包含一个或多个外源3'剪接位点的载体的制作方法

本公开涉及载体，所述载体包含具有内源5'剪接位点和内源3'剪接位点的内含子，以及该内含子下游和/或内部的一个或多个外源3'剪接位点。本公开还提供编码该构建体的多核苷酸、包含该构建体的宿主细胞、其试剂盒、产生目的蛋白/增加目的蛋白的产生的方法、以及防止异常剪接/不正确剪接的方法。

背景技术：

1、在真核生物基因中，外显子（蛋白编码区）通常被内含子（非编码区）隔开。这些内含子从前体mrna中被去除，随后外显子连接在一起形成成熟的mrna。在外显子-内含子边界的核苷酸序列高度保守。在内含子中，供体位点或5'剪接位点始终以gu开头，而受体位点或3'剪接位点总是以ag结尾。分支点序列或分支位点（通常位于3'剪接位点的上游20-40个核苷酸处）保守性相对较低，但其总是含有腺嘌呤核苷酸（a）以促进剪接反应。在一些情况下，分支点序列或分支位点的腺嘌呤核苷酸（a）可以在3'剪接位点的上游数百个核苷酸处。

2、内含子在基因表达调控中发挥重要的作用。例如，人巨细胞病毒（hcmv）的主要即刻早期蛋白（ie）基因由已知最强的启动子复合物/增强子复合物之一转录。该复合物已被广泛用于表达载体中，以在哺乳动物细胞中驱动重组蛋白（包括抗体）的产生。位于ie基因的5'非翻译区（5' utr）中的内含子a的存在显著增强了cmv启动子的转录效率。

3、与hcmv的内含子a类似，许多哺乳动物基因具有位于5' utr中的转录起始位点的下游100个碱基对之内的内含子。许多内含子可以通过影响基因表达（从转录起始到翻译）的几乎每个步骤来增强基因表达并提高转录本水平（shaul, 2017; rose 2019）。然而，ime的详细分子机制仍有待阐明。

4、商业表达载体通常包含在5' utr中插入的内含子。这些内含子可以增强报告基因（诸如萤光素酶或gfp）的表达水平。它们还增加分泌糖蛋白的生产率（chapman等人，1991；xu等人，2001；xia等人，2006）。除非目的基因在orf内部含有3'剪接位点，否则这一概念是成立的。在这种情况下，载体中内含子的5'剪接位点可能绕过其通常的3'位点，而与orf的3'位点连接，从而产生截短的mrna。本发明人在此类载体中表达抗体重链时观察到这种异常剪接的频繁发生。这种异常剪接总是导致抗体产生的显著降低。

5、因此，需要有效防止/减少此类异常剪接的表达载体/方法，从而在宿主细胞（诸如cho细胞）中大幅增加抗体产生。

技术实现思路

1、在一个方面，本公开提供了载体，所述载体包含具有内源5'剪接位点和内源3'剪接位点的内含子，以及该内含子下游和/或内部的一个或多个外源3'剪接位点。

2、在一个实施方案中，所述外源3'剪接位点在所述内含子的下游，例如紧邻所述内含子的下游。

3、在一个实施方案中，所述外源3'剪接位点放置在内含子与外显子或目的基因的开放阅读框之间，诸如其中所述外源3'剪接位点放置在内含子3'端的下游并且紧邻外显子之前。

4、在一个实施方案中，所述外源3'剪接位点在所述内含子内部，例如其中所述外源3'剪接位点放置在内含子的分支点的下游。

5、在一个实施方案中，所述3'外源剪接位点放置在所述分支点与所述内含子的3'剪接位点之间。

6、在一个实施方案中，所述3'外源剪接位点放置在所述分支点与所述内含子的5'剪接位点之间。

7、在一个实施方案中，所述外源3'剪接位点是衍生自/获自另一内含子的3'剪接位点。

8、在一个实施方案中，所述外源3'剪接位点是衍生自/获自基因的第一个内含子。

9、在一个实施方案中，所述外源3'剪接位点包含从所述分支点延伸至在内含子的3'端的剪接位点（ag位点）的序列。

10、在一个实施方案中，所述外源3'剪接位点包含从所述分支点延伸至在内含子的3'端的剪接位点（ag位点）的序列，并且不包含所述内含子的5'剪接位点（gt位点）。

11、在一个实施方案中，所述外源3'剪接位点还包含所述分支点的上游的序列，例如所述分支点的上游1-25个或更多个核碱基，诸如所述分支点的上游1-50、1-100、1-150或1-200个核碱基。

12、在一个实施方案中，所述外源3'剪接位点包含从所述分支点的上游延伸至在内含子的3'端的剪接位点（ag）的序列，不包含所述内含子的5'剪接位点（gt）。

13、在一个实施方案中，所述外源3'剪接位点包含在其分支点处的腺嘌呤核苷酸。

14、在一个实施方案中，所述外源3'剪接位点包含、或，其中下划线处为a分支点。

15、在一个实施方案中，所述外源3'剪接位点包含aggtt，例如其中所述外源3'剪接位点在3'端以aggtt结尾。

16、在一个实施方案中，所述外源3'剪接位点缺乏翻译起始密码子，例如atg，例如其中所述外源3'剪接位点经修饰以去除任何atg基序。

17、在一个实施方案中，所述外源3'剪接位点是选自包括以下的组中的一个或多个3'剪接位点：来自sp6内含子的3'剪接位点、基于所有人类内含子的共有序列的3'剪接位点、人β-球蛋白内含子的3'剪接位点等。

