人多能干细胞制备功能增强型嗜酸性粒细胞应用于实体瘤的治疗的制作方法

本发明涉及实体瘤免疫治疗，具体地，涉及一种表达嵌合抗原受体(car)的嗜酸性粒细胞和激活了tlr7/8信号的安全型嗜酸性粒细胞、其制备方法与在实体瘤免疫治疗方面的应用。

背景技术：

1、近年来，嵌合抗原受体t细胞(chimeric antigen receptor t，car-t)移植成功治疗血液瘤，实现肿瘤治疗里程碑式的突破。但是，实体瘤的治疗至今尚未建立有效的方案，其主要的原因是免疫细胞很难成功浸润到实体瘤内部。虽然已不断开发多种治疗实体瘤的免疫疗法，但都受到免疫细胞难以浸润到实体瘤中的限制。同时，即使有少量t淋巴效应细胞浸润实体瘤，其仍会被肿瘤微环境负调控导致杀伤肿瘤的效应功能丧失，出现t淋巴细胞功能耗竭的情况。因此，促进t淋巴细胞对实体瘤的浸润成为攻破治疗实体瘤的关键突破口。

2、为了开发新的策略解决实体瘤治疗的难题，weller p f等和blanchard c等提出利用天然免疫细胞嗜酸性粒细胞的生物特性来突破实体瘤障碍，并利用嗜酸性粒细胞具有调节免疫微环境的能力等，希望利用嗜酸性粒细胞探索实体瘤治疗的新方案(weller p f,spencer l a；functions of tissue-resident eosinophils；nature reviewsimmunology；2017；17(12):746-760；blanchard c,rothenberg m e；biology of theeosinophil；advances in immunology；2009,101:81-121)。

3、作为天然免疫细胞的嗜酸性粒细胞，能够在机体响应外来异物信号攻击的最早期，在肿瘤内部细胞发生坏死产生坏死信号后，首先响应肿瘤坏死信号进而浸润到肿瘤内部。demaria,o.等的研究表明，嗜酸性粒细胞具有能够浸润到多种类型的肿瘤组织中的能力，包括胃结直肠癌、食管癌、乳腺癌、卵巢癌和子宫癌等(demaria,o.,cornen,s.,daeron,m.,morel,y.,medzhitov,r.,and vivier,e；harnessing innate immunity in cancertherapy；2019nature 574,45-56)。同时，嗜酸性粒细胞具有能够浸润到肿瘤深层内部的能力。在肿瘤浸润过程中，嗜酸性粒细胞表达多种趋化因子受体和警报素受体，这些特征使得嗜酸性粒细胞能够响应肿瘤坏死细胞释放的信号，在早期就能迁移浸润到肿瘤内部。grisaru-tal s等的研究指出，肿瘤浸润嗜酸性粒细胞能够招募其他类型的免疫效应细胞，从而增强抗肿瘤效果(grisaru-tal s,rothenberg me,munitz ajni；eosinophil–lymphocyte interactions in the tumor microenvironment and cancerimmunotherapy；2022；23(9):1309-16)。嗜酸性粒细胞能够分泌趋化树突细胞和辅助t细胞的趋化因子，能够使肿瘤微环境中的血管网络正常化，能促进cd8+t细胞的浸润。与上述研究一致，临床上已有大量的研究显示，肿瘤浸润的嗜酸性粒细胞数量与肿瘤治疗效果成正相关。更重要的是，目前已有临床研究报道在治疗非霍奇金淋巴瘤及乳腺癌的研究中，嗜酸性粒细胞在免疫疗法实现疗效的过程中起着关键作用。综上所述，这些研究都表明嗜酸性粒细胞具有开发应用于治疗实体瘤的潜力。

4、嗜酸性粒细胞在外周血中数量少，约占总白细胞数量的5％，同时其存活时间短，约18小时～几天。嗜酸性粒细胞具有向肺部趋化的趋势，趋化进入肺部的嗜酸性粒细胞可能会引起相关的疾病比如哮喘。同时，嗜酸性粒细胞也会浸润到皮肤、小肠等组织。这些特征限制了嗜酸性粒细胞在肿瘤治疗中的抗肿瘤作用研究和应用。

技术实现思路

1、鉴于现有技术存在的缺陷，本发明的目的在于提供功能人多能干细胞制备功能增强型嗜酸性粒细胞应用于实体瘤的治疗，该嗜酸性粒细胞为人多能干细胞(humanpluripotent stem cells，hpscs)分化产生的嗜酸性粒细胞，为开发实体瘤免疫治疗方案提供新的免疫细胞来源。

