一种水稻纹枯病菌effector基因m4337及其应用

本发明属于植物基因工程，一种水稻纹枯病菌effector基因m4337及其应用。

背景技术：

1、水稻是全球核心粮食作物，保障水稻稳产高产对维护粮食安全意义重大。水稻纹枯病是由立枯丝核菌（rhizoctonia solani ag1-ia）引发的全球性重大水稻真菌病害，高温高湿、高肥密植条件下发病尤为严重，已成为制约水稻优质高产的关键技术瓶颈。

2、目前水稻纹枯病防控过度依赖化学药剂，长期大量用药易引发病原菌抗药性、农田生态污染、稻米农残超标等问题，且大幅增加种植成本，不符合绿色农业发展要求；同时，生产中高抗纹枯病的水稻主栽品种匮乏，抗病种质资源短缺、抗病育种进展缓慢，无法实现病害源头长效防控。因此，解析病原菌致病分子机制、挖掘核心致病基因、研发靶向绿色防控技术，是破解当前病害防控难题的核心路径。

3、效应蛋白（effector）是病原真菌侵染寄主过程中分泌的关键小分子蛋白，是病原菌突破寄主免疫、完成定殖与致病的核心功能因子，也是解析病原菌-寄主互作机制、研发抗病育种与绿色防控技术的关键靶点。水稻纹枯病菌通过分泌特异性效应蛋白，抑制寄主先天免疫、干扰寄主细胞代谢、破坏寄主防御屏障，进而完成侵染致病，效应蛋白编码基因直接决定病原菌致病力强弱与寄主适配能力。

4、随着基因组测序技术发展，水稻纹枯病菌ag1-ia型菌株全基因组测序已完成，学界初步筛选并验证少量候选效应蛋白基因，明确部分基因可通过抑制寄主免疫、诱导细胞死亡调控病原菌致病过程。但现有技术存在明显缺陷：已鉴定的功能性效应蛋白基因数量极少，大量高保守、强致病相关的新型核心效应基因尚未被挖掘；已报道基因的致病机制、与水稻寄主互作通路尚不明确；基于效应基因的抗病育种、病原菌精准检测、靶向生物防控等实用技术极度匮乏，远无法满足生产应用需求。

5、综上，现有技术缺乏对新型高功能水稻纹枯病菌效应基因的挖掘，也无成熟配套的应用技术，导致病原菌致病机制研究与生产应用严重脱节，病害绿色防控体系难以完善。为解决上述现有技术痛点，挖掘新型效应基因并明确其功能与应用场景，对突破水稻纹枯病防控瓶颈、推进抗病育种与绿色防控技术升级至关重要，也是本专利旨在解决的核心技术问题。

技术实现思路

1、发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明提供一种水稻纹枯病effector基因m4337。本发明通过纹枯病表型鉴定，发现在水稻中过量表达基因m4337会降低水稻对纹枯病抗性，而利用higs技术沉默该基因会增强水稻对纹枯病抗性。表明m4337是水稻纹枯病菌的重要致病基因，通过对其克隆以及功能分析，将为针对性地研发新型生物农药提供新的理论基础。

2、本发明还提供所述水稻纹枯病effector基因m4337的应用。

3、技术方案：为了实现上述目的，本发明所述水稻纹枯病菌effector基因m4337，所述基因m4337的核苷酸序列如seq id no .1所示，其编码的氨基酸序列如seq id no .2所示。

4、本发明所述的水稻纹枯病菌effector基因m4337的沉默区段，其核苷酸序列如seqid no：3所示。

5、本发明所述含有所述的m4337基因的重组载体、重组微生物或者转基因植物细胞系。

6、本发明所述的基因m4337、权利要求2所述的沉默区段或者权利要求3所述的重组载体、重组微生物或者转基因植物细胞系在调控水稻纹枯病抗性中的应用。

7、其中，过量表达基因m4337会降低水稻对纹枯病抗性，而沉默该基因m4337会增强水稻对纹枯病抗性。

8、本发明所述与所述的m4337基因具有75％或75％以上同一性、或者与所述的m4337基因杂交，且编码m4337蛋白质的cdna分子或基因组dna分子在调控水稻对纹枯病的抗性中的应用。

9、本发明所述的m4337基因或者的沉默区段或者所述的重组载体、重组微生物或者转基因植物细胞系在设计农药分子靶点、培育抗水稻纹枯病水稻品种中的应用。

10、其中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体；所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌，如农杆菌；所述转基因植物细胞系不包括繁殖材料。

11、本发明所述的培育纹枯病抗性降低或者提高的转基因水稻的方法，包括增强或降低受体水稻在纹枯病菌侵染过程中m4337蛋白质的表达量和/或活性，得到转基因水稻；所述转基因水稻的抗病性低于/高于所述受体水稻，所述m4337蛋白质通过seq id no .1所示基因编码得到。