18、在一个实施方案中，所述外源3'剪接位点是选自由以下组成的组中的一个或多个：

19、a. sp6分支点和3'剪接位点共有序列（3' ss a）：

20、，

21、b.基于所有人类基因的共有序列的分支点与3'剪接位点（3' ss b）：

22、，以及

23、c. b-珠蛋白内含子（3' ssc）：

24、，

25、其中下划线序列为围绕a（粗体）的保守序列，以及

26、d.与上述任一项至少80%相同的其变体。

27、在一个实施方案中，所述外源3'剪接位点是选自由以下组成的组中的一个或多个：

28、a. sp6分支点和3'剪接位点共有序列（3' ss a）：

29、，

30、b.基于所有人类基因的共有序列的分支点与3'剪接位点（3' ss b）：

31、，以及

32、c. b-珠蛋白内含子（3' ss c）：

33、，

34、其中下划线序列为围绕a（粗体）的保守序列。

35、在一个实施方案中，所述载体包含两个或更多个外源3'剪接位点，例如两个、三个、四个或五个外源3'剪接位点，特别是三个外源3'剪接位点。

36、在一个实施方案中，所述载体包含：

37、a.来自sp6内含子的3'剪接位点和基于所有人类内含子的共有序列的3'剪接位点；

38、b.来自sp6内含子的3'剪接位点和人β-球蛋白内含子的3'剪接位点；

39、c.基于所有人类内含子的共有序列的3'剪接位点和人β-球蛋白内含子的3'剪接位点；

40、d.来自sp6内含子的3'剪接位点、基于所有人类内含子的共有序列的3'剪接位点、以及人β-球蛋白内含子的3'剪接位点；或

41、e.来自sp6内含子的3'剪接位点、基于所有人类内含子的共有序列的3'剪接位点、以及人β-球蛋白内含子的3'剪接位点的融合体。

42、在一个实施方案中，所述载体包含：

43、a. seq id no: 1和seq id no: 2；

44、b. seq id no: 1和seq id no: 3；

45、c. seq id no: 2和seq id no: 3；

46、d. seq id no: 1、seq id no: 2和seq id no: 3；

47、e. seq id no: 1、seq id no: 2和seq id no: 3的融合体：

48、gccactgactctttcctttgtcctgttcccatttccaggttaatactctgagtccaaaccgggccccgccactaactctttcctttttctttttttttttcttttcaggttaatactctgagtccaaaccgggcccctctgctaaccatgttcatgccttcttctttttcctacaggtt (seq id no: 4)；或

49、f.与上述任一项至少80%相同的其变体。

50、在一个实施方案中，所述内含子选自包括以下的组：未经改变而天然存在的内含子，例如来自cmv基因组的内含子a，或者重组内含子/工程化内含子，例如天然存在的内含子的截短版本。

51、在一个实施方案中，所述内含子为来自cmv基因组的内含子a或来自cmv基因组的内含子a的截短版本。

52、在一个实施方案中，所述内含子包含其自身的5'剪接位点、分支点、以及其自身的（内源的）3'剪接位点。

53、在一个实施方案中，所述载体包含：

54、。

55、在一个实施方案中，所述内含子是紧邻启动子下游的第一个内含子（例如内含子1或内含子a）。

56、在一个实施方案中，所述载体还包含一个或多个启动子，例如选自由以下组成的组中的启动子：ref1a启动子、heef2启动子、cmv启动子、ef-1α启动子、ef2启动子和sv40启动子。

57、在一个实施方案中，所述载体包含编码目的基因的多核苷酸，例如抗体，诸如抗体重链和/或抗体轻链。

58、在一个实施方案中，所述载体包含：

59、。

60、在一个实施方案中，所述载体包含编码带有信号肽的抗体重链和/或抗体轻链的多核苷酸。

61、在一个实施方案中，所述载体包含一个或多个多核苷酸，所述多核苷酸编码一种或多种以下抗体重链或抗体轻链的信号肽：

62、，以及

63、与上述任一项具有至少80%的序列同一性的变体。

64、在一个实施方案中，所述载体包含多核苷酸，所述多核苷酸具有与选自由以下组成的组的序列至少75%相同的序列：

65、

66、在一个实施方案中，所述载体包含多核苷酸，所述多核苷酸编码选自由以下组成的组中的一个或多个重链的开放阅读框（orf）：曲妥珠单抗(trastuzumab)、利妥昔单抗(rituximab)、ighv1家族的成员诸如ighv1-46、以及ighv3家族的成员诸如ighv3-23。

67、在一个实施方案中，所述载体还包含多聚腺苷酸尾信号。

68、在一个实施方案中，所述载体包含如seq id no: 24所示的核酸序列。

69、在一个实施方案中，所述载体选自包括以下的组：pbee（带内含子的大鼠ef1-α启动子）、pcho1.0（带内含子的人ef-2启动子）、pcdna3.1（不带内含子的cmv启动子）、pcmv-内含子a（带内含子a的cmv启动子）等。

