SeHKT1;2基因在提高棉花耐盐性上的应用

本发明属于生物技术应用领域，具体涉及盐角草（salicornia europaea l.）来源的sehkt1;2基因在调节棉花耐盐性中的应用，以及利用该基因培育高耐盐性提高的棉花新种质的方法，同时涵盖含有该基因的重组载体、表达盒、细胞及重组菌在棉花耐逆育种中的应用，适用于作物耐盐性改良及盐碱地农业生产领域。

背景技术：

1、非生物胁迫（包括干旱、高盐、低温等）是制约作物生长发育与产量形成的关键环境因素。据联合国粮食及农业组织（fao）统计，全球土壤盐渍化面积持续扩大，叠加水资源短缺与极端天气频发，导致作物生长受限问题进一步加剧，因此增强作物对非生物胁迫的适应性、提升环境耐受性，已成为当前作物新品种选育的核心需求之一。

2、棉花是世界性重要经济作物，我国作为全球棉花生产、消费及进口大国，同时也是纺织服装生产贸易大国，在世界植棉产业中占据举足轻重的地位。然而，我国主要产棉区与粮食作物及其他重要经济作物产区高度重叠，粮棉争地、粮经争地矛盾长期突出，进一步强化了对棉花耐逆性（尤其是耐盐性）的改良需求。在此背景下，创制抗逆新材料、培育抗逆新品种成为突破生产瓶颈的基础。因此，发掘耐盐关键基因资源，结合基因工程、分子育种及传统育种技术创制抗逆优异种质，培育“高产、优质、多抗”棉花新品种，提升其广适性与耐逆水平，对保障我国棉花产业可持续发展具有重要战略意义。

3、hkt（high-affinity k+ transporter）蛋白是一类具有离子转运功能的膜蛋白，核心作用是参与植物体内na+与k+的吸收、长距离运输及组织分配过程，在维持细胞与组织的na+/k+平衡、缓解盐胁迫毒害中发挥关键调控作用。该蛋白最初因被鉴定为高亲和性k+转运蛋白而得名，后续研究证实其同时具备na+转运功能。目前，科研人员已在拟南芥、水稻、玉米、小麦等模式植物及主要作物中克隆到多个调控耐盐性的hkt基因，但棉花hkt基因的克隆与功能研究受其自身表达水平低的限制，进展相对缓慢，尚未形成可应用于育种实践的关键基因资源。

4、盐角草（salicornia europaea l.）是典型的盐生植物，不仅具有出众的耐盐性，同时兼具耐旱、耐水湿特性：其在3%~5%氯化钠（nacl）盐水灌溉条件下生长最快，且可在盐浓度达海水3倍的环境中正常生长，是目前已知地球上耐盐能力最强的植物种类之一。sehkt1;2基因是从盐角草中克隆获得的hkt家族成员，且已证实其为受盐胁迫诱导上调表达的基因——该特性提示其可能在盐角草的高耐盐机制中承担核心功能。因此，通过基因工程手段将sehkt1;2基因导入棉花并实现异源过表达，获得高表达sehkt1;2的转基因棉花材料，对提升棉花耐盐性、拓展盐碱地利用范围、满足生产实际需求具有重要应用价值。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供sehkt1;2基因在提高棉花耐盐性上的应用。

2、本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

3、第一方面，本发明请求保护sehkt1;2基因及其编码的sehkt1;2蛋白在如下（a1）~（a2）中至少一种中的应用：

4、（a1）在提高棉花耐盐性中的应用；

5、（a2）在培育耐盐性提高的棉花新种质中的应用。

6、第二方面，本发明请求保护包含sehkt1;2基因的生物材料在如下（a1）~（a2）中至少一种中的应用：

7、（a1）在提高棉花耐盐性中的应用；

8、（a2）在培育耐盐性提高的棉花新种质中的应用；

9、所述的生物材料为如下（c1）~（c9）中至少一种：

10、（c1）含有所述sehkt1;2基因的表达盒；

11、（c2）含有所述sehkt1;2基因的重组载体、或含有（c1）所述表达盒的重组载体；

12、（c3）含有所述sehkt1;2基因的重组微生物、或含有（c1）所述表达盒的重组微生物、或含有（c2）所述重组载体的重组微生物；

13、（c4）含有所述sehkt1;2基因的转基因棉花细胞系、或含有（c1）所述表达盒的转基因植物细胞系、或含有（c2）所述重组载体的转基因植物细胞系；

14、（c5）含有所述sehkt1;2基因的转基因植物组织、或含有（c1）所述表达盒的转基因植物组织、或含有（c2）所述重组载体的转基因植物组织；

15、（c6）含有所述sehkt1;2基因的转基因植物器官、或含有（c1）所述表达盒的转基因植物器官、或含有（c2）所述重组载体的转基因植物器官；

16、（c7）含有所述sehkt1;2基因的转基因植株、或含有（c1）所述表达盒的转基因植株、或含有（c2）所述重组载体的转基因植株；

17、（c8）如（c7）所述转基因植株的可再生细胞、组织培养物或由其产生的原生质体；

18、（c9）如（c7）所述转基因植株的繁殖材料。

19、进一步，上述的应用为：以所述的sehkt1;2基因为靶基因，通过基因工程方法，在目标棉花中过表达所述的sehkt1;2基因或提高所述sehkt1;2基因编码的sehkt1;2蛋白的活性和/或含量，提高棉花耐盐性或培育耐盐性提高的棉花新种质并应用于棉花生产实践。