2、本发明首先提供了一种嗜酸性粒细胞，其表达嵌合抗原受体(car)，并且表达人cd45、siglec8、cd11b和嗜酸性粒细胞过氧化物酶。

3、在上述的嗜酸性粒细胞中，优选地，所述嗜酸性粒细胞表达的car包含至少一个靶蛋白结合结构域；更优选地，所述靶蛋白为肿瘤特异性抗原；进一步优选地，所述肿瘤特异性抗原选自her2、egfr、cd19、cd140a中的一种或多种。

4、在上述的嗜酸性粒细胞中，优选地，所述肿瘤特异性抗原为her2。

5、在上述的嗜酸性粒细胞中，优选地，其基因组中插入有car基因；

6、更优选地，所述car基因插入细胞的gapdh基因位置处；其中，所述gapdh基因位置为第9外显子中间；

7、进一步优选地，所述嗜酸性粒细胞是由人多能干细胞经crispr编辑系统在其基因组中插入car基因后进行分化而得到的；其中，所述crispr编辑系统为crispr/cas9、crispr/cas13a、crispr/cas12中的一种或两种以上的组合，优选为crispr/cas9。

8、在上述的嗜酸性粒细胞中，优选地，所述嗜酸性粒细胞是由造血祖细胞经含有car的载体转染后分化得到的；更优选地，所述造血祖细胞是由人多能干细胞分化得到的。

9、进一步优选地，所述含有car的载体包括bbz car载体、fc car载体和/或fcz car载体。

10、本发明还提供了一种安全型嗜酸性粒细胞，其tlr7和/或tlr8被tlr激动剂r848激活。

11、本发明还提供了上述的嗜酸性粒细胞的制备方法，其步骤包括：

12、s101：通过crispr编辑系统在人多能干细胞的gapdh位置处插入car基因，得到基因编辑后的人多能干细胞；

13、s102：诱导基因编辑后的人多能干细胞分化得到中胚层细胞；

14、s103：诱导中胚层细胞进一步分化得到生血内皮细胞；

15、s104：诱导生血内皮细胞进一步分化得到造血祖细胞，所述造血祖细胞中表达hoxa9、runx1、gata2、gfi1b、pu.1和sox17基因；

16、s105：诱导造血祖细胞分化，得到表达car的嗜酸性粒细胞。

17、本发明还提供了另一种上述的嗜酸性粒细胞的制备方法，其步骤包括：

18、s201：诱导人多能干细胞，得到中胚层细胞；

19、s202：诱导中胚层细胞进一步分化得到生血内皮细胞；

20、s203：诱导生血内皮细胞进一步分化造血祖细胞，所述造血祖细胞中表达hoxa9、runx1、gata2、gfi1b、pu.1和sox17基因；

21、s204：转染含有car的载体至所述造血祖细胞后，诱导造血祖细胞分化得到表达car的嗜酸性粒细胞。

22、本发明还提供了上述的安全型嗜酸性粒细胞的制备方法，其步骤包括：

23、s301：诱导人胚胎干细胞或人多能干细胞，得到中胚层细胞；

24、s302：诱导中胚层细胞进一步分化得到生血内皮细胞；

25、s303：诱导生血内皮细胞进一步分化造血祖细胞，所述造血祖细胞中表达hoxa9、runx1、gata2、gfi1b、pu.1和sox17基因；

26、s304：诱导造血祖细胞分化得到基础嗜酸性粒细胞。

27、s305：采用tlr激动剂处理基础嗜酸性粒细胞，制备得到具有tlr信号激活的安全型嗜酸性粒细胞；优选地，tlr激动剂处理浓度为1-10μg/ml，处理时间为12-24小时；更优选地，tlr激动剂处理浓度为0.5-5μg/ml。

28、根据本发明的具体实施方式，采用tlr激动剂激活所述tlr信号。所述tlr激动剂可以是现有技术中任何可行的tlr激动剂。

29、在上述三种方法中，优选地：

30、人多能干细胞分化得到中胚层细胞的过程中，采用的培养基中含有wnt信号激活剂和人碱性成纤维细胞生长因子(bfgf)，还可选择性地含有y-27632；在采用的培养基中还可含有其他常规成分中的一种或多种，包括：b27(不含维生素a)、非必需氨基酸(neaa)、glutamax、青霉素-链霉素双抗(ps)、l-抗坏血酸-2-磷酸酯镁(抗坏血酸)和α-硫甘油酯；