70、在一个方面，本公开提供了多核苷酸，所述多核苷酸编码如上所述的载体。

71、在一个方面，本公开提供了宿主细胞，所述宿主细胞包含如上所述的载体和/或多核苷酸。

72、在一个方面，本公开提供了试剂盒或系统，所述试剂盒或系统含有根据前述任一项权利要求的载体或细胞。

73、在一个方面，本公开提供了产生目的蛋白（或增加目的蛋白的产生）的方法，所述方法包括：

74、在表达系统中提供如上所述的载体。

75、在一个实施方案中，当开放阅读框（orf）放置在内含子（诸如内含子a）的下游时，所述方法在存在异常剪接（或不正确剪接）的情况下增加目的蛋白的产生。

76、在一个实施方案中，即使在不存在异常剪接（或不正确剪接）的情况下，所述方法增加目的蛋白的产生。

77、在一个方面，本公开提供了防止异常剪接（或不正确剪接）的方法，所述方法包括：

78、在表达系统中提供如上所述的载体。

79、在一个方面，本公开提供了产生目的蛋白（或增加目的蛋白的产生）的方法，所述方法包括：

80、在启动子区域下游内含子的下游和/或内部提供和/或引入外源3'剪接位点。

81、在一个方面，本公开提供了防止目的基因的表达中异常剪接（或不正确剪接）的方法，所述方法包括：

82、在启动子区域下游内含子的下游和/或内部提供和/或引入外源3'剪接位点。

83、在一个实施方案中，所述方法在启动子区域的内含子3'剪接位点的下游提供和/或引入外源3'剪接位点，例如其中所述外源3'剪接位点紧邻内含子的下游。

84、在一个实施方案中，所述方法在启动子区域的内含子3'剪接位点内部提供和/或引入外源3'剪接位点，例如在所述分支点和所述内含子的5'剪接位点之间。

85、在一个实施方案中，所述载体包含所述目的基因，所述目的基因包含内含子，所述内含子包含5'内源剪接位点和3'内源剪接位点。

86、在一个实施方案中，所述外源3'剪接位点距离所述内含子约0至50个核碱基。

87、在一个实施方案中，所述外源3'剪接位点放置在内含子与外显子之间，例如在内含子的3'端并且紧邻外显子之前。

88、在一个实施方案中，所述外源3'剪接位点选自包括以下的组：sp6内含子的3'剪接位点、基于所有人类内含子的共有序列的3'剪接位点、人β-球蛋白内含子的3'剪接位点等。

89、在一个实施方案中，其中所述内含子是紧邻启动子的下游的第一个内含子（即内含子a或内含子1）。

90、在一个实施方案中，所述启动子选自由以下组成的组：ref1a启动子、heef2启动子、cmv启动子、来自其他哺乳动物的ef-1α启动子和ef2启动子、和sv40启动子。

91、在一个实施方案中，所述外源3'剪接位点被引入选自由以下组成的组中的启动子/内含子对中：cmv/内含子a和ref1a/内含子1。

92、定义

93、如本文所用，“表达构建体”通常以从5'端到3'端的方式描述，应理解所述构建体可以是环状dna分子。

94、如本文所用，术语“外源3'剪接位点”是指并非构建体中已存在的内含子中固有具备，而是被外部引入所述构建体/载体中的3'剪接位点（也称3' ss）。也就是说，所述构建体/载体在其原始状态下不包含所述外源剪接位点。本发明将一个或多个外源3'剪接位点引入至所述构建体/载体中。

95、除非另有规定，“外源3'剪接位点”不仅限于位于内含子的3'端的ag位点。例如，它可以包含从所述分支点到在所述内含子的3'端的剪接位点（ag位点）的dna序列。它也可以进一步包含所述分支点的上游的内含子序列的部分。然而，它通常不包含5'剪接位点。因此，如本文所用，术语“外源3'剪接位点”包含内含子的部分但缺乏5'剪接位点（gt位点）。具体而言，“外源3'剪接位点”跨越至少从所述分支点到在所述内含子的3'端的3'剪接位点的dna序列。因此，每个额外的外源3'剪接位点可以含有跨越至少从所述分支点到在相应天然存在的内含子的3'端的剪接位点（ag位点）的dna序列（参见实施例例如在图6中的3' ss a、3' ss b和3' ss c）。

96、如本文所用，术语“5'剪接位点”是指发现于内含子5'端的剪接供体位点。所述5'剪接位点包含在更大且高度保守性较低的区域内部几乎不变的序列（即在mrna中为gu，在dna中为gt）。因此，缺乏或不包含5'剪接位点的外源3'剪接位点不具有gt位点。

97、如本文所用，术语“下游”是指在参考点的3'位点端的位置。因此，内含子下游的剪接位点是位于与内含子的3'端距离一个或多个核碱基的剪接位点。

98、如本文所用，术语“上游”是指在参考点的5'位点端的位置。因此，内含子上游的剪接位点是位于与内含子的5'端距离一个或多个核碱基的剪接位点。

99、如本文所用，术语“内含子内部”是指内含子本身之内的任何位置，而非5'位点端之前（即内含子的上游）或3'位点端之后（即内含子的下游）的位置。因此，“内含子内部”的剪接位点在其3'端和5'端两侧均将邻接至少一个内含子的核碱基。

100、如本文所用，术语“内源剪接位点”是指整合入构建体中的天然存在的内含子中所固有存在的天然剪接位点。也就是说，所述构建体/载体在其原始状态下包含所述内源剪接位点。不希望受理论束缚，本公开的发明人发现，没有额外的外源剪接位点（另一内含子的3'剪接位点）的内源剪接位点可引起目的基因的异常剪接（或不正确剪接），从而导致目的蛋白的不完整表达或截短的表达。

101、如本文所用，术语“紧邻内含子的下游”通常是指距内含子的3'端约0至50个或更多个核碱基的距离。

102、如本文所用，术语“内含子”是指发现于多核苷酸中的通常在前体mrna成熟过程中通过剪接被去除的非编码区。内含子可以按其在基因内部或启动子的下游的顺序依次编号。因此，基因中紧邻启动子之后的第一个非编码区可称为内含子1。在特定的启动子中，内含子可相应地命名。例如，在cvm启动子中，内含子a是cvm启动子的下游的内含子。因此，在一些实例中，如本文所述的额外剪接位点/外源剪接位点可在紧邻内含子a或内含子1的下游提供。

103、正如本领域所理解的，内含子通常可以发现于转录起始位点的下游的100个核苷酸之内，但在翻译起始位点atg的上游。去除该内含子不改变开放阅读框。许多内含子（诸如内含子a）已知具有增强基因表达的功能。

104、如本文所用，术语“分支点”或“分叉点”是指通常含有位于3'受体剪接位点的上游的保守的腺苷（a）核苷酸的短基序。所述分支点对于rna剪接机制至关重要，并在剪接过程中形成套索结构，该结构是内含子被完全切除之前的中间形式。

105、如本文所用，“信号肽”是在促进蛋白从细胞中的分泌发挥重要作用的肽。

106、如本文所用，术语“异常”剪接或“不正确”剪接是指内含子中的内源剪接位点引起目的蛋白发生异常/非期望的截短或不完整表达的事件。在一些实例中，当发生异常剪接时，所产生的蛋白与目的蛋白的完整表达相比通常是截短的版本或不完整的版本。

