环状RNA的制备的制作方法

本发明涉及一种生产环状rna的方法，旨在生产环状rna的线性前体rna，包含环状rna、线性前体rna和其他rna杂质的组合物，以及从此类组合物中分离环状rna的方法。

背景技术：

1、rna（特别是mrna）用于药物应用的用途是一个快速发展的领域，并且针对covid-19的有效疫苗的快速开发已经清楚地证明了mrna技术的巨大潜力。这为一系列未来的新型疫苗和疗法铺平了道路。合成生物学使得能够快速定制mrna序列，这使得基于mrna的疫苗成为未来大流行病以及地方病和其他感染性疾病（诸如狂犬病、寨卡和巨细胞病毒感染）的有吸引力的治疗策略。除此之外，还有几项正在进行的临床研究，其基于疾病（诸如hiv、各种类型的癌症、囊性纤维化和糖尿病）的mrna治疗。mrna技术也已被证明是在个性化医疗中使用的良好候选者。

2、mrna的生产通常通过体外转录（ivt）进行，然后进行一个或多个纯化步骤以去除ivt组分和副产物。这可包括沉淀和过滤步骤，包括切向流过滤（tff）和/或不同模式的色谱。例如，可通过基于mrna 3’ polya尾与互补oligo(dt)配体之间的相互作用的亲和色谱纯化mrna，例如，如wo2014152031a1中所描述。

3、除了用于治疗应用的常规mrna分子之外，环状rna的使用越来越受到关注。对环状rna越来越感兴趣的原因包括其寿命和由没有5’端或3’端的闭环结构介导的降低的免疫原性。环状rna被认为提供优于传统线性mrna分子的若干优点。

4、当与mrna一起工作时的主要问题是降解核糖核酸酶（rna酶）的存在。由于环状rna分子不具有游离的5’端和3’端，因此不易被核酸外切酶降解。此外，环状rna中5’磷酸基团的缺少显著降低了先天免疫应答的识别。据报道，与正常mrna（约2天-3天）相比，环状rna在细胞中的蛋白质表达延长（约1周）。此外，未加帽的线性mrna可活化先天免疫受体并因此在患者中引起免疫应答和/或限制临床功效。作为实例，先天免疫受体（诸如toll样受体8）可被尿苷活化，并且这种作用可通过使用修饰的核苷酸（如假尿苷）来抑制。然而，修饰的核苷酸是昂贵的并且可能改变mrna的结构特性。相比之下，即使当使用未修饰的核苷酸时，也发现环状rna的免疫原性较低（wesselhöft等人, 2019）。还可以预见，环状rna的体内稳定性增加将允许减少剂量，这也可以预期在患者中引起较少的免疫应答。此外，开发过程更短，因为不需要优化修饰的核苷酸的组合，并且这组rna分子可能需要较少的努力来从编码区去除尿苷核苷酸。

5、此外，环状rna中不存在5’帽和3’ polya尾简化了生产过程，因此生产过程可以更短，损失最小。从监管的角度来看，制造被简化，因为对于这两个特征不需要分析方法。

6、环状rna在自然界中以低丰度存在，并且已经开发了不同的策略用于rna片段的合成环化。可使用不同的技术来产生环状rna分子，作为第一步，所有这些技术都依赖于提供线性前体rna，例如通过ivt。迄今为止，用于产生一定长度的环状rna的现有技术是基于促进环状rna分子形成的转录的功能序列元件。更具体地，rna环化的一种方法利用可掺入线性前体rna中的自剪接核酶亚基。例如，置换的内含子-外显子（pie）剪接策略使用侧接置换的i组催化内含子片段的外显子对。在环化条件下，含有3’和5’ pie片段的线性前体rna经历催化反应，导致内含子剪接并融合相应的5’和3’外显子末端，以形成环状rna分子。