31、中胚层细胞分化得到生血内皮细胞的过程中，采用的培养基中含有bfgf，还可选择性地含有骨形态发生蛋白4(bmp4)、人血管内皮生长因子(vegf)和4-[4-(1,3-苯并二氧基-5-基)-5-吡啶-2-基-1h-咪唑-2-基]苯酰胺(4-[4-(1,3-benzodioxol-5-yl)-5-pyridin-2-yl-1h-imidazol-2-yl]benzamide，sb-431542)中的一种或两种以上的组合；

32、在上述人多能干细胞分化到生血内皮细胞的过程中，wnt信号激活剂和bfgf的作用为高效诱导整个分化过程中生血内皮细胞的产生，其中wnt信号激活剂联合bfgf的诱导效果最佳，其次是wnt信号激活剂联合bmp4和bfgf，其诱导人多能干细胞分化产生中胚层的效率也较好；wnt信号通路联合bfgf的诱导会更好地促进造血祖细胞表达更高的hoxa9、runx1、gata2、gfi1b、pu.1和sox17等基因。既能在生血内皮细胞内高效诱导造血基因如gata2、pu1和gfi1b的表达，又能诱导造血祖细胞基因包括sox17、hoxa9、gata2、gfi1b、pu.1和runx1等基因的表达；

33、生血内皮细胞分化得到造血祖细胞的过程中，采用的培养基中含有重组人干细胞因子(scf)、重组人血小板生成素(tpo)、重组人fms样酪氨酸激酶3配体(flt3l)、重组人白细胞介素-3(il3)、bmp4，还可选择性地含有vegf；在采用的培养基中还可含有其他常规成分中的一种或多种，包括：b27(不含维生素a)、谷氨酰胺、ps、抗坏血酸、α-巯基甘油、n-乙酰-l半胱胺酸(nac)和米诺环素盐酸；其中，scf、tpo和flt3l的作用为促进造血干细胞及造血组细胞的体外生成、扩增与分化，il-3的作用是促进造血祖细胞向嗜酸性粒细胞分化，并增强细胞的存活，bmp4的作用为调控造血祖细胞的周期和凋亡并促进其分化为嗜酸性粒细胞，vegf的作用为支持造血干细胞的存活和分化；

34、造血祖细胞分化得到表达car的嗜酸性粒细胞或基础嗜酸性粒细胞的过程中，采用的培养基中含有il-3和重组人白细胞介素-5(il-5)，其中il-3的作用为促进造血祖细胞的增殖、促进造血祖细胞向嗜酸性粒细胞分化、增强嗜酸性粒细胞前体的存活能力，il-5的作用为特异性促进嗜酸性粒细胞的分化、成熟、活化、迁移和存活。

35、本发明还提供了上述的嗜酸性粒细胞和安全型嗜酸性粒细胞在制备治疗肿瘤药物中的应用，上述的嗜酸性粒细胞用于特异性杀伤和/或抑制实体肿瘤和/或肿瘤细胞，其中，所述实体肿瘤可以是结直肠癌、乳腺癌、黑色素瘤和胰腺癌中的一种或多种，优选为结直肠癌细胞hct-116、乳腺癌细胞mda-mb-231、黑色素瘤细胞a375和胰腺癌细胞pan1分别形成的肿瘤中的一种或两种以上的组合，所述肿瘤细胞可以是结直肠癌、乳腺癌、黑色素瘤和胰腺癌中的一种或多种的肿瘤细胞，优选为结直肠癌细胞hct-116、乳腺癌细胞mda-mb-231、黑色素瘤细胞a375和胰腺癌细胞pan1中的一种或两种以上的组合；

36、上述的安全型嗜酸性粒细胞可以单独或与其他药物联用用于治疗实体瘤。

37、根据本发明的具体实施方式，本发明的人多能干细胞可以为人化学重编程多能干细胞(human chemically reprogrammed pluripotent stem cells，hcipscs)。

