一种用于外源基因定点整合的DERA基因座及其在重组蛋白生产中的应用

本发明涉及生物，具体地涉及一种用于外源基因定点整合的dera基因座及其在重组蛋白生产中的应用。

背景技术：

1、随着生物制药技术的快速发展，重组治疗性蛋白在抗体药物、疫苗及病毒相关制品等领域的应用需求持续增长，监管机构对药用蛋白的安全性、有效性及生产一致性也提出了更为严苛的要求。表达体系的选择直接影响蛋白质的正确折叠、组装以及翻译后修饰水平，是决定重组蛋白质量与功能的核心因素之一。由于哺乳动物细胞具备完善的翻译后修饰能力，能够实现更接近人体内源蛋白的糖基化及加工过程，因此已成为重组治疗性蛋白工业化生产的主流平台。目前，hek293细胞系已获得fda批准用于治疗性蛋白生产。其中，适应无血清悬浮培养的hek293f细胞因具有转染效率高、增殖速度快、易于规模化培养等特点，已被广泛应用于生物制造及重组蛋白表达领域。

2、然而，目前hek293f稳定表达细胞株的构建仍主要依赖随机整合策略。该方法存在明显局限性，难以精确控制外源基因的基因组插入位置及拷贝数，且易受基因组位置效应的显著影响，导致不同克隆间表达水平差异显著，同时在长期连续传代过程中易出现表达衰减或表达不稳定的问题。为获得能够维持稳定高表达的工程细胞株，通常需要进行多轮筛选和长期验证，这不仅显著延长了细胞株的开发周期、增加了生产成本及质量控制难度，更难以满足工业化生产对细胞株稳定性与表达一致性的核心要求。通过将外源基因精准靶向插入已验证的基因组位点，可在一定程度上提高稳定表达细胞系的构建效率。目前仍缺乏适用于hek293f细胞、能够同时支持外源基因高水平表达与长期稳定维持的可靠基因组整合位点。

3、因此，本领域迫切需要开发一种适用于hek293f细胞的具有稳定、高效表达能力的理想基因组整合位点，对于加快高产稳定重组蛋白生产细胞系的构建、降低细胞株开发成本以及提高生产过程的一致性与可控性，具有重要的理论意义和应用价值。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种适用于hek293f细胞的具有稳定、高效表达能力的理想基因组整合位点，对于加快高产稳定重组蛋白生产细胞系的构建、降低细胞株开发成本以及提高生产过程的一致性与可控性，具有重要的理论意义和应用价值。

2、本发明第一方面提供了一种分离的核酸分子，所述核酸分子包含位于人12号染色体的dera基因座的至少一部分序列，所述序列能够作为外源基因定点整合的靶标区域。

3、在另一优选例中，所述核酸分子包含dera基因的内含子1和/或内含子6区域的全部或部分核苷酸序列。

4、在另一优选例中，所述内含子1区域包含位于人12号染色体第15,911,415位点至第15,956,935位点之间的整合位点。

5、在另一优选例中，所述内含子1区域包含位于人12号染色体第15,929,716位点至第15,944,821位点附近的整合位点。

6、在另一优选例中，所述内含子6区域包含位于人12号染色体第15,982,437位点至第16,032,541位点之间的整合位点。

7、在另一优选例中，所述内含子6区域包含位于人12号染色体第15,988,181位点至第16,005,385位点之间的整合位点。

8、在另一优选例中，所述内含子1区域包含选自下组的一个或多个整合位点：

9、（a）对应于seq id no: 1所示sgrna靶向的整合位点；

10、（b）对应于seq id no: 2所示sgrna靶向的整合位点。

11、在另一优选例中，所述内含子6区域包含选自下组的一个或多个整合位点：

12、（a）对应于seq id no: 3所示sgrna靶向的整合位点；

13、（b）对应于seq id no: 4所示sgrna靶向的整合位点；

14、（c）对应于seq id no: 5所示sgrna靶向的整合位点。

15、在另一优选例中，所述外源基因编码目标蛋白，所述目标蛋白选自下组：多肽、抗体、抗原、融合蛋白、酶、激素、细胞因子、病毒样颗粒的组成蛋白、重组病毒颗粒的组成蛋白、或其他功能性蛋白质。

