一种蛋白不稳定化结构域及其应用的制作方法

本发明属于生物，具体涉及一种蛋白不稳定化结构域及其应用。

背景技术：

1、蛋白质稳态（proteostasis）维持是细胞生命活动的基础，其涉及蛋白质的合成、折叠、运输与降解等过程。在细胞命运转换、信号通路调节、胚胎发育、免疫应答以及组织再生等关键生物过程中，细胞往往需要动态调控蛋白丰度，以实现转录网络、表观状态以及代谢程序的重塑。通过调控蛋白稳定性和降解速率实现蛋白丰度变化，是研究蛋白功能、解析调控通路以及构建工程化调控体系的重要手段。

2、现有与蛋白稳态调控相关的技术大致可分为两类：一类为诱导型蛋白降解系统，其通常借助外源小分子、抗体或额外识别组分，在特定条件下诱导目标蛋白降解；另一类为天然或工程化蛋白不稳定化元件，其通常通过与目标蛋白融合表达，降低融合蛋白的稳态水平。不同技术路线具有不同适用场景。

3、目前已知的一些天然降解信号或不稳定化元件包括pest（脯氨酸(p)、谷氨酸(e)、丝氨酸(s)、苏氨酸(t)）序列、n-end rule（n端规则）相关序列、odc（鸟氨酸脱羧酶）降解信号以及部分短线性基序。上述元件在蛋白稳态研究和工程化应用中具有重要价值，但其在不同蛋白背景中的作用效果可能受到融合位置、蛋白构象、细胞类型及表达环境等因素影响。因此，进一步发现和开发具有不同序列来源及作用特征的蛋白不稳定化结构域，不仅可拓展现有蛋白稳态调控元件的类型，也可为融合蛋白稳态调节、蛋白功能研究及相关筛选应用提供新的工具。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种蛋白不稳定化结构域，以及包含该结构域的核酸分子、融合蛋白、重组表达载体、工程化细胞和相关应用。该蛋白不稳定化结构域来源于wdr33基因经内含子加尾产生的转录本所编码蛋白同工型wdr33-ipap。

2、wdr33是真核生物mrna 3′端加工复合体cpsf的组成成分之一。cpsf 作为mrna 3′端加工machinery的核心亚复合体，参与pre-mrna的切割和加尾过程。已有研究表明，wdr33全长蛋白（wdr33-fl）具有高度保守的结构域，其功能主要集中在rna加尾信号序列（polyasignal sequence, pas）的识别。

3、内含子加尾（intronic polyadenylation, ipa）是指转录本在基因内含子区域发生提前切割和加尾的加工方式，可产生不同于全长转录本的rna异构体。ipa发生于基因内部，不仅可调控全长转录本的表达，其产生的rna可进一步翻译形成特异的蛋白产物。由于ipa转录本产生的蛋白通常发生c端截短，并携带内含子来源的特异序列，其功能可能不同于对应的全长蛋白。

4、本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

5、本发明的技术方案之一为提供一种含蛋白不稳定化结构域的蛋白，所述蛋白不稳定化结构域能降低与其连接的目的蛋白组成的融合蛋白的稳态水平，所述蛋白不稳定化结构域为如下任意一种：

6、1）氨基酸序列如seq id no.1所示的片段；

7、2）氨基酸序列如seq id no.2所示的片段。

8、所述蛋白不稳定化结构域可来源于wdr33-ipap的天然蛋白片段，也可以通过化学合成或基因工程方法获得。本发明所述蛋白不稳定化结构域较佳地来源于哺乳动物wdr33基因ipa产生的wdr33-ipap蛋白c端区域。

9、本发明的技术方案之二为提供一种核酸分子，其编码如上述技术方案之一中所述的蛋白不稳定化结构域。

10、所述核酸可以为dna或rna，优选为双链dna，包含编码如seq id no.1所示氨基酸序列的开放阅读框。所述核酸可以为源自哺乳动物wdr33-ipap的天然编码序列，也可以为经过密码子优化的合成序列，以提高其在目标细胞中的表达效率。

11、在一较佳实施方式中，所述核酸通过基因合成方式直接获得，其编码序列（cds）从起始密码子atg开始，到终止密码子（如taa、tag或tga）结束，中间不含内含子。所述编码序列可根据宿主细胞的密码子使用偏好进行优化，以提高蛋白不稳定化结构域在不同细胞系统中的表达效率。本发明还包括上述编码序列的功能性变体，包括但不限于一个或多个核苷酸的替换、插入或缺失，只要仍编码具有降解活性的蛋白序列即可。

12、在一些具体实施方式中，所述核酸分子的核苷酸序列分别如seq id no.3和seqid no.4所示。

13、本发明的技术方案之三为提供一种融合蛋白，所述融合蛋白包括如上述技术方案之一中所述的蛋白不稳定化结构域、以及与所述蛋白不稳定化结构域连接的目的蛋白。

14、在一些具体实施方式中，所述目的蛋白连接于所述蛋白不稳定化结构域的n端或c端。

15、在一些具体实施方式中，所述目的蛋白为报告蛋白。

16、在一些具体实施方式中，所述报告蛋白为荧光蛋白或蛋白标签，示例性的，所述荧光蛋白为绿色荧光蛋白或红色荧光蛋白，蛋白标签如flag标签。

17、本发明的技术方案之四为提供一种重组表达载体，其包含编码如上述技术方案之三所述融合蛋白的核酸片段。

18、所述重组表达载体可通过本领域常规分子克隆方法（如限制性酶切-连接、gibson组装、gateway 克隆等）将编码如seq id no.1所示的蛋白不稳定化结构域和目的蛋白的核酸克隆至各种表达载体构建而成。