38、根据本发明的具体实施方式，提供了一种利用人多能干细胞(human pluripotentstem cells，hpscs)定向诱导产生嗜酸性粒细胞(induced eosinophils，ieos)的分化方案。在上述方案中，本发明重点关注hpscs分化的第一步，发现不同的诱导中胚层分化的关键信号通路的组合，会表现不同的诱导分化效率。其中wnt信号通路联合bfgf的诱导效果最佳，其次是wnt信号通路联合bmp4信号和bfgf信号，诱导hpscs分化产生中胚层的效率也较好。通过定量pcr检测发现，在这些不同的信号组合中，wnt信号通路联合bfgf的诱导会更好促进造血祖细胞表达更高的hoxa9、runx1、gata2、gfi1b、pu.1和sox17等基因。这些由hpsc诱导分化来源的嗜酸性粒细胞表达人cd45，siglec8，cd11b等表面标志，同时也表达特异性的胞内功能标志物嗜酸性粒细胞过氧化物酶(eosinophil peroxidase，epx)。基因组表达谱的时间追踪分析结果显示，随着分化进行，hpsc多能性基因表达不断降低并最终不表达，伴随嗜酸性粒细胞相关的特征转录因子以及特异性功能基因表达持续上调。这些结果表明利用hpsc定向诱导产生ieo的分化方案能够有效诱导嗜酸性粒细胞的不断生成和成熟。对hpsc(例如化学诱导多能干细胞)来源的嗜酸性粒细胞功能进行检测：将其与结直肠癌细胞系hct-116进行共孵育后，无论在两维或者三维的肿瘤与嗜酸性粒细胞共孵育诱导杀伤体系中，hpsc来源的嗜酸性粒细胞都表现出较强的实体瘤细胞杀伤能力。进一步，将hpsc分化来源的嗜酸性粒细胞移植到结直肠癌荷瘤小鼠体内，通过连续观察可以看到嗜酸性粒细胞具有显著抑制实体瘤的功能。同时，可明显看到嗜酸性粒细胞移植后的小鼠具有延长生存的时间。

39、根据本发明的具体实施方式，提供了一种利用人多能干细胞定向分化制备表达car的嗜酸性粒细胞(car-ieo)的方案。该方案制备的car-ieo具有增强实体瘤杀伤的能力。为了在嗜酸性粒细胞中表达特异性car，构建了针对结直肠癌特异性抗原的her2-car载体，其中包括her2-bbz car，her2-fc car，her2-fcz car。利用慢病毒包装体系，包装病毒并通过转染hpsc来源的造血祖细胞，进一步诱导分化产生her2-car ieo。通过流式分选，获得her2特异表达的car-ieo细胞后，通过共孵育杀伤，发现her2-car-ieo细胞能够有效增强对实体瘤细胞的杀伤，优选为her2-fcz car-ieo细胞，其肿瘤特异性激活杀伤的效果最显著。将her2-car-ieo细胞移植到荷瘤小鼠，观察到her2-car-ieo细胞能够抑制实体瘤的增殖并延长小鼠存活时间。

40、根据本发明的具体实施方式，提供了一种利用人多能干细胞制备表达car的嗜酸性粒细胞(car-ieo)的方案。该方案制备的car-ieo具有肿瘤特异性刺激激活杀伤实体瘤细胞的能力。为了稳定获得her2-car-ieo细胞，通过crispr/cas9体系在hpsc的gapdh位点插入了her2-fcz car基因并最终获得稳定表达her2的hps细胞系，根据上述利用hpsc定向诱导产生ieos的分化方案，最终稳定获得大量her2-car-ieo细胞。对获得的her2-car表达的细胞进行功能验证，发现her2-car-ieo细胞与wt的细胞相比，显著呈现出特异性激活杀伤实体瘤细胞的效果。同时，卵巢癌mda-mb-231细胞系和胰腺癌细胞系pan1都呈现出一定的her2-car特异性激活的差异，但不同细胞系呈现不同的激活情况。

41、tlr激动剂具有潜在的治疗前景，是免疫治疗领域的研究热点之一。因此，不同的tlr7和tlr8激动剂的新药被越来越多地开发。这些激动剂可以诱导相应的细胞因子和趋化因子，作为良好的佐剂治疗某些疾病。此外，tlr7/8激动剂作为肿瘤靶向免疫治疗的潜在治疗药物已经被开发出来(michaelis k a,norgard m a,zhu x,et al.the tlr7/8agonistr848 remodels tumor and host responses to promote survival in pancreaticcancer[j].nature communications,2019,10(1):4682；rodell c b,arlauckas sp,cuccarese m f,et al.tlr7/8-agonist-loaded nanoparticles promote thepolarization of tumour-associated macrophages to enhance cancer immunotherapy[j].nature biomedical engineering,2018,2(8):578-588)。tlr7/8激动剂作为先天免疫治疗药物，具有诱导免疫调节功能的潜力，有望在先天细胞免疫与肿瘤免疫治疗之间架起一座桥梁。虽然目前世界范围内尚未有靶向tlr7/8的药物被批准用于癌症免疫治疗临床应用，但全球已经在研究和开发tlr7/8靶向药物用于癌症免疫治疗和其他类型的疾病，tlr激动剂被认为是实体瘤免疫治疗中有前景的治疗策略(kobold s,wiedemann g,rothenfuβers,et al.modes of action of tlr7 agonists in cancer therapy[j].immunotherapy,2014,6(10):1085-1095)。针对特殊亚类患者的临床应用可能需要将tlr激动剂单独使用或激动剂与icbs联合使用进行分类，以特异性针对特定人群进行癌症靶向免疫治疗，然后才能广泛应用于临床应用(mullins s r,vasilakos j p,deschler k,et al.intratumoralimmunotherapy with tlr7/8agonist medi9197 modulates the tumormicroenvironment leading to enhanced activity when combined with otherimmunotherapies[j].journal for immunotherapy of cancer,2019,7:1-18)。免疫检查点抑制剂与tlr激动剂，可显著增强肿瘤抗原肽诱导的效应t细胞反应，并控制或消除treg细胞抑制功能，具有最佳的抗肿瘤免疫功能，可大大提高肿瘤免疫治疗的治疗潜力(zhoux,ni y,liang x,et al.mechanisms of tumor resistance to immune checkpointblockade and combination strategies to overcome resistance[j].frontiers inimmunology,2022,13:915094)。随着研究的不断推进，新的tlr7/8靶向药物将有望提高恶性肿瘤患者的治疗效率和生存率，使更多的患者受益(smits e l j m,ponsaerts p,berneman z n,et al.the use of tlr7 and tlr8 ligands for the enhancement ofcancer immunotherapy[j].the oncologist,2008,13(8):859-875)。本发明中，将这些现有技术的tlr激动剂的内容全部引用合并于此。