107、术语“和/或”，例如“x和/或y”应理解为意指“x和y”或“x或y”，并且应被认为对两种含义或对任一含义提供明确支持。

108、此外，在本文的描述中，无论何时使用“基本上”一词，均应理解为包括但不限于“完全”或“彻底”等。另外，无论何时使用诸如“包含”、“包括”等术语，均旨在作为非限制性描述性的语言，即它们广义地包括此类术语之后列举的要素/组分，以及未明确列举的其他组分。例如，当使用“包含”时，提及“一个”特征也旨在提及该特征的“至少一个”。术语诸如“由……组成”、“组成”等在适当的语境下可被视为诸如“包含”、“包括”等术语的子集。因此，在使用诸如“包含”、“包括”等术语的本文公开的实施方案中，应当理解这些实施方案为使用诸如“由……组成”、“组成”等术语的相应实施方案提供了教导。此外，无论何时使用诸如“约”、“大约”等术语，通常意指合理的变动，例如所公开数值的±5%的变动，或所公开数值的4%的变动，或所公开数值的3%的变动，所公开数值的2%的变动或所公开数值的1%的变动。

109、此外，在本文的描述中，某些数值可以以范围的形式公开。显示范围端点的数值旨在说明优选的范围。无论何时描述了范围，其旨在使该范围涵盖并教导该范围之内的所有可能的子范围以及单独的数值。也就是说，范围的端点不应被解释为不可变更的限制。例如，对1%至5%的范围的描述旨在明确公开1%至2%、1%至3%、1%至4%、2%至3%等的子范围，以及该范围之内的单独数值诸如1%、2%、3%、4%和5%。应当理解，范围之内的单独数值也包括整数、分数和小数。此外，无论何时描述了范围，其还旨在使该范围涵盖并教导自所显示数值端点起多至两位额外的小数位或有效数字（如适用）的数值。例如，对1%至5%的范围的描述旨在明确公开范围1.00%至5.00%以及范围1.0%至5.0%，以及跨越该范围的所有其中间值（诸如1.01%、1.02%……4.98%、4.99%、5.00%和1.1%、1.2%……4.8%、4.9%、5.0%等）。上述具体公开的意图适用于任何深度/广度的范围。

110、此外，当描述一些实施方案时，本公开可将方法和/或过程公开为特定的步骤顺序。然而，除非另有要求，应当理解的是，所述方法或过程不应限于所公开的特定的步骤顺序。其他步骤顺序也是可能的，本文所公开的步骤的特定顺序不应被解释为不适当的限制。除非另有要求，本文所公开的方法和/或过程不应限制于按所写的顺序执行的步骤，步骤的顺序可以变化并且仍然保持在本公开的范围之内。

111、此外，应当理解的是，虽然本公开提供了具有本文所讨论的特征/特性的一个或多个的实施方案，但这些特征/特性的一个或多个也可以在其它替代性的实施方案中被放弃，并且本公开为此类放弃和这些相关的替代性的实施方案提供了支持。

112、实施方案的描述

113、本领域技术人员将理解，在不脱离本公开广义描述的精神或范围的情况下，可以对本文公开的实施方案进行其他变化和/或修改。例如，在本文的描述中，不同的示例性的实施方案的特征可以在不同的示例性的实施方案之间混合、组合、互换、整合、采用、修改、包含等。因此，本实施方案在所有方面均被视为说明性的而非限制性的。

114、本公开技术的关键在于，在表达构建体/载体中常规的3'剪接位点的下游插入一个或多个（例如一个、两个或三个）额外的3'剪接位点（dna片段）。在这些额外的（外源）3'剪接位点的存在下，抗体转录本的异常剪接被完全防止，从而显著提高了基因表达和抗体产生。出乎意料的是，本公开的新型构建体/新型载体与最常用的商业载体相比实现了超过六倍的抗体产生的增加，从而确凿地证明了本发明相对于全球商业载体和现有替代方案的优越性。

115、因此，在一个方面，本公开提供了载体，所述载体包含具有内源5'剪接位点和内源3'剪接位点的内含子，以及该内含子的下游和/或内部的一个或多个外源3'剪接位点。

116、在一个方面，本公开提供了重组表达构建体，所述重组表达构建体包含一个或多个内含子以及一个或多个外显子，

117、其中所述构建体包含内含子的下游和/或上游的一个或多个外源剪接位点。

118、在一个方面，本公开提供了重组表达构建体，所述重组表达构建体包含一个或多个内含子以及一个或多个外显子，

119、其中所述构建体包含内含子的下游和/或内部的一个或多个外源剪接位点。

120、在一个实施方案中，所述载体包含具有内源5'剪接位点和内源3'剪接位点的内含子，以及所述内含子的下游的一个或多个外源3'剪接位点。

121、在一个实施方案中，所述外源剪接位点在内含子的下游。不希望受理论束缚，本公开的发明人相信，所述外源剪接位点可以放置在内含子的下游的任何位点。在一些实例中，所述剪接位点距离内含子的3'端约10至20个核碱基。在一些实例中，所述剪接位点紧邻内含子的下游，或者距离内含子的3'端约0个核碱基。

122、在一些实例中，本文所述的表达构建体中的转录单元可包含两个外显子以及在它们之间的一个内含子，其中第二个外显子可包含编码待产生的蛋白的cdna开放阅读框（orf）。因此，在一些实例中，如本文所述的重组表达构建体可包含内含子单元和两个外显子单元，其中第二个外显子（即在3'端的外显子）包含编码目的蛋白的cdna开放阅读框（orf）。