7、目前可用的生产环状rna的方法面临低环化效率，特别是对于较大的rna。环化效率可以在一定程度上提高，例如，通过添加同源臂，但是对于约2000个核苷酸（nt）的rna，效率通常相当低（总rna的20%-30%），并且对于较大的mrna，效率显著更低。

8、制备用于治疗应用的环状rna的另一个主要挑战是去除rna杂质。作为环化反应的结果，除了所需的环状rna外，反应样品还含有(a)未反应的线性前体rna，(b)中间体，(c)带切口的rna，即在环化后重新打开的rna，以及(d)已从线性前体切割的较短的线性片段。中间体可包括线性rna分子，其中仅一个内含子已被切除，而另一个内含子（包括任何同源臂等）保留。这些rna种类(a)-(d)代表杂质，并且期望将这些与环状靶rna分离。然而，这些rna杂质是高度带电的并且具有大的流体动力学半径，非常类似于环状rna。色谱技术（诸如离子交换和疏水相互作用色谱）目前在大规模分离这些种类时不能达到令人满意的分离度，或者可能需要苛刻和无水的缓冲条件。因此，与常规mrna的纯化相比，与靶环状rna非常相似的这些rna种类的存在使得环状rna的纯化更加困难。

9、目前最广泛使用的去除线性rna种类的方法是基于通过核酸外切酶rna酶r特异性地酶促降解线性rna。在ivt和环化后，rna酶r降解线性种类，而靶环状rna大部分保持完整，然后可以进一步纯化以去除反应的蛋白质组分。然而，这个程序增加了处理步骤，并且具有低特异性和效率，这导致环状rna的部分降解。

10、另一种选择是通过高效液相色谱（hplc）分离环状和线性rna种类。然而，这种方法具有有限的可扩展性并且需要使用有毒溶剂。

11、在wo2023242425a1中概述了用于纯化环状rna的新方法。该文献提出了包含蛋白质编码区和rna适体的环状rna，其旨在与亲和配体结合，以允许环状rna与亲和色谱树脂结合，然后洗脱环状rna。

12、总之，环状rna的有效纯化仍然是一个挑战。

技术实现思路

1、本发明的目的是克服或至少部分地减轻现有技术的缺点。

2、因此，本发明的目的是提供一种促进环状rna的生产和/或纯化的线性前体rna。本发明的另一个目的是提供用于生产和/或纯化环状rna的改善方法。

3、这些和其他目的通过具有5’端和3’端的线性前体rna分子实现，该线性前体rna分子在5’至3’方向上包含：

4、i)第一自剪接序列，

5、ii)感兴趣的序列，以及

6、iii)第二自剪接序列，

7、其中线性前体rna分子能够在剪接所述第一自剪接序列和所述第二自剪接序列后形成环状rna，其中第一自剪接序列包含位于所述5’端与第一自剪接序列的剪接位点之间的第一均聚部分，并且/或者其中第二自剪接序列包含位于所述3’端与第二自剪接序列的剪接位点之间的第二均聚部分。因此，所述第一自剪接序列和所述第二自剪接序列中的至少一者包含均聚部分。

8、有利地，一个或多个均聚部分可在将环化rna与线性杂质（诸如前体rna、中间体和切割的自剪接序列）分离的方法中用作纯化手柄。此外，令人惊讶地发现，所提出的具有至少一个均聚部分的线性前体rna具有增加环化效率的潜力。

9、在实施方案中，第一均聚部分和/或第二均聚部分可包含至少6个，诸如至少10个连续相同单元的至少一个均聚序列。在实施方案中，第一均聚部分和/或第二均聚部分包含至多75个单元。

10、在实施方案中，第一均聚部分和/或第二均聚部分可包含至少一个均聚序列或由其组成，该均聚序列是包含至少两个由单个间插单元或更短序列隔开的重复区段的中断序列。每个重复区段可由至少3个重复单元（诸如核苷酸）组成。