42、根据本发明的具体实施方式，本发明的tlr激动剂为r848。r848作为tlr7/8激动剂，在工业和制药应用中有着广泛的历史和已确立的安全记录，传统上与病毒反应有关。最近的研究强调，tlr7的激活增强了cd8+t细胞的细胞毒反应，并增加了t细胞的浸润。

43、本发明的技术方案具有如下有益技术效果：

44、本发明提供的表达car的嗜酸性粒细胞为优化诱导人多能干细胞分化产生的嗜酸性粒细胞。通过对hpsc转染her2-car慢病毒或crispr/cas9基因修饰，并诱导该hpsc分化产生表达car的嗜酸性粒细胞(car-ieo)，能够增强对实体瘤的杀伤作用，为未来开发新的实体瘤免疫治疗方案提供新的免疫细胞来源。

45、人多能干细胞具有在体外增殖并分化产生各种功能细胞的能力，为在体外制备大量的功能性嗜酸性粒细胞提供了无限的细胞来源，本发明通过人多能干细胞定向分化在体外制备了大量功能成熟的ieos。这些多能干细胞来源的ieos，不仅表达嗜酸性粒细胞特异性的标志如siglec8，epx等，通过吉姆萨染色和电镜分析发现体外制备的嗜酸性粒细胞具有双叶核和嗜酸性颗粒等典型特征。体外制备的嗜酸性粒细胞具有特异杀伤肿瘤细胞而不杀伤正常细胞的能力，体内实验结果表明体外制备的嗜酸性粒细胞具有在荷瘤小鼠体内抑制肿瘤细胞生长的能力，能显著抑制荷瘤小鼠的肿瘤生长并延长荷瘤小鼠的生存期。基于人多能干细胞定向分化产生的ieo细胞，联合car-t细胞还可以显著提高car-t杀伤实体瘤的效果，这种联合使用能够显著抑制荷瘤小鼠的肿瘤生长并延长荷瘤小鼠的生存期。本发明的嗜酸性粒细胞具有杀伤肿瘤，浸润实体瘤并招募car-t细胞的能力，为开发新的免疫疗法提供了新的免疫细胞来源。

46、在首次建立人多能干细胞分化产生嗜酸性粒细胞并证明其具备实体瘤杀伤抑制的功能后，探索是否能够制备出具有功能增强型的嗜酸性粒细胞。为了增强嗜酸性粒细胞被特异性激活并特异性杀伤肿瘤，通过在嗜酸性粒细胞中过量表达car，使得肿瘤细胞表达的肿瘤特异性抗原与car结合后实现特异性激活，以此减少对正常组织如肺部、皮肤等组织的损失。hpscs分化高效产生功能成熟的嗜酸性粒细胞，再获得表达her2-car的her2-car-嗜酸性粒细胞(her2-car-ieo)。结果表明her2-car-ieo粒细胞明显增强了对实体瘤细胞的杀伤，通过将her2-car-ieo移植到荷瘤小鼠，能够明显观察到her2-car-ieo能够抑制实体瘤的增殖，并延长荷瘤小鼠生存时间。因此通过利用分化产生获得大量的表达car的嗜酸性粒细胞，为未来实体瘤的治疗提供新的免疫细胞来源。