123、正如本领域技术人员所能理解的，一个构建体中可以有多个表达盒。每个盒含有调控序列（例如启动子）、内含子以及随后待产生的基因的编码序列。

124、在一些实例中，所述外源剪接位点可插入至距离内含子的3'端约约0个核碱基、1个核碱基、2个核碱基、3个核碱基、4个核碱基、5个核碱基、6个核碱基、7个核碱基、8个核碱基、9个核碱基、10个核碱基、11个核碱基、12个核碱基、13个核碱基、14个核碱基、15个核碱基、16个核碱基、17个核碱基、18个核碱基、19个核碱基、20个核碱基、21个核碱基、22个核碱基、23个核碱基、24个核碱基、25个核碱基、26个核碱基、27个核碱基、28个核碱基、29个核碱基、30个核碱基、31个核碱基、32个核碱基、33个核碱基、34个核碱基、35个核碱基、40个核碱基、45个核碱基、50个核碱基、100个核碱基、200个核碱基、300个核碱基、400个核碱基、500个核碱基、600个核碱基、700个核碱基、800个核碱基、900个核碱基或1000个核碱基或更多个核碱基的位置。在一些实例中，所述剪接位点距离内含子的3'端约2至20个核碱基。在一些实例中，所述剪接位点紧邻内含子的上游和/或下游，或者距离内含子约0个核碱基。

125、在一个实施方案中，所述外源剪接位点紧邻内含子的下游。

126、在一个实施方案中，所述外源剪接位点距内含子的3'端约0至50个核碱基或更多个核碱基的距离。

127、在一个实施方案中，所述外源剪接位点距内含子的3'端约0至20个核碱基的距离。

128、在一些实例中，所述剪接位点距离内含子的3’端约0个核碱基、距离内含子的3’端约1个核碱基、距离内含子的3’端约2个核碱基、距离内含子的3’端约3个核碱基、距离内含子的3’端约4个核碱基、距离内含子的3’端约5个核碱基、距离内含子的3’端约6个核碱基、距离内含子的3’端约7个核碱基、距离内含子的3’端约8个核碱基、距离内含子的3’端约9个核碱基、距离内含子的3’端约10个核碱基、距离内含子的3’端约11个核碱基、距离内含子的3’端约12个核碱基、距离内含子的3’端约13个核碱基、距离内含子的3’端约14个核碱基、距离内含子的3’端约15个核碱基、距离内含子的3’端约16个核碱基、距离内含子的3’端约17个核碱基、距离内含子的3’端约18个核碱基、距离内含子的3’端约19个核碱基、距离内含子的3’端约20个核碱基、距离内含子的3’端约21个核碱基、距离内含子的3’端约22个核碱基、距离内含子的3’端约23个核碱基、距离内含子的3’端约24个核碱基、距离内含子的3’端约25个核碱基、距离内含子的3’端约26个核碱基、距离内含子的3’端约27个核碱基、距离内含子的3’端约28个核碱基、距离内含子的3’端约29个核碱基、距离内含子的3’端约30个核碱基、距离内含子的3’端约31个核碱基、距离内含子的3’端约32个核碱基、距离内含子的3’端约33个核碱基、距离内含子的3’端约34个核碱基、距离内含子的3’端约35个核碱基、距离内含子的3’端约40个核碱基、距离内含子的3’端约45个核碱基、距离内含子的3’端约50个核碱基，或者更多个核减基。

129、在一个实施方案中，所述外源剪接位点放置在内含子与外显子或目的基因的开放阅读框之间。

130、在一个实施方案中，所述剪接位点放置在内含子3'端的下游并且紧邻外显子之前。

131、在一个实施方案中，所述外源3'剪接位点在内含子内部。出乎意料的是，本发明人已证实，通过将一个或多个外源3'剪接位点插入内含子内部（而非内含子的下游或上游），也可以实现本发明的各种优势，诸如减少/完全消除异常/不正确的可变剪接，或者增加蛋白的产生水平。

132、在一个实施方案中，所述外源3'剪接位点放置在所述分支点与所述内含子的3'剪接位点之间。

133、在另一个实施方案中，所述外源3'剪接位点放置在所述分支点与所述内含子的5'剪接位点之间。

134、在一个实施方案中，所述外源剪接位点是衍生自/获自另一内含子的3'剪接位点。

135、不希望受理论束缚，但据信，来自本领域已知的任何内含子的3'剪接位点均与本文所述的表达载体相容。也就是说，如本文所用的外源3'剪接位点可以衍生自起源于不同的内含子位点、来自不同基因的内含子位点、和来自甚至不同生物体的内含子的位点。因此，在一些实例中，所述外源3'剪接位点可衍生自内含子，所述内含子衍生自任何多细胞生物。在一些实例中，所述外源3'剪接位点可衍生自动物或植物。在一些实例中，所述外源3'剪接位点可衍生自多孔动物门（例如海绵）、刺胞动物门（例如水母）、扁形动物门（例如扁虫）、环节动物门（例如蚯蚓）、软体动物门（例如海蛞蝓）、节肢动物门（例如昆虫）、脊索动物门（例如哺乳动物、鱼类、爬行动物、鸟类等）等。在一些实例中，所述外源3'剪接位点可衍生自哺乳动物。在一些实例中，哺乳动物可包括但不限于人、灵长类、鼠科的成员（例如大鼠、小鼠等）、兔科的成员（例如兔等）、牛、猪、马、犬、猫、绵羊、禽类、鱼类、山羊、鸦科动物等。所述外源3'剪接位点无需与来源内含子的序列相同，例如其可与该内含子的序列具有80%或更高的序列同源性，例如85%、90%、95%、99%的序列同源性。

136、在一个实施方案中，所述外源3'剪接位点序列衍生自/获自基因的第一个内含子。

137、在一个实施方案中，所述外源3'剪接位点包含内含子的序列但缺乏5'剪接位点。因此，在一个实施方案中，所述外源3'剪接位点缺乏5'剪接位点。

138、在一个实施方案中，所述外源3'剪接位点包含从所述分支点延伸至在所述内含子的3'端的剪接位点（ag位点）的序列。

139、在一个实施方案中，所述外源3'剪接位点包含从所述分支点延伸至所述内含子的3'端的剪接位点（ag位点）的序列，并且缺乏5'剪接位点。

140、在一个实施方案中，所述外源3'剪接位点还包含所述分支点上游的序列，例如所述分支点上游1-25个或更多个核碱基，诸如所述分支点上游1-50、1-100、1-150或1-200个核碱基。

