖核酸内切酶或其酶活性片段包含seq id no.2的氨基酸序列，或包含与seq id no.2具有至少30%同一性的氨基酸序列。

77、在第一方面的一个实施方式中，分离的tenpn核糖核酸内切酶或其酶活性片段包含seq id no.2的氨基酸序列，或包含与seq id no.2具有至少70%同一性的氨基酸序列。

78、在第一方面的一个实施方式中，分离的tenpn核糖核酸内切酶或其酶活性片段包含seq id no.1的氨基酸序列，或包含与seq id no.2具有至少75%、80%、85%、90%、92%、94%、95%、98%或99%同一性的氨基酸序列。

79、本文公开的分离的cptn核糖核酸内切酶不与toxi rna形成复合物。

80、本文公开的分离的tenpn核糖核酸内切酶不与toxi rna形成复合物。

81、在第一方面的其他实施方式中，组合物或样品包含toxn核糖核酸内切酶或其酶活性片段，所述cptn核糖核酸内切酶包含seq id no.1的氨基酸序列，或包含与seq id no.1具有至少30%同一性（例如70%同一性）的氨基酸序列，其中

82、-组合物或样品中一价盐的浓度优选约≤100 mm、约≤75 mm、约≤55 mm，更优选约20 mm至约75 mm，更优选约20 mm至约55 mm。

83、在第一方面的其他实施方式中，组合物或样品包含cptn核糖核酸内切酶或其酶活性片段，所述cptn核糖核酸内切酶包含seq id no.1的氨基酸序列，或包含与seq id no.1具有至少30%同一性（例如至少70%同一性）的氨基酸序列，其中

84、-组合物或样品中一价盐的浓度优选约≤100 mm、约≤75 mm、约≤55 mm，更优选约20 mm至约75 mm，更优选约20 mm至约55 mm；

85、并且其中

86、-组合物或样品基本上不含游离二价金属阳离子，其中二价金属阳离子优选为mg2+或mn2+，并且其中二价金属阳离子以无机盐（例如mgcl2或mncl2）提供。

87、在第一方面的其他实施方式中，组合物或样品包含cptn核糖核酸内切酶或其酶活性片段，所述cptn核糖核酸内切酶包含seq id no.1的氨基酸序列，或包含与seq id no.1具有至少30%同一性（例如至少70%同一性）的氨基酸序列，其中

88、-组合物或样品中一价盐的浓度优选约≤100 mm、约≤75 mm、约≤55 mm，更优选约20 mm至约75 mm，更优选约20 mm至约55 mm；

89、并且其中

90、-游离二价金属阳离子的浓度为约≤1 mm，二价金属阳离子优选为mg2+或mn2+，并且其中二价金属阳离子以无机盐（例如mgcl2或mncl2）提供。

91、在第一方面的其他实施方式中，组合物或样品包含toxn核糖核酸内切酶或其酶活性片段，所述cptn核糖核酸内切酶包含seq id no.1的氨基酸序列，或包含与seq id no.1具有至少30%同一性（例如至少70%同一性）的氨基酸序列，其中

92、-组合物或样品中一价盐的浓度优选约≤100 mm、约≤75 mm、约≤55 mm，更优选约20 mm至约75 mm，更优选约20 mm至约55 mm；

93、并且其中

94、-组合物或样品包含二价金属阳离子的浓度与组合物或样品中二价离子螯合剂的浓度的比率，使得所述样品或组合物中存在的游离二价金属阳离子的浓度为约≤1 mm，并且二价离子螯合剂的浓度为约≤10 mm

95、-二价金属阳离子优选为mg2+或mn2+，并且以无机盐（例如mgcl2或mncl2）提供，并且

96、-二价离子螯合剂优选为edta或egta。

97、在第一方面的其他实施方式中，组合物或样品包含toxn核糖核酸内切酶或其酶活性片段，所述tenpn核糖核酸内切酶包含seq id no.2的氨基酸序列，或包含与seq id no.2具有至少30%同一性（例如70%同一性）的氨基酸序列，其中

98、-组合物或样品中一价盐的浓度优选约≤100 mm、约≤75 mm、约≤55 mm，更优选约20 mm至约75 mm，更优选约20 mm至约55 mm。

99、在第一方面的其他实施方式中，组合物或样品包含tenpn核糖核酸内切酶或其酶活性片段，所述tenpn核糖核酸内切酶包含seq id no.2的氨基酸序列，或包含与seq idno.2具有至少30%同一性（例如至少70%同一性）的氨基酸序列，其中