20、进一步，所述提高棉花耐盐性为通过调节na+在棉花木质部和韧皮部之间的运输实现的。

21、第三方面，本发明请求保护一种提高棉花耐盐性或培育耐盐性提高的棉花新种质的方法，以sehkt1;2基因为靶基因，通过基因工程方法，在目标棉花中过表达所述的sehkt1;2基因或提高所述sehkt1;2基因编码的sehkt1;2蛋白的活性和/或含量，提高棉花耐盐性或培育耐盐性提高的棉花新种质并应用于棉花生产实践。

22、进一步，所述过表达包括：将sehkt1;2基因克隆至表达载体，并转化到棉花中，获得过表达sehkt1;2基因的棉花植株。

23、进一步，所述转化为通过农杆菌介导法进行棉花遗传转化。

24、本发明技术方案中，所述的sehkt1;2基因为如下（d1）或（d2）所示的dna分子：

25、（d1）具有如seq id no:1所示的核苷酸序列的dna分子；

26、（d2）与seq id no:1所示核苷酸序列同源性≥98%，且编码的蛋白具有相同或相似na+/k+转运功能的同源基因序列。

27、本发明技术方案中，所述的sehkt1;2蛋白为如下（b1）或（b2）所示的蛋白质：

28、（b1）氨基酸序列如seq id no:2所示的蛋白质；

29、（b2）在（b1）所述蛋白质的n端和/或c端连接蛋白标签得到的融合蛋白；

30、（b3）将seq id no:2所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与棉花耐盐性相关的蛋白质；

31、（b4）与（b1）或（b2）或（b3）所示的蛋白质具有80%以上同一性且与棉花耐盐性相关的蛋白质。

32、本发明所述“调节棉花耐盐性”的核心机制为：通过sehkt1;2基因的表达产物（sehkt1;2蛋白）调控na+在棉花木质部与韧皮部之间的运输过程——具体包括抑制木质部对na+的装载（减少na+向地上部叶片的转运）、增强韧皮部对na+的再转运（促进na+向根系或非光合组织的分配），从而优化整株棉花的na+空间分布，维持细胞内na+稳态，减少na+对叶片光合器官的毒害，最终实现棉花耐盐性的提升。

33、本发明培育高耐盐性棉花的方法：核心步骤为在棉花中异源过表达sehkt1;2基因，具体操作流程如下：

34、（1）载体构建：采用无缝克隆技术，将seq id no:1所示的sehkt1;2基因插入双元植物农杆菌表达载体pcambia2301-35s，选择kpn i与bamh i为酶切位点，构建由花椰菜花叶病毒（camv）35s组成型启动子驱动的sehkt1;2过表达载体（载体构建流程和关键元件如图1a、b所示）；

35、（2）遗传转化：通过农杆菌介导的遗传转化方法，将上述过表达载体导入棉花受体（陆地棉品系w0），获得转基因棉花植株；

36、（3）纯合株系筛选：对转基因棉花后代（t3代）进行分子鉴定，筛选目的基因稳定整合且纯合的过表达株系，即得到高耐盐性棉花材料。

37、本发明的有益效果

38、（1）获得稳定遗传的转基因材料：通过农杆菌介导的遗传转化方法，成功获得sehkt1;2异源过表达的转基因棉花，且经t3代分子鉴定（图2）证实目的基因可稳定遗传并纯合，为棉花耐盐性研究及育种应用提供了可靠的材料基础。

39、（2）显著提升棉花耐盐性：

40、表型层面：盐胁迫（400 mm nacl）处理28天后，sehkt1;2过表达株系（oe1、oe3）的株高、根系干物重、植株干物重均显著高于受体株系w0（图4），且叶片活性氧（ros）积累量显著降低（nbt染色蓝色沉淀更少，图5），表明其可有效缓解盐胁迫对棉花生长的抑制及氧化损伤；

41、（3）明确耐盐机制，具备理论创新性：通过na+含量检测（图6）与na+流监测（图7）证实，sehkt1;2通过调控木质部与韧皮部的na+运输实现耐盐性提升——该机制的阐明为植物耐盐基因的功能解析提供了新的理论依据；

42、（4）应用价值显著：本发明利用盐生植物来源的外源基因改良棉花耐盐性，突破了棉花自身hkt基因研究的局限，为棉花耐盐新种质创制提供了关键基因资源；应用该方法培育的耐盐棉花可显著提升盐碱地利用率，缓解粮棉争地矛盾，对保障我国棉花产业安全具有重要实践意义。