141、因此，在一个实施方案中，所述外源3'剪接位点包含所述分支点上游的序列、所述分支点、以及从所述分支点延伸至所述剪接位点（ag位点）的序列。

142、在另一个实施方案中，所述外源3'剪接位点包含跨越从所述分支点的上游至所述内含子的3'剪接位点的序列。

143、在一个实施方案中，所述外源3'剪接位点包含从所述分支点上游的区域延伸至在内含子的3'端的剪接位点（ag）的序列，不包含所述内含子的5'剪接位点（gt）。

144、在一些实例中，所述上游序列可以是所述分支点上游1-25个核碱基或更多个核碱基，例如1-50、1-100、1-150或1-200个核碱基。例如，所述上游序列可以是所述分支点上游1个核碱基、2个核碱基、3个核碱基、4个核碱基、5个核碱基、6个核碱基、7个核碱基、8个核碱基、9个核碱基、10个核碱基、11个核碱基、12个核碱基、13个核碱基、14个核碱基、15个核碱基、16个核碱基、17个核碱基、18个核碱基、19个核碱基、20个核碱基、21个核碱基、22个核碱基、23个核碱基、24个核碱基、25个核碱基、26个核碱基、27个核碱基、28个核碱基、29个核碱基、30个核碱基、31个核碱基、32个核碱基、33个核碱基、34个核碱基、35个核碱基、40个核碱基、45个核碱基、50个核碱基、60个核碱基、70个核碱基、80个核碱基、90个核碱基、100个核碱基、110个核碱基、120个核碱基、130个核碱基、140个核碱基、150个核碱基、160个核碱基、170个核碱基、180个核碱基、190个核碱基或200个核碱基，

145、在一个实施方案中，所述外源剪接位点在其分支点处包含腺嘌呤核苷酸。

146、在一个实施方案中，所述外源剪接位点包含、、或，其中下划线处为a分支点。

147、在一个实施方案中，所述外源3'剪接位点包含aggtt，例如其中所述外源3'剪接位点在3'端以aggtt结尾。

148、在一个实施方案中，所述外源3'剪接位点缺乏翻译起始密码子，诸如atg，例如其中所述外源3'剪接位点经修饰以去除任何atg基序。不受理论束缚，本发明人相信，去除任何翻译起始密码子可有助于避免由于外源3'剪接位点内部起始密码子的存在而导致的任何不必要的复杂性。

149、在一个实施方案中，所述外源3'剪接位点选自包括以下的组中的一个或多个：来自sp6内含子的3'剪接位点、基于所有人类内含子的共有序列的3'剪接位点、人β-球蛋白内含子的3'剪接位点等。

150、在一个实施方案中，所述外源3'剪接位点选自由以下组成的组中的一个或多个，但不限于：

151、a. sp6分支点和3'剪接位点共有序列（3' ss a）：

152、，

153、b.基于所有人类基因的共有序列的分支点与3'剪接位点（3' ss b）：

154、，以及

155、c. b-珠蛋白内含子（3' ssc）：

156、，

157、其中下划线序列为围绕a（粗体）的保守序列，以及

158、d.与上述任一项至少80%相同的其变体。

159、在一个实施方案中，所述外源3'剪接位点是选自由以下组成的组中的一个或多个，但不限于：

160、a. sp6分支点和3'剪接位点共有序列（3' ss a）：

161、，

162、b.基于所有人类基因的共有序列的分支点与3'剪接位点（3' ss b）：

163、，以及

164、c. b-珠蛋白内含子（3' ss c）：

165、，

166、其中下划线序列为围绕a（粗体）的保守序列。

167、在一些实例中，所述构建体或载体可包含所述内含子下游的一个外源3'剪接位点、或两个外源3'剪接位点、或三个外源3'剪接位点、或四个外源3'剪接位点、或五个外源3'剪接位点、或多于五个外源3'剪接位点。

168、在一个实施方案中，所述构建体或载体包含两个或更多个外源剪接位点，例如三个外源剪接位点。有利的是，包含两个或更多个外源3'剪接位点可具有叠加效应，从而进一步减少异常/不正确的可变剪接和/或提高基因表达/蛋白产生。

169、所述两个或更多个外源3'剪接位点可以直接连接在一起（即融合体），或者可以由一个或多个核苷酸/间隔子隔开。因此，在一个实施方案中，所述两个或更多个外源3'剪接位点融合在一起。在另一个实施方案中，所述两个或更多个外源3'剪接位点由一个或多个核苷酸/间隔子隔开。

170、在一个实施方案中，所述构建体或载体包含：

171、a.来自sp6内含子的3'剪接位点和基于所有人类内含子的共有序列的3'剪接位点；

172、b.来自sp6内含子的3'剪接位点和人β-球蛋白内含子的3'剪接位点；

173、c.基于所有人类内含子的共有序列的3'剪接位点和人β-球蛋白内含子的3'剪接位点；

174、d.来自sp6内含子的3'剪接位点、基于所有人类内含子的共有序列的3'剪接位点、以及人β-球蛋白内含子的3'剪接位点；或

175、e.来自sp6内含子的3'剪接位点、基于所有人类内含子的共有序列的3'剪接位点、以及人β-球蛋白内含子的3'剪接位点的融合体。

176、在一个实施方案中，所述构建体或载体包含：

177、a. seq id no: 1和seq id no: 2；

178、b. seq id no: 1和seq id no: 3；

179、c. seq id no: 2和seq id no: 3；

180、d. seq id no: 1、seq id no: 2和seq id no: 3；

181、e. seq id no: 1、seq id no: 2和seq id no: 3的融合体：

182、gccactgactctttcctttgtcctgttcccatttccaggttaatactctgagtccaaaccgggccccgccactaactctttcctttttctttttttttttcttttcaggttaatactctgagtccaaaccgggcccctctgctaaccatgttcatgccttcttctttttcctacaggtt (seq id no: 4)；或

183、f.与上述任一项至少80%相同的其变体。

184、所述其变体可与本文所公开的任何核苷酸序列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同。

185、在一个实施方案中，所述内含子选自包括以下的组：未经改变而天然存在的内含子（例如来自cmv基因组的内含子a），或者重组内含子/工程化内含子（例如天然存在的内含子的截短版本）。

