编码人源RPGR蛋白的多核苷酸、表达盒、载体及其应用的制作方法

本发明属于生物医药，具体涉及一种编码人源rpgr蛋白的多核苷酸、表达盒、载体及其应用。

背景技术：

1、视网膜色素变性（retinitis pigmentosa，rp）作为一种常见的遗传性视网膜疾病，具有高度的遗传异质性，临床以进行性视杆细胞与视锥细胞退化为核心特征，全球发病率约为1/4000。在众多遗传亚型中，x连锁视网膜色素变性（xlrp）约占全部rp病例的8%-16%。与其他常染色体遗传亚型相比，xlrp的临床表现更为严重，患者通常在青少年期即出现明显的夜盲与视野缩窄，并快速进展至中心视力丧失，致盲风险极高。现有研究表明，超过70%以上的xlrp是由编码视网膜色素变性gtp酶调节因子（retinitis pigmentosagtpase regulator，rpgr）的基因突变引起。

2、rpgr有多种剪接异构体，其中rpgrorf15是视网膜感光器细胞中最主要表达的异构体，重要的功能结构域包括由外显子3-10编码的染色体凝聚调节因子1（chromosomecondensation regulator 1，rcc1）样结构域以及富含谷氨酸和甘氨酸重复的orf15外显子编码的结构域，而该重复区域的谷氨酰化也是rpgr发挥功能的关键。rpgrorf15定位在感光细胞的连接纤毛，参与感光细胞连接纤毛的稳定与外节蛋白的选择性运输，rpgr的突变会导致外节蛋白运输异常，进一步引起感光细胞的退变。目前发现的致病变异70%以上位于orf15外显子，可能与编码该区域的dna为高嘌呤重复序列有关。外源性补充有功能的rpgrorf15异构体可以有效挽救rpgr缺陷动物模型的视网膜损伤，但orf15外显子序列的高度重复性，使得复制过程很容易产生突变，也极大地挑战基因治疗载体生产过程中序列完整性的维持。因此，获得一个能够高效、稳定表达人源rpgrorf15的模板序列也是rpgr相关视网膜疾病基因治疗药物开发的难点。

3、为突破上述技术瓶颈，现有技术已展开相关探索。例如，wo2023227043a1公开了一种编码rpgr的核酸、含有该核酸的载体及腺相关病毒。该核酸经过特殊优化而使rpgrorf15的表达量显著提高，从而可以用于治疗rpgr突变引起的x连锁视网膜色素变性。又如，cn114364440a专利公开了一种包含密码子优化的人rpgr orf15外显子核苷酸序列的核酸分子。与野生型rpgr orf15相比，密码子优化的人rpgr orf15核苷酸序列稳定，测序良好，得到正确序列的克隆多，克隆序列完整不易丢失。该核酸分子能够使rpgr突变的细胞表达正确的视网膜色素变性gtp酶调节因子，具有好的基因编辑修复效率。

4、目前，尽管全球范围内已有多个针对rpgr-xlrp的基因治疗药物进入临床试验阶段，但迄今为止仍没有相关基因药物获批上市。因此，本领域亟需一种经过系统优化、能够克服高重复序列稳定性缺陷，并在视网膜感光细胞中实现高效、持久且稳定表达rpgrorf15的基因表达盒及递送载体，以填补现有技术的不足，为xlrp患者提供真正具备转化潜力的治疗方案。

技术实现思路

1、有鉴于此，为克服现有rpgr基因治疗载体在生产稳定性、表达效率及长期安全性方面的不足，提供一种经过系统优化的编码rpgrorf15蛋白的多核苷酸及其表达盒、载体、药物组合物，并阐明其在预防和/或治疗因rpgr基因功能丧失性突变引起的视网膜退行性疾病中的应用。

2、本发明的目的之一在于提供一种多核苷酸。

3、为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

4、一种多核苷酸，所述多核苷酸编码人源rpgr基因的orf15外显子；所述多核苷酸的核苷酸序列如seq id no:28所示。

5、本发明中，seq id no:28所示序列为经过优化设计的rpgr基因外显子orf15区段序列，该序列在不改变rpgr蛋白氨基酸序列的前提下，通过从头设计降低了序列中的重复单元数量，同时尽可能避免潜在的剪接供体位点及多聚腺苷酸化信号。