100、-组合物或样品中一价盐的浓度优选约≤100 mm、约≤75 mm、约≤55 mm，更优选约20 mm至约75 mm，更优选约20 mm至约55 mm；

101、并且其中

102、-组合物或样品基本上不含游离二价金属阳离子，其中二价金属阳离子优选为mg2+或mn2+，并且其中二价金属阳离子以无机盐（例如mgcl2或mncl2）提供。

103、在第一方面的其他实施方式中，组合物或样品包含tenpn核糖核酸内切酶或其酶活性片段，所述tenpn核糖核酸内切酶包含seq id no.2的氨基酸序列，或包含与seq idno.2具有至少30%同一性（例如至少70%同一性）的氨基酸序列，其中

104、-组合物或样品中一价盐的浓度优选约≤100 mm、约≤75 mm、约≤55 mm，更优选约20 mm至约75 mm，更优选约20 mm至约55 mm；

105、并且其中

106、-游离二价金属阳离子的浓度为约≤1 mm，二价金属阳离子优选为mg2+或mn2+，并且其中二价金属阳离子以无机盐（例如mgcl2或mncl2）提供。

107、在第一方面的其他实施方式中，组合物或样品包含toxn核糖核酸内切酶或其酶活性片段，所述tenpn核糖核酸内切酶包含seq id no.2的氨基酸序列，或包含与seq id no.2具有至少30%同一性（例如至少70%同一性）的氨基酸序列，其中

108、-组合物或样品中一价盐的浓度优选约≤100 mm、约≤75 mm、约≤55 mm，更优选约20 mm至约75 mm，更优选约20 mm至约55 mm；

109、并且其中

110、-组合物或样品包含二价金属阳离子的浓度与组合物或样品中二价离子螯合剂的浓度的比率，使得所述样品或组合物中存在的游离二价金属阳离子的浓度为约≤1 mm，并且二价离子螯合剂的浓度为约≤10 mm

111、-二价金属阳离子优选为mg2+或mn2+，并且以无机盐（例如mgcl2或mncl2）提供，并且

112、-二价离子螯合剂优选为edta或egta。

113、在第二方面，提供了一种切割样品中单链rna分子的方法，其中所述方法包括以下步骤：

114、a. 提供包含至少一个单链rna分子的样品，所述单链rna分子包含分离的iii型毒素-抗毒素系统的核糖核酸内切酶的切割位点；以及

115、b. 在允许切割所述样品中存在的至少一部分所述rna分子的条件下，使所述核糖核酸内切酶或其酶活性片段与所述样品中的至少一个rna分子接触，其中所述样品中一价盐的浓度为约≤150 mm，如约≤100 mm，并且其中一价盐优选为碱金属盐。

116、在第二方面的一个实施方式中，步骤a)中的所述单链rna分子是包含mrna、sirna、环状rna前体、microrna或核酶中任一种的前体的多个拷贝的串联体，并且其中所述串联rna分子在mrna、sirna、环状rna、microrna或核酶的前体的每个拷贝之间包含iii型毒素-抗毒素系统的核糖核酸内切酶的切割位点。

117、在第二方面的一个实施方式中，切割步骤通常将是孵育，其允许切割样品中存在的至少一部分所述rna分子。

118、在第二方面的一个实施方式中，包含iii型毒素-抗毒素系统的核糖核酸内切酶的组合物和样品是第一方面及其实施方式中所描述的组合物和样品。

119、在第二方面的一个实施方式中，至少一个单链rna分子包含分离的cptn核糖核酸内切酶的切割位点。

120、在第二方面的一个实施方式中，至少一个单链rna分子包含分离的tenpn核糖核酸内切酶的切割位点。

121、在第二方面的一个实施方式中，所述孵育在约10oc至约60oc下进行，如约15oc至55oc，优选在35至45°c的范围内，如约45oc。

122、在第二方面的一个实施方式中，允许切割所述样品中存在的至少一部分所述rna分子的孵育时间为约1分钟至约2小时，如约5分钟至约1.5小时，如约10分钟至约1小时。

123、在第三方面，提供了一种制备单链环状rna分子的方法，其中所述方法包括以下步骤：

124、a. 提供包含至少一个单链rna分子的样品，其中所述rna分子包含分离的iii型毒素-抗毒素系统的核糖核酸内切酶的切割位点；

125、b. 在允许消化所述样品中存在的至少一个rna分子的至少一部分的条件下，使分离的iii型毒素-抗毒素系统的核糖核酸内切酶与至少一个单链rna分子接触，从而产生至少一个包含3’-po4末端和5’-oh末端的rna分子，其中样品中一价盐的浓度为约≤400 mm，如约≤300 mm，并且其中一价盐优选为碱金属盐或铵盐，并且其中样品中二价金属离子的浓度为约≤20 mm，如约≤10 mm，并且其中二价金属离子优选为mg2+或mn2+或它们的组合；以及

