SmAP2/ERF16基因在提高丹参中丹酚酸B和/或迷迭香酸含量的应用

本发明涉及植物基因工程，具体涉及smap2/erf16基因在提高丹参中丹酚酸b和/或迷迭香酸含量的应用。

背景技术：

1、丹参（salvia miltiorrhiza bunge）为唇形科鼠尾草属多年生草本植物，其干燥根及根茎是我国传统大宗中药材之一。水溶性酚酸是丹参主要活性成分，主要包括迷迭香酸和丹酚酸b，具有较强抗氧化活性和重要药用价值，也是丹参药材及相关制剂质量评价的重要指标。

2、丹参酚酸类次生代谢物主要合成于苯丙烷代谢途径和酪氨酸衍生途径。苯丙烷支路中，苯丙氨酸在pal、c4h和4cl等关键酶作用下生成酚酸酰基供体；酪氨酸衍生支路中，酪氨酸在tat和hppr等酶作用下生成丹参素相关前体。两条支路生成的前体在ras等酶作用下形成迷迭香酸，并经cyp98a14等关键酶参与后续丹酚酸类成分的形成。

3、转录因子能够通过调控关键结构基因的表达水平影响植物次生代谢产物积累。ap2/erf家族转录因子广泛参与植物生长发育、激素响应、逆境适应和次生代谢调控，但关于丹参ap2/erf家族成员调控丹酚酸合成的功能基因及应用仍有待进一步挖掘。

技术实现思路

1、针对现有技术所存在的上述缺点，本发明提供了smap2/erf16基因在提高丹参中丹酚酸b和/或迷迭香酸含量的应用，能够有效解决现有技术中缺乏能够有效促进丹参迷迭香酸和丹酚酸b合成积累的功能基因及相应基因工程调控手段的问题。

2、申请人以丹酚酸含量存在显著差异的丹参材料为研究对象，通过转录组与代谢组联合分析、表达趋势聚类、差异表达分析以及转录—代谢关联网络分析，筛选获得与丹参酚酸差异积累密切相关的候选转录因子。结果表明，编号为evm0015940的候选基因在高酚酸材料中具有较高的表达水平，且与酚酸类代谢物的关联程度较高。进一步基于丹参参考基因组数据，对丹参ap2/erf家族成员进行全基因组鉴定和系统发育分析，将evm0015940命名为smap2/erf16，并获得其编码区核苷酸序列。所述编码区核苷酸序列长度为474 bp，编码157个氨基酸。

3、为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：

4、第一方面，本发明提供smap2/erf16基因在提高丹参中丹酚酸b和/或迷迭香酸含量的应用，所述smap2/erf16基因的编码区核苷酸序列如seq id no：1所示；

5、所述应用为将所述smap2/erf16基因在丹参中过表达。

6、进一步的，所述smap2/erf16基因编码的smap2/erf16蛋白的氨基酸序列如seq idno：2所示。

7、进一步的，所述smap2/erf16基因编码的蛋白质的氨基酸序列如seq id no：2所示。

8、进一步的，所述过表达通过向丹参中外源导入并表达所述smap2/erf16基因的编码序列实现。

9、进一步的，所述外源smap2/erf16基因以重组表达盒的形式导入丹参并在丹参中表达。

10、进一步的，所述重组表达盒包含启动子、所述smap2/erf16基因的编码序列和终止子。

11、进一步的，所述启动子为能够在丹参中驱动所述smap2/erf16基因转录的植物启动子。

12、优选的，所述植物启动子为ubq10启动子。

13、进一步的，所述重组表达盒由植物重组表达载体携带。

14、进一步的，所述植物重组表达载体通过农杆菌介导的遗传转化导入丹参。

15、进一步地，所述农杆菌为发根农杆菌。

16、进一步的，所述smap2/erf16基因的过表达在丹参毛状根中进行。

17、第二方面，本发明还提供一种用于提高丹参中丹酚酸b和/或迷迭香酸含量的重组表达盒，所述重组表达盒包含可操作地连接的植物启动子、smap2/erf16基因和终止子，所述smap2/erf16基因的编码区核苷酸序列如seq id no:1所示。

18、进一步的，所述植物启动子为能够在丹参中驱动所述smap2/erf16基因转录的植物启动子。

19、优选地，所述植物启动子为ubq10启动子。

20、第三方面，本发明还提供一种用于提高丹参中丹酚酸b和/或迷迭香酸含量的植物重组表达载体，其特征在于，所述植物重组表达载体包含第二方面中所记载的重组表达盒。

21、第四方面，本发明还提供一种用于提高丹参中丹酚酸b和/或迷迭香酸含量的重组农杆菌，所述转基因重组菌含有第三方面中所记载的植物重组表达载体。

22、进一步的，所述重组农杆菌为重组发根农杆菌。

23、为验证smap2/erf16基因的功能，本发明分别构建smap2/erf16过表达丹参毛状根和crispr/cas9基因编辑丹参毛状根，并通过qrt-pcr检测smap2/erf16基因的表达水平，通过hplc检测丹参毛状根中迷迭香酸和丹酚酸b的含量。结果表明，与相应空载体对照相比，smap2/erf16基因过表达能够显著提高丹参毛状根中迷迭香酸和丹酚酸b的含量；smap2/erf16基因功能受到抑制或发生编辑后，迷迭香酸和丹酚酸b的含量相应降低，说明smap2/erf16为丹参酚酸生物合成的正调控因子。

24、进一步地，本发明通过酵母单杂交分析验证smap2/erf16能够与丹酚酸生物合成关键酶基因smcyp98a14的启动子发生互作，通过凝胶迁移阻滞实验进一步验证smap2/erf16蛋白能够直接结合smcyp98a14启动子探针，并通过双荧光素酶报告基因分析验证smap2/erf16能够增强smcyp98a14启动子的转录活性。由此表明，smap2/erf16能够通过正向调控smcyp98a14的表达，参与丹参迷迭香酸和丹酚酸b的生物合成调控。

25、本发明提供的技术方案，与已知的现有技术相比，具有如下有益效果：

26、1、本发明鉴定并验证了smap2/erf16基因在丹参酚酸生物合成中的正向调控功能，明确了该基因在提高丹参中迷迭香酸和丹酚酸b含量方面的新用途，为丹参酚酸含量的遗传改良提供了新的功能基因资源，并为丹参基因工程育种及丹酚酸代谢工程提供了新的技术途径；

27、2、本发明基于丹参毛状根遗传转化体系，分别通过smap2/erf16基因过表达和crispr/cas9基因编辑，从正向增强和反向抑制两个方面验证了smap2/erf16基因与丹参酚酸积累之间的调控关系，实验结果表明，smap2/erf16基因过表达能够显著促进丹参毛状根中迷迭香酸和丹酚酸b的积累，而smap2/erf16基因功能受抑或被编辑后，迷迭香酸和丹酚酸b含量相应降低，说明smap2/erf16是丹参酚酸生物合成的正调控因子；

28、3、本发明通过酵母单杂交、凝胶迁移阻滞实验和双荧光素酶报告基因分析，验证了smap2/erf16能够与丹酚酸生物合成关键酶基因smcyp98a14的启动子发生互作，并能够直接结合smcyp98a14启动子探针，并增强启动子的转录活性，明确了smap2/erf16通过正向调控smcyp98a14表达参与丹参酚酸生物合成的作用途径，为利用smap2/erf16对丹参酚酸合成途径进行靶向调控提供了理论依据和技术基础。