19、所述表达载体较佳地包括本领域常用的真核或病毒表达载体，如pcdna系列质粒、pcmv系列表达质粒、慢病毒载体、腺相关病毒（aav）载体等，所述载体优选含有强启动子（如cmv、ef1α、pgk启动子）以驱动融合蛋白表达。

20、较佳地，可通过下述方法制得本发明所述重组表达载体：

21、首先合成编码目标蛋白与如seq id no.1所示蛋白不稳定化结构域融合的dna序列片段，通过限制性酶切-连接、gibson组装、gateway克隆等合适方式即可构建包含所述蛋白不稳定化结构域及其融合蛋白编码序列的重组表达载体。

22、在一优选实施例中，本发明构建了cmv启动子驱动的真核表达载体，用于表达egfp-104aa融合蛋白或待研究的目标蛋白-104aa融合蛋白。该类载体可用于瞬时表达相关验证。

23、在另一优选实施例中，本发明构建了ef1α启动子驱动的真核表达载体，用于表达egfp-104aa融合蛋白或待研究的目标蛋白-104aa融合蛋白。该类载体可用于稳定表达相关验证或病毒包装。

24、本发明的技术方案之五为提供一种工程化细胞，其包含如上述技术方案之四所述的重组表达载体。

25、所述工程化细胞可通过将所述重组表达载体导入宿主细胞中获得。所述导入方式可为本领域常规采用的转染、转导或感染方法。所述宿主细胞可以为本领域常规使用的多种真核细胞，只要能够接受所述重组表达载体并表达所述融合蛋白即可。优选地，所述宿主细胞选自：hek293或hek293t 细胞、hela细胞、nih3t3细胞、a549细胞、c2c12细胞以及小鼠或人来源的原代细胞（如肌肉干细胞等）。

26、在一些实施方式中，可采用脂质体转染、电转染等方法将所述重组表达载体导入宿主细胞，以获得瞬时表达所述融合蛋白的工程化细胞；在适当筛选条件下，亦可获得稳定表达所述融合蛋白的工程化细胞。

27、在另一些实施方式中，可先将所述重组表达载体与病毒包装所需载体共同导入包装细胞，以制备重组病毒颗粒；随后通过病毒感染或转导方式将所述重组表达载体导入宿主细胞，从而获得稳定表达本发明蛋白不稳定化结构域融合蛋白的工程化细胞或稳定细胞系。

28、所述工程化细胞可用于融合蛋白稳态调控研究、泛素-蛋白酶体系统活性检测、机制验证及相关筛选应用。

29、本发明的技术方案之六为提供如上述技术方案之四所述的重组表达载体在筛选调控泛素-蛋白酶体系统功能的相关分子因子中的应用。

30、本发明通过构建稳定表达荧光报告蛋白-蛋白不稳定化结构域或其他报告蛋白-蛋白不稳定化结构域融合蛋白的细胞系，将其作为泛素-蛋白酶体活性敏感报告系统，用于筛选：

31、新型蛋白酶体抑制剂；

32、泛素活化酶（e1）、泛素结合酶（e2）、泛素连接酶（e3）调节剂；

33、去泛素化酶抑制剂；

34、影响降解通路的其他小分子调控因子。

35、该类筛选体系以融合蛋白信号的降低或恢复作为检测指标，可用于高通量药物筛选和机制研究。

36、在一些实施方式中，本发明的蛋白不稳定化结构域还可用于：

37、功能基因组学中，对具有rna与蛋白双功能的基因进行“蛋白功能剥离”，即在保留转录本rna功能的同时，通过表达如seq id no.1所示的蛋白不稳定化结构域特异性清除蛋白产物；

38、疾病模型构建中，用于模拟特定蛋白在疾病状态下的功能缺失或动态变化。

39、本发明的技术方案之七为提供一种降低融合蛋白稳态水平的方法，其包括将如上述技术方案之一所述的蛋白不稳定化结构域与目的蛋白融合表达。

40、与现有技术相比，本发明具有以下优点：

41、（1）本发明提供了来源于wdr33-ipap c端的104个氨基酸蛋白不稳定化片段。实施例表明，该片段内部包含多个有助于降低蛋白稳态水平的功能子区段，并在本发明所测试的细胞背景中能够降低融合蛋白的稳态水平。

42、（2）本发明的蛋白不稳定化结构域介导的稳态降低效应可被蛋白酶体抑制剂或泛素活化酶抑制剂拮抗，提示其与泛素-蛋白酶体相关降解途径有关。

43、（3）本发明的蛋白不稳定化结构域可用于融合蛋白稳态调控、泛素-蛋白酶体系统活性检测、相关机制研究及筛选模型构建。