126、c. 在允许连接的条件下，使至少一个被切割的rna分子与rtcb连接酶接触，从而产生环状rna。

127、在第三方面的一个实施方式中，包含iii型毒素-抗毒素系统的核糖核酸内切酶的所述样品是第一方面及其实施方式中所描述的样品。

128、在第三方面的一个实施方式中，至少一个单链rna分子包含分离的cptn核糖核酸内切酶的切割位点。

129、在第三方面的一个实施方式中，至少一个单链rna分子包含分离的tenpn核糖核酸内切酶的切割位点。

130、在又一方面，提供了一种合成sirna的方法。所述方法包括以下步骤：

131、a. 提供包含至少一个滚环转录的串联rna分子的样品，所述串联rna分子包含iii型毒素-抗毒素系统的两种不同核糖核酸内切酶（例如cptn -a和cptn -b）的切割位点，所述两种酶具有不同的识别位点，其中cptn -b的识别位点位于串联重复之间，而cptn -a的识别序列位于串联重复之内；

132、b. 在允许切割所述样品中存在的至少一部分所述rna分子的条件下，使所述样品与cptn -b核糖核酸内切酶或其酶活性片段接触，从而产生基于其正义-反义序列信息形成发夹结构的单个重复；使所形成的发夹结构与第二种cptn -a酶接触，所述酶切割环结构中的rna以形成双链rna分子，其中样品中一价盐的浓度为约≤400 mm，如约≤300 mm，并且其中一价盐优选为碱金属盐；以及

133、c. 使用标准的单链特异性核糖核酸酶（例如rna酶 t1）去除含有cptn识别位点部分的所得突出端，从而产生双链sirna。

134、在该又一方面的一个替代实施方式中，iii型毒素-抗毒素系统的核糖核酸内切酶是tenpn核糖核酸内切酶。

135、在该又一方面的一个实施方式中，包含分离的iii型毒素-抗毒素系统的核糖核酸内切酶的组合物和样品是第一方面及其实施方式中所描述的组合物和样品。

136、在第四方面，提供了一种用于测定rna分子的5’-加帽效率的方法，其中方法包括以下步骤：

137、a. 提供包含至少一个单链mrna分子的样品，所述单链mrna分子在所述mrna的5’utr中包含iii型毒素-抗毒素系统的核糖核酸内切酶的切割位点；

138、b. 在允许切割至少一部分所述单链rna分子以产生至少一个5’末端rna片段和至少一个3’末端rna片段的条件下，使步骤a)的所述样品与iii型毒素-抗毒素系统的核糖核酸内切酶接触；其中所述样品中一价盐的浓度为约≤150 mm，如约≤100 mm，并且其中一价盐优选为碱金属盐或铵盐，并且其中所述样品中二价金属离子的浓度为约≤20 mm，如约≤10 mm，并且其中二价金属离子优选为mg2+或mn2+或它们的组合；以及

139、c. 分离并检测来自步骤b)的rna片段，并测定所述5’末端rna片段的5’端处5’-加帽修饰的存在。

140、在第四方面的一个实施方式中，5’末端rna片段的长度为约2个核糖核苷酸至约100个核糖核苷酸，优选5至50个，更优选5至10个。

141、在第四方面的一个实施方式中，包含iii型毒素-抗毒素系统的核糖核酸内切酶的组合物和样品是第一方面及其实施方式中所描述的组合物和样品。

142、在第四方面的一个实施方式中，组合物和样品包含cptn核糖核酸内切酶。

143、在第四方面的一个实施方式中，组合物和样品包含tenpn核糖核酸内切酶。

144、在第五方面，提供了一种用于测定rna分子的poly(a)尾长度分布的方法，其中方法包括以下步骤：

145、a. 提供包含至少一个单链mrna分子的样品，所述单链mrna分子在所述mrna的poly(a)尾上游包含iii型毒素-抗毒素系统的核糖核酸内切酶的切割位点；

146、b. 在允许切割至少一部分所述单链rna分子以产生至少一个5’末端rna片段和至少一个3’末端rna片段的条件下，使步骤a)的所述样品与分离的iii型毒素-抗毒素系统的核糖核酸内切酶接触，其中所述样品中一价盐的浓度为约≤400 mm，如约≤300 mm，并且其中一价盐优选为碱金属盐或铵盐，并且其中所述样品中二价金属离子的浓度为约≤20 mm，如约≤10 mm，并且其中二价金属离子优选为mg2+或mn2+或它们的组合；以及