6、本发明的目的之二在于提供一种编码人源rpgr蛋白的多核苷酸。

7、为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

8、一种编码人源rpgr蛋白的多核苷酸，所述多核苷酸由以下序列组成：

9、1）编码rpgr外显子1-14区段的序列，如seq id no:32~seq id no:39所示；

10、2）编码rpgr外显子orf15区段的序列，所述序列为seq id no:28所示的核苷酸序列。

11、优选地，所述编码rpgr外显子1-14区段的序列和所述编码rpgr外显子orf15区段的序列依次连接得到编码全长人源rpgrorf15蛋白的多核苷酸，所述编码全长人源rpgrorf15蛋白的多核苷酸的核苷酸序列如seq id no:4~seq id no:11所示。

12、更优选地，seq id no:4由编码rpgr外显子1-14区段的seq id no:32和编码rpgr外显子orf15区段的seq id no:28依次连接组成；

13、seq id no:5由编码rpgr外显子1-14区段的seq id no:33和编码rpgr外显子orf15区段的seq id no:28依次连接组成；

14、seq id no:6由编码rpgr外显子1-14区段的seq id no:34和编码rpgr外显子orf15区段的seq id no:28依次连接组成；

15、seq id no:7由编码rpgr外显子1-14区段的seq id no:35和编码rpgr外显子orf15区段的seq id no:28依次连接组成；

16、seq id no:8由编码rpgr外显子1-14区段的seq id no:36和编码rpgr外显子orf15区段的seq id no:28依次连接组成；

17、seq id no:9由编码rpgr外显子1-14区段的seq id no:37和编码rpgr外显子orf15区段的seq id no:28依次连接组成；

18、seq id no:10由编码rpgr外显子1-14区段的seq id no:38和编码rpgr外显子orf15区段的seq id no:28依次连接组成；

19、seq id no:11由编码rpgr外显子1-14区段的seq id no:39和编码rpgr外显子orf15区段的seq id no:28依次连接组成。

20、优选地，所述编码全长人源rpgrorf15蛋白的多核苷酸的核苷酸序列如seq id no:7或seq id no:9所示。

21、更优选地，所述编码全长人源rpgrorf15蛋白的多核苷酸的核苷酸序列如seq idno:9所示。

22、本发明提供的编码全长人源rpgrorf15蛋白的多核苷酸（seq id no:4~seq id no:11）是8种经过系统优化、可直接用于构建病毒载体的完整全长cdna序列。它们是通过将8种不同的外显子1-14区段与外显子orf15区段拼接而成。其中，外显子1-14区段为经过密码子优化以适配视网膜高表达基因偏好的序列；外显子orf15区段为在不改变rpgrorf15蛋白氨基酸序列的前提下，通过从头设计以降低序列重复度、同时尽可能避免潜在剪接供体位点及多聚腺苷酸化信号而获得的稳定序列。这些序列的作用在于，通过对外显子1-14的密码子优化，适配视网膜细胞的翻译偏好，从而提升整体表达量；同时，通过保留已经过稳定性优化的orf15区段，确保了全长基因在病毒载体生产过程中的序列完整性。因此，seq id no:4~11是经过系统性筛选得到的、兼具高表达量和高稳定性的优选全长基因序列。

23、本发明的目的之三在于提供一种用于表达全长人源rpgrorf15蛋白的表达盒。

24、为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

25、一种用于表达全长人源rpgrorf15蛋白的表达盒，所述表达盒含有前述编码人rpgr蛋白的多核苷酸。

26、优选地，所述表达盒还包含启动子和终止子。

27、优选地，所述启动子为grk1启动子，其核苷酸序列如seq id no:1所示。

28、优选地，所述终止子为sv40 polya，其核苷酸序列如seq id no:3所示。

29、优选地，所述表达盒还包括内含子，所述内含子的核苷酸序列如seq id no:2所示。

30、优选地，所述用于表达全长人源rpgrorf15蛋白的表达盒的核苷酸序列如seq idno:13~seq id no:20任一所示，其包含启动子、内含子、编码全长人源rpgrorf15蛋白的多核苷酸和终止子。

31、seq id no:13~seq id no:20分别代表了8种不同外显子1-14优化策略与同一稳定orf15序列组合后的完整表达盒变体。它们的功能差异主要源于外显子1-14部分密码子优化程度的不同，这导致各序列在视网膜细胞中的表达效率存在细微差别。实验数据表明，其中优选的序列能够在体内维持长达10个月以上的稳定表达，并引导rpgrorf15蛋白准确定位至感光细胞连接纤毛，发生关键的谷氨酰化修饰，从而有效挽救rpgr突变导致的视网膜损伤。

32、更优选地，seq id no:13所示表达盒包含grk1启动子、seq id no:2所示内含子、seq id no:4所示编码全长人源rpgrorf15蛋白的多核苷酸和终止子sv40 polya；