12、其中，所述转基因水稻的抗病性高于/低于所述受体水稻体现在转基因水稻的纹枯病病斑长度小于/长于受体水稻。

13、其中，所述增强或降低受体水稻中m4337蛋白质的表达量和/或活性的方法是通过对所述受体水稻中m4337蛋白质的编码基因进行过表达或沉默来实现。

14、本发明所述的m4337基因或者m4337蛋白质或者所述的重组载体、重组微生物或者转基因植物细胞系在培育增强抗纹枯病的转基因水稻中的应用。

15、本发明所述的培育纹枯病抗性降低或者提高的转基因水稻的方法在创制水稻纹枯病抗性新种质中的应用。

16、本发明中是上述所述水稻品种具体可为nipponbare（nip日本晴）。

17、本发明通过生物信息学手段鉴定到一个effector基因m4337，该基因是水稻纹枯病菌的致病力关键基因。纹枯病抗性鉴定结果表明，沉默m4337基因会提高水稻对纹枯病的抗性，而过表达m4337则显著削弱水稻纹枯病抗性。这些结果表明，m4337作为纹枯病菌致病力关键基因，能用于防治水稻纹枯病菌以及制备水稻纹枯病菌防治产品。

18、本发明所述应用中所述抗病性可为纹枯病抗性；所述调控具体体现在：当纹枯菌侵染水稻过程中的m4337蛋白的活性和/或含量降低时，所述植物对纹枯病的抗性提高；当纹枯菌侵染水稻过程中的m4337蛋白的活性和/或含量提高时，所述植物对纹枯病的抗性降低。

19、其中，所述植物育种具体可为创制水稻纹枯病抗性新种质。

20、上述方法中，所述降低受体水稻中的m4337基因表达量和/或活性的主要步骤如下：（1）利用si-fi工具比对的相似序列，并选取其500bp的特异片段用于构建rnai载体，命名为m4337-higs。利用primer 3 plus设计带有rnai载体上相应酶切位点的引物，分别命名为m4337-higs-f/m4337-higs-r。（2）以立枯丝核菌yn-7 cdna为模板，,以m4337-higs-f/m4337-higs-r为引物pcr扩增rnai片段。pcr产物用1%琼脂糖凝胶检测并使用诺威赞生物科技有限公司的pcr产物纯化试剂盒（dc301-1）回收。（3）将回收的m4337-higs片段与pgem-t-easy载体在4℃下过夜连接，然后转化大肠杆菌dh5α感受态细胞。使用kpnⅰ和bamhⅰ进行双酶切检测得到阳性的ta克隆并送至擎科生物科技股份有限公司测序，将序列完全正确的ta克隆命名为ta-m4337-higs。（4）用kpnⅰ和bamhⅰ双酶切ta-m4337-higs和rnai载体pds1301，切胶回收得到正方向的m4337-higs片段和酶切载体pds1301。将回收的片段和载体在4℃下过夜连接，然后转化大肠杆菌dh5α感受态细胞。用kpnⅰ和bamhⅰ双酶切检测得到阳性克隆，命名为pds1301-m4337-higs-1。（5）用sacⅰ和speⅰ双酶切ta-m4337-higs和含有正方向片段的rnai载体pds1301-m4337-higs-1。切胶回收得到反方向的m4337-higs片段和载体，将其在4℃下过夜连接，然后转化大肠杆菌dh5α感受态细胞。分别用bamhⅰ/kpnⅰ和sacⅰ/speⅰ双酶切进行检测来选择正确的单克隆，将正确的单克隆命名为pds1301-m4337-higs-2。最后将pds1301-m4337-higs-2转化根癌农杆菌eha105，并送往未米生物科技有限公司进行水稻遗传转化。

21、有益效果：与现有技术相比，本发明具有以下优点：

22、本发明克隆得到一种水稻纹枯病菌effector基因m4337及其靶标片段，该基因是水稻纹枯病菌的致病力关键基因，研究显示该基因在水稻纹枯病菌侵染水稻早期被显著诱导表达，在水稻中过表达m4337会显著降低水稻纹枯病抗性，利用higs技术在纹枯病菌侵染水稻过程中沉默m4337会显著降低水稻纹枯病菌的致病力，能得到抗水稻纹枯病菌转基因植物。

23、另外，本发明提供的构建抗水稻纹枯病菌转基因植物的方法，只是在植物中表达一个小片段的基因，不产生蛋白质等产物，不会产生转基因食品带来的潜在风险；因此，该水稻纹枯病菌effector基因m4337及其靶标片段在防治水稻纹枯病菌、制备水稻纹枯病菌防治制剂、以及构建抗水稻纹枯病菌转基因植物中均具有广泛的应用前景。