147、c. 分离并检测来自步骤b)的rna片段，并测定所述3’末端rna片段的3’端处poly(a)尾的长度。

148、在第五方面的一个实施方式中，包含iii型毒素-抗毒素系统的核糖核酸内切酶的组合物和样品是第一方面及其实施方式中所描述的组合物和样品。

149、在第五方面的一个实施方式中，组合物和样品包含cptn核糖核酸内切酶。

150、在第五方面的一个实施方式中，组合物和样品包含tenpn核糖核酸内切酶。

151、在第六方面，提供了一种rna指纹分析的方法，其中方法包括以下步骤：

152、a. 提供包含至少一个序列未知的单链rna分子的样品；

153、b. 在允许切割至少一部分所述rna分子从而获得多个rna片段的条件下，使步骤a)的所述样品与iii型毒素-抗毒素系统的核糖核酸内切酶接触，其中所述样品中一价盐的浓度为约≤400 mm，如约≤300 mm，并且其中一价盐优选为碱金属盐或铵盐，并且其中所述样品中二价金属离子的浓度为约≤20 mm，如约≤10 mm，并且其中二价金属离子优选为mg2+或mn2+或它们的组合；以及

154、c. 分离和检测来自步骤b的片段化rna分子，从而获得所述序列未知的rna分子的指纹图谱，并将所获得的指纹图谱与序列已知的rna分子的指纹图谱进行比较。

155、在第六方面的一个实施方式中，包含iii型毒素-抗毒素系统的核糖核酸内切酶的组合物和样品是第一方面及其实施方式中所描述的组合物和样品。

156、在第六方面的一个实施方式中，组合物和样品包含cptn核糖核酸内切酶。

157、在第六方面的一个实施方式中，组合物和样品包含tenpn核糖核酸内切酶。

158、在第七方面，提供了一种用于分析多价rna组合物的方法，其中方法包括以下步骤：

159、a. 提供包含多价rna组合物的样品，所述多价rna组合物包含第一rna种类和第二rna种类，所述第一rna种类和所述第二rna种类在至少一个位置包含iii型毒素-抗毒素系统的核糖核酸内切酶的切割位点；

160、b. 在允许切割至少一部分所述第一rna种类和所述第二rna种类从而从所述第一rna种类和第二rna种类释放多个第一rna片段和第二rna片段的条件下，使步骤a)的所述样品与iii型毒素-抗毒素系统的核糖核酸内切酶接触，其中所述样品中一价盐的浓度为约≤400 mm，如约≤300 mm，并且其中一价盐优选为碱金属盐或铵盐，并且其中所述样品中二价金属离子的浓度为约≤20 mm，如约≤10 mm，并且其中二价金属离子优选为mg2+或mn2+或它们的组合；以及

161、c. 分离和检测所释放的第一rna片段和第二rna片段的存在和/或量。

162、在第六方面和第七方面的一个实施方式中，rna分子选自mrna、rna病毒、免疫原性rna分子、类病毒、长链非编码rna和核酶。

163、在上述方法的一个实施方式中，所述分离和检测步骤基于所述rna片段的不同分子量、电荷或长度。

164、在上述方法的一个实施方式中，所述分离和检测步骤选自凝胶电泳、毛细管凝胶电泳（cge）、page、高压液相色谱（hplc）、质谱（ms）或lc-ms、ip rp hplc和lc-uv。

165、在第七方面的一个实施方式中，包含iii型毒素-抗毒素系统的核糖核酸内切酶的组合物和样品是第一方面及其实施方式中所描述的组合物和样品。

166、在第七方面的一个实施方式中，组合物和样品包含cptn核糖核酸内切酶。

167、在第七方面的一个实施方式中，组合物和样品包含tenpn核糖核酸内切酶。

168、在第八方面，提供了一种试剂盒，其包含：

169、a. 根据第一方面及其实施方式所述的组合物；以及

170、b. 第二组合物，其包含选自以下的第二酶：rna聚合酶、用于连接单链rna分子的rna连接酶、焦磷酸酶、磷酸酶、激酶或任何其他核酸或核糖核酸修饰酶，以及至少一种另外的iii型毒素-抗毒素系统的核糖核酸内切酶，其识别位点不同于a)的iii型毒素-抗毒素系统的核糖核酸内切酶。