33、seq id no:14所示表达盒包含grk1启动子、seq id no:2所示内含子、seq id no:5所示编码全长人源rpgrorf15蛋白的多核苷酸和终止子sv40 polya；

34、seq id no:15所示表达盒包含grk1启动子、seq id no:2所示内含子、seq id no:6所示编码全长人源rpgrorf15蛋白的多核苷酸和终止子sv40 polya；

35、seq id no:16所示表达盒包含grk1启动子、seq id no:2所示内含子、seq id no:7所示编码全长人源rpgrorf15蛋白的多核苷酸和终止子sv40 polya；

36、seq id no:17所示表达盒包含grk1启动子、seq id no:2所示内含子、seq id no:8所示编码全长人源rpgrorf15蛋白的多核苷酸和终止子sv40 polya；

37、seq id no:18所示表达盒包含grk1启动子、seq id no:2所示内含子、seq id no:9所示编码全长人源rpgrorf15蛋白的多核苷酸和终止子sv40 polya；

38、seq id no:19所示表达盒包含grk1启动子、seq id no:2所示内含子、seq id no:10所示编码全长人源rpgrorf15蛋白的多核苷酸和终止子sv40 polya；

39、seq id no:20所示表达盒包含grk1启动子、seq id no:2所示内含子、seq id no:11所示编码全长人源rpgrorf15蛋白的多核苷酸和终止子sv40 polya。

40、优选地，所述表达盒的核苷酸序列如seq id no:16或seq id no:18所示。

41、更优选地，所述表达盒的核苷酸序列如seq id no:18所示。

42、本发明提供的表达盒由grk1启动子、sv40内含子、kozak序列、编码人源rpgrorf15蛋白的多核苷酸序列、sv40终止子依次连接而成。

43、本发明的目的之四在于提供一种表达载体。

44、为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

45、一种表达载体，所述表达载体含有前述表达盒。

46、优选地，所述表达载体选自慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体中任一种。

47、优选地，所述腺相关病毒载体选自aav1型、aav2型、aav3型、aav4型、aav5型、aav6型、aav7型、aav8型、aav9型、aav10型中的任一种或多种。

48、优选地，所述表达载体为aav2/8血清型载体。

49、优选地，所述表达载体结构为：5’端itr序列—grk1启动子—sv40内含子—kozak序列—编码人源rpgrorf15蛋白的多核苷酸序列—sv40终止子—3’端itr序列。

50、本发明的目的之五在于提供一种药物组合物。

51、为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

52、所述药物组合物包括前述多核苷酸、前述多表达盒和/或前述多表达载体，以及药学上可接受的载体。

53、本发明的目的之六在于提供一种前述多核苷酸、前述表达盒、前述表达载体和/或前述药物组合物在制备用于预防和/或治疗视网膜色素变性的药物中的应用。

54、优选地，所述视网膜色素变性为rpgr突变导致的x连锁型视网膜色素变性。

55、优选地，所述治疗为改善视网膜功能和/或修复视网膜结构。

56、优选地，所述药物的剂型包括注射剂。

57、优选地，所述药物以视网膜下腔注射或玻璃体腔注射的方式施用。

58、本发明的有益效果在于：

59、1、本发明通过对rpgrorf15区域的高度重复序列进行从头设计与参数重构，有效降低了序列重复性、同时尽可能避免潜在的危险剪接供体位点与多聚腺苷酸化信号，使得优化后的多核苷酸在质粒扩增、pcr验证及病毒包装过程中均能保持序列完整，有效克服了传统高嘌呤重复序列易发生移码突变或片段丢失的难题。

60、2、本发明采用视网膜特异性启动子grk1与sv40内含子、polya信号的协同调控，结合优选的密码子优化策略，使得外源rpgrorf15蛋白在靶细胞内可以高效表达，且蛋白能够准确定位至感光细胞连接纤毛，并发生关键的谷氨酰化修饰。动物实验数据表明，该表达体系在体内可维持长达10个月以上的稳定表达，未出现明显的脱靶毒性或表达衰减。

61、3、本发明在rpgr基因敲除小鼠模型中，经视网膜下腔注射递送本发明提供的表达载体后，受试动物的视网膜电生理指标（如明适应b波幅值）得到显著改善，视锥细胞视蛋白的异常分布得到纠正，外核层厚度有效维持，证明了该技术方案在恢复视网膜结构与功能方面的确切疗效，为xlrp患者提供了一种安全、高效且具备长期治疗前景的基因干预策略。