11、当存在时，第一均聚部分优选包含或是核酸序列。当存在时，第二均聚部分优选包含或是核酸序列。因此，一个或多个均聚部分可包含作为核苷酸的重复单元。

12、例如，第一均聚部分和/或第二均聚部分可包含至少一个选自以下的序列：polya、polyu、polyc和poly(g)，优选polya序列，其中所述序列可选地包括一个或多个修饰的核苷酸。修饰的核苷酸可具有相同类型。可替代地，两个修饰的核苷酸可代表不同类型的修饰。

13、第一均聚部分可位于线性rna分子的5’端附近。可选地，所述第一均聚部分可位于5’起始序列的下游，诸如直接位于所述5’起始序列之后。在实施方案中，第一自剪接序列可包含位于所述5’端与第一自剪接序列的剪接位点之间的所述第一均聚部分。

14、第二均聚部分可位于线性rna分子的3’端附近。可选地，所述第二均聚部分可位于3’端序列的上游，诸如紧接在所述3’端序列之前。在实施方案中，第二自剪接序列包含位于所述3’端与第二自剪接序列的剪接位点之间的所述第二均聚部分。

15、当线性前体包含所述第一均聚部分和所述第二均聚部分两者时，第一均聚部分和第二均聚部分优选不彼此结合。例如，第一均聚部分和第二均聚部分可以是彼此不互补或不能彼此杂交的核酸序列。可选地，第一均聚部分和第二均聚部分可以彼此相同。

16、线性前体rna分子可包含位于感兴趣的序列与第一自剪接序列的剪接位点之间的第一连接序列（e1），以及位于感兴趣的序列与第二自剪接序列的剪接位点之间的第二连接序列（e2），其中所述第一连接序列和所述第二连接序列能够连接以形成含有感兴趣的序列的环状rna分子。例如，第一自剪接序列可包含3’自剪接内含子片段，并且第二自剪接序列可包含5’自剪接内含子片段。例如，第一自剪接序列可包含形成置换的内含子-外显子（pie）的部分的序列，并且第二自剪接序列可包含形成置换的内含子-外显子的部分的序列。可选地，线性前体rna可包含环化核酶。

17、在实施方案中，第一自剪接序列包含第一配对序列，并且第二自剪接序列包含第二配对序列，其中所述第一配对序列和所述第二配对序列能够彼此杂交。当第一自剪接序列包含第一均聚部分时，第一配对序列可位于5’至3’方向上的第一均聚部分与剪接位点之间。当第二自剪接序列包含第二均聚部分时，第二配对序列可位于5’至3’方向上的剪接位点与第二均聚部分之间。

18、感兴趣的序列可包含至少一个编码感兴趣的蛋白质的编码序列和可选地至少一个翻译调节序列，诸如ires序列。

19、可替代地或另外地，感兴趣的序列可包含调节rna序列、蛋白质结合rna序列或指导rna序列中的至少一者。

20、在另一方面，本发明提供了一种模板dna分子，其编码如本文所描述的前体rna分子。

21、在另一方面，本发明提供了一种生产包含感兴趣的序列的环状rna分子的方法，该方法包括在允许剪接剪接序列和环化的条件下温育如本文所描述的前体线性rna分子，以形成含有感兴趣的序列的环状rna分子。

22、令人惊讶地发现，使用第一方面的线性前体，本文公开的方法增加了环化效率。因此，可以增加环状rna的产率，并且可以减少环化反应后残留的线性前体和其他杂质的含量。此外，线性前体的一个或多个均聚部分的存在有利于杂质的进一步分离。

23、该方法可包括进行第二方面的模板dna分子的体外转录（ivt）反应以提供前体线性rna分子的步骤。进行体外转录（ivt）反应通常包括提供包含模板dna、核糖核苷三磷酸、dna依赖性rna聚合酶和缓冲体系的ivt反应混合物，其中温育线性前体rna分子的步骤包括温育所述ivt反应混合物。