186、在一个实施方案中，所述内含子选自包括以下的组：来自cmv基因组的内含子a、来自延伸因子1α的内含子a和来自延伸因子2的内含子a。

187、在一个实施方案中，所述内含子为天然存在的内含子，例如来自cmv基因组的内含子a。

188、在一个实施方案中，所述内含子为天然存在的内含子的截短版本，例如来自cmv基因组的内含子a的截短版本。令人惊讶的是，本发明人已证实，当插入到内含子的截短版本（例如截短的内含子a）的下游或内部时，也可以实现本发明的各种优势，诸如减少/完全消除异常/不正确的可变剪接，或者增加蛋白产生的水平。

189、因此，在一个实施方案中，所述内含子为来自cmv基因组的内含子a或来自cmv基因组的内含子a的截短版本。

190、在一个实施方案中，所述内含子包含其自身的5'剪接位点、分支点、以及其自身的（内源）3'剪接位点。

191、在一个实施方案中，所述构建体或载体包含内源3'剪接位点。

192、在一些实例中，所述内源剪接位点不在外显子内部。在一些实例中，所述内源剪接位点不在目的基因的orf内部。

193、在一些实例中，所述目的基因可固有地包含一个或多个剪接位点。在一些实例中，所述目的基因可包括但不限于抗原结合蛋白、信号肽等。

194、本公开的发明人发现，本文所述的构建体、内含子或载体在提高抗体产生方面最为有效。因此，在一些实例中，所述目的基因为抗体。因此，在一个实施方案中，所述目的基因编码抗体，例如抗体重链和/或抗体轻链。

195、在一个实施方案中，所述内源剪接位点是在所述内含子的3'端。

196、在一个实施方案中，所述构建体或载体包含：

197、

198、在一个实施方案中，所述内含子是紧邻启动子的下游的第一个内含子（例如内含子1或内含子a）。

199、在一个实施方案中，所述构建体或载体还包含一个或多个启动子。

200、在一个实施方案中，所述构建体或载体还包含选自由以下组成的组中的启动子：ref1a启动子、heef2启动子、cmv启动子、ef-1α启动子、ef2启动子和sv40启动子。

201、在一个实施方案中，所述构建体包含编码目的基因的多核苷酸，例如抗体，诸如抗体重链和/或抗体轻链。

202、在一个实施方案中，所述构建体或载体包含：

203、

204、在一个实施方案中，所述构建体或载体包含编码带有信号肽的抗体重链和/或抗体轻链的多核苷酸。

205、在一个实施方案中，所述构建体或载体包含编码重链信号肽和/或轻链信号肽的多核苷酸。

206、所述信号肽可来自任何蛋白，例如任何人抗体，并且不限于本文所公开的信号肽。

207、在一个实施方案中，所述构建体或载体包含一个或多个多核苷酸，所述多核苷酸编码一种或多种以下抗体重链或抗体轻链的信号肽：

208、，以及

209、与上述任一项具有至少80%的序列同一性的变体。

210、在一个实施方案中，所述构建体或载体包含多核苷酸，所述多核苷酸具有与选自由以下组成的组的序列至少75%相同的序列：

211、

212、在一些实例中，所述多肽可包含与本文所提供的序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%的序列同一性或100%相同的序列。h1、h2、h3、h4、h5、h6、h7和h8代表ig重链信号肽。l1代表ig κ轻链信号肽。

213、在一个实施方案中，所述构建体或载体包含多核苷酸，所述多核苷酸编码选自由以下组成的组中的一个或多个抗原结合位点重链的开放阅读框（orf）：曲妥珠单抗、利妥昔单抗、ighv1家族的成员、以及ighv3家族的成员。

214、在一些实例中，所述构建体或载体包含多核苷酸，所述多核苷酸编码选自由以下组成的组的多肽：曲妥珠单抗-h2、利妥昔单抗-h4、ighv1-46、以及ighv3-23。

215、在一个实施方案中，所述构建体或载体还包含有助于一种或多种功能的组分，所述功能包括有助于稳定性、防止酶促降解、促进从细胞核向细胞质的输出、有助于翻译起始、以及蛋白合成的整体效率。

216、在一个实施方案中，所述构建体或载体还包含多聚腺苷酸尾信号。

217、在一个实施方案中，所述构建体或载体包含如seq id no: 24所示的核酸序列。

218、在一个方面，本公开提供了载体，所述载体包含如上所定义的构建体或载体。

219、在一个实施方案中，所述载体选自包括以下的组：pbee（带内含子的大鼠ef1-α启动子）、pcho1.0（带内含子的人ef-2启动子）、pcdna3.1（不带内含子的cmv启动子）、pcmv-内含子a（带内含子a的cmv启动子）等。

220、在一个实施方案中，所述载体为哺乳动物载体。

221、在一个方面，本公开提供了质粒，所述质粒包含如上所述的构建体或载体。

222、在一个方面，本公开提供了多核苷酸，所述多核苷酸编码如上所述的构建体或载体。

223、在一个方面，本公开提供了宿主细胞，所述宿主细胞包含如上所述的构建体或载体和/或多核苷酸。

224、在一个实施方案中，所述细胞为真核细胞。

225、在一个实施方案中，所述细胞为哺乳动物细胞。

226、在一些实例中，所述细胞为哺乳动物细胞。在一些实例中，所述细胞为非人哺乳动物细胞和/或人细胞。

227、在一个实施方案中，所述细胞为中国仓鼠卵巢（cho）细胞。

228、在一个方面，本公开提供了试剂盒或系统，所述试剂盒或系统含有如上所定义的构建体或载体或细胞。

229、在一个实施方案中，所述试剂盒或系统用于重组目的蛋白的产生。

230、在一个方面，本公开提供了产生目的蛋白（或增加目的蛋白的产生）的方法，所述方法包括：

231、在表达系统中提供如上所定义的构建体或载体。

232、在一个方面，本公开提供了产生目的蛋白（或增加目的蛋白的产生）的方法，所述方法包括：

233、在启动子区域下游内含子的下游和/或内部提供和/或引入外源3'剪接位点。

234、在一个实施方案中，当开放阅读框（orf）放置在内含子（诸如cmv的内含子a）的下游时，所述方法在存在异常剪接（或不正确剪接）的情况下增加目的蛋白的产生。

235、在另一个实施方案中，即使在不存在异常剪接/不正确剪接的情况下，所述方法增加目的蛋白的产生。不受理论束缚，本发明人相信，外源3'剪接位点可通过与细胞内因子结合来增强基因表达水平，进而增加蛋白表达水平，从而实现这一效果。