16、在另一优选例中，所述组成蛋白在细胞内表达后能够进一步组装形成病毒样颗粒或重组病毒颗粒。

17、在另一优选例中，所述核酸分子包含选自seq id no: 1-5中任一项所示的sgrna靶向的核苷酸序列。

18、在本发明第二方面，提供了一种重组载体或载体组合，所述载体或载体组合包含：

19、（a）用于靶向本发明第一方面中所述的核酸分子的核酸引导序列；和/或

20、（b）含有外源基因的表达盒，所述表达盒两侧设有与所述核酸分子同源的臂序列。

21、在另一优选例中，所述载体或载体组合还包含编码定点核酸酶的序列。

22、在另一优选例中，所述定点核酸酶为crispr相关核酸酶、锌指核酸酶或转录激活样效应因子核酸酶。

23、在另一优选例中，所述crispr相关核酸酶包括cas9核酸酶或其变体。

24、在另一优选例中，所述核酸引导序列为向导rna（grna）或单向导rna（sgrna）。

25、在另一优选例中，所述核酸引导序列为如seq id no:1-5中任一所示。

26、在本发明第三方面，提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞包含如本发明第一方面所述的分离的核酸分子，且所述dera基因座的至少一部分区域内整合有外源基因。

27、在另一优选例中，所述区域包含所述dera基因座的内含子1和/或内含子6区域。

28、在另一优选例中，所述外源基因定点整合于所述dera基因座的内含子1和/或内含子6区域。

29、在另一优选例中，所述内含子1区域包含选自下组的一个或多个整合位点：

30、（a）对应于seq id no: 1所示sgrna靶向的整合位点；

31、（b）对应于seq id no: 2所示sgrna靶向的整合位点。

32、在另一优选例中，所述内含子6区域包含选自下组的一个或多个整合位点：

33、（a）对应于seq id no: 3所示sgrna靶向的整合位点；

34、（b）对应于seq id no: 4所示sgrna靶向的整合位点；

35、（c）对应于seq id no: 5所示sgrna靶向的整合位点。

36、在另一优选例中，所述宿主细胞为人胚肾细胞。

37、在另一优选例中，所述宿主细胞包括hek293细胞及其衍生细胞。

38、在另一优选例中，所述宿主细胞为hek293f细胞。

39、在本发明第四方面，提供了一种生产目标蛋白的方法，所述方法包括：

40、（a）提供本发明第三方面所述的宿主细胞；

41、（b）在适于所述目标蛋白表达的条件下培养所述宿主细胞；以及

42、（c）从培养体系中分离或回收所述目标蛋白。

43、在另一优选例中，所述目标蛋白为igg抗体。

44、在另一优选例中，所述培养为fed-batch培养。

45、在本发明第五方面，提供了一种构建重组细胞株的方法，所述方法包括：

46、将外源基因通过定点整合方式插入dera基因座的内含子1和/或内含子6区域中，获得整合有所述外源基因的宿主细胞。

47、在另一优选例中，所述方法还包括对所述宿主细胞进行单克隆化筛选的步骤。

48、在另一优选例中，所述定点整合通过选自下组的系统来实现的：crispr/cas系统、talen系统、zfn系统和/或重组酶介导的整合系统。

49、在另一优选例中，所述crispr/cas系统为crispr/cas9系统。

50、在本发明第六方面，提供了如本发明第一方面所述的核酸分子、或本发明第三方面所述的宿主细胞在制备重组蛋白或构建重组细胞株中的应用。

51、在另一优选例中，所述重组蛋白选自下组：抗体、融合蛋白、细胞因子、酶、或病毒样颗粒（vlp）的组成蛋白。

52、在另一优选例中，所述重组细胞株为用于生产目标蛋白的hek293细胞或hek293f细胞。

53、在本发明第七方面，提供了如本发明第一方面所述的核酸分子、或本发明第三方面所述的宿主细胞在生产目标蛋白或药物中的应用。

54、在另一优选例中，所述目标蛋白为igg抗体、病毒样颗粒、或重组病毒颗粒的组成蛋白。

55、在另一优选例中，所述药物为包含所述目标蛋白的药物组合物，所述药物用于治疗肿瘤或自身免疫性疾病，或用作疫苗。

56、应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。