24、在生产环状rna的方法中，线性前体rna分子可以在20°c至56°c，诸如约37°c至约56°c的范围内的温度下温育。温育时间可以是10分钟至24小时，诸如10分钟至5小时，诸如30分钟至5小时。温育期间的ph可以在6.5-8的范围内。可选地，可以在温育之前或期间将gtp和/或atp添加到包含前体rna的组合物中。

25、生产环状rna的方法可以可选地进一步包括将环状rna与线性前体rna分子和/或在温育期间形成的其他rna种类分离的步骤。

26、在另一方面，本发明提供了一种组合物，其包含：线性前体rna分子，包含前体rna分子的感兴趣的序列的环状rna分子，以及可选地，至少一种选自以下的杂质：i)包含第一自剪接序列的至少一部分但缺少第二自剪接序列的rna分子，ii)包含第二自剪接序列的至少一部分但缺少第一自剪接序列的rna分子，iii)切割的第一自剪接序列，和iv)切割的第二自剪接序列。组合物可以代表由ivt反应（温育）产生的粗反应混合物，在这种情况下，组合物包含环状rna、rna杂质以及ivt组分。可替代地，组合物可以是已经通过一个或多个步骤（例如，通过尺寸排阻色谱）处理或纯化的ivt反应混合物，该一个或多个步骤可用于去除ivt组分，诸如消化的模板dna，但不能去除线性前体rna和上述线性rna杂质i)-iv)。

27、当组合物是ivt反应混合物时，其可以进一步包含

28、-编码前体rna的模板dna，其可选地被脱氧核糖核酸酶（dna酶）消化，在这种情况下，组合物通常还含有dna酶

29、-核糖核苷三磷酸；

30、-dna依赖性rna聚合酶，以及由所述dna依赖性聚合酶催化的核酸聚合所需的任何辅因子；以及

31、-缓冲液。

32、组合物可另外包含至少一种选自焦磷酸酶、rna酶抑制剂和去污剂的组分。在实施方案中，组合物可含有rna酶抑制剂。在实施方案中，组合物可不含rna酶。

33、在组合物已经经受一个或多个调理或纯化步骤的情况下，可能已经去除了ivt反应残留的一些或全部非rna组分。因此，组合物可基本上不含非rna ivt反应组分，诸如ntp、消化的dna模板、rna聚合酶和其他蛋白质。

34、在另一方面，本发明提供了一种从包含至少一个均聚部分的线性rna种类中分离所需环状rna的方法，该方法包括

35、a)提供如上文所描述的组合物或通过如本文所描述的生产环状rna的方法可获得或获得的组合物，

36、b)在允许配体与均聚部分结合的条件下，使所述组合物与包含与载体材料偶联的配体的色谱材料接触，所述配体对线性前体rna分子的均聚部分具有结合亲和力，

37、c)在流通级分中获得所述环状rna，

38、d)可选地，从所述色谱材料洗脱结合的非环状rna种类并可选地再生所述色谱材料。

39、配体可以是能够与均聚部分结合（诸如杂交）的核酸分子。例如，配体可以是oligo(dt)配体，并且均聚部分可包含polya序列。

40、在实施方案中，载体材料可以是基于对流的基质，可选地选自由以下组成的组：多孔聚合物膜、过滤器、纤维基质和多孔整料。在其他实施方案中，载体材料可以是色谱树脂，其包含选自多孔珠粒、无孔珠粒和磁性珠粒的珠粒。多孔珠粒可由多糖或其衍生物（诸如琼脂糖或其衍生物）形成。

41、可选地，该方法可包括，在步骤b之前，使组合物经受基于尺寸的分离步骤（诸如过滤或尺寸排阻色谱）的步骤。

42、以下在具体实施方式和从属权利要求中描述了本公开的优选方面。注意，本发明涉及权利要求中记载的特征的所有可能的组合。