236、在一些实例中，所述方法使蛋白产生增加了至少1倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍等。在一些实例中，当与常用商业载体相比，本文所述的方法使蛋白产生增加了至少1倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍等。

237、在一个方面，本公开提供了防止异常剪接（或不正确剪接）的方法，所述方法包括：

238、在表达系统中提供如上所定义的构建体或载体。

239、在一个方面，本公开提供了防止在目的基因的表达中异常剪接（或不正确剪接）的方法，所述方法包括：

240、在启动子区域下游内含子的下游和/或上游提供和/或引入外源剪接位点。

241、在一个方面，本公开提供了防止在目的基因的表达中异常剪接（或不正确剪接）的方法，所述方法包括：

242、在启动子区域下游内含子的下游和/或内含子的内部提供和/或引入外源剪接位点。

243、在一个实施方案中，当开放阅读框（orf）放置在内含子（诸如cmv的内含子a）的下游时，发生异常剪接（或不正确剪接）。

244、在一个实施方案中，在启动子区域下游内含子的下游和/或内含子的内部提供和/或引入一个或多个额外的外源3'剪接位点。因此，在一个实施方案中，在启动子区域下游内含子的下游和/或内含子的内部提供和/或引入两个或更多个外源3'剪接位点，例如两个、三个、四个或五个外源3'剪接位点，在一个实施方案中，在启动子区域下游内含子的下游和/或内含子的内部提供和/或引入三个外源3'剪接位点，

245、在一个实施方案中，所述方法在启动子区域的内含子3'剪接位点的下游提供和/或引入外源剪接位点。

246、在一个实施方案中，所述方法在启动子区域的内含子3'剪接位点内部提供和/或引入外源剪接位点。

247、在一个实施方案中，所述方法在所述分支点与所述内含子的3'剪接位点之间提供和/或引入外源剪接位点。在另一个实施方案中，所述方法在所述分支点与所述内含子的5'剪接位点之间提供和/或引入外源剪接位点。

248、在一个实施方案中，所述载体包含目的基因，所述目的基因包含内含子，所述内含子包含5'内源剪接位点和3'内源剪接位点。

249、在一些实例中，所述内源剪接位点可引起目的基因的异常剪接。也就是说，目的基因可被不经意地剪接，从而导致目的蛋白的不完整表达。

250、在一些实例中，所述内源剪接位点发现于内含子中。在一些实例中，内含子中发现的内源剪接位点引起目的基因的非期望剪接。

251、在一个实施方案中，所述剪接位点距离所述内含子约0至50个核碱基。

252、在一些实例中，所述剪接位点距离所述内含子约0个核碱基、1个核碱基、2个核碱基、3个核碱基、4个核碱基、5个核碱基、6个核碱基、7个核碱基、8个核碱基、9个核碱基、10个核碱基、11个核碱基、12个核碱基、13个核碱基、14个核碱基、15个核碱基、16个核碱基、17个核碱基、18个核碱基、19个核碱基、20个核碱基、21个核碱基、22个核碱基、23个核碱基、24个核碱基、25个核碱基、26个核碱基、27个核碱基、28个核碱基、29个核碱基、30个核碱基、31个核碱基、32个核碱基、33个核碱基、34个核碱基、35个核碱基、40个核碱基、45个核碱基或50个核碱基。在一些实例中，所述剪接位点距离所述内含子约10至20个核碱基。在一些实例中，所述剪接位点紧邻所述内含子的上游和/或下游，或距离所述内含子约0个核碱基。

253、在一个实施方案中，所述外源剪接位点为外源3'剪接位点。

254、在一个实施方案中，所述外源3'剪接位点在内含子的下游。

255、在一个实施方案中，所述外源3'剪接位点在内含子的3'端的下游。

256、在一个实施方案中，所述外源3'剪接位点紧邻内含子的下游。

257、在一个实施方案中，所述剪接位点放置在内含子与外显子之间。

258、在一个实施方案中，所述剪接位点放置在内含子的3'端并且紧邻外显子之前。

259、在一个实施方案中，所述剪接位点可包括但不限于：sp6内含子的3'剪接位点、基于所有人类内含子的共有序列的3'剪接位点、人β-球蛋白内含子的3'剪接位点等。

260、在一个实施方案中，所述内含子为紧邻启动子的下游的第一个内含子（即内含子a或内含子1）。

261、在一些实例中，如本公开所用的启动子可以是来自任何哺乳动物或病毒的任何启动子。在一些实例中，启动子可以包括但不限于来自大鼠或人的启动子。

262、在一个实施方案中，所述启动子选自由以下组成的组：ref1a启动子、heef2启动子、cmv启动子、来自其他哺乳动物的ef-1α启动子和ef2启动子、和sv40启动子。

263、在一个实施方案中，所述剪接位点被引入选自由以下组成的组中的启动子/内含子对中：cmv/内含子a和ref1a/内含子1。

264、在一个实施方案中，当放置在内含子的下游时，所述外源3'剪接位点完全防止抗体转录本的异常剪接并且提升抗体产生。

265、在一个方面，本公开提供了基本上如本文所述的载体或构建体或细胞。

266、在一个方面，本公开提供了基本上如本文所述的改善蛋白表达或防止可变剪接的方法。

267、在一个方面，本公开提供了基本上如本文所述的增加蛋白表达或抗体产生的方法。