HlMO18蛋白质及其在生产6S-Humulone中的应用

本发明属于生物，具体涉及hlmo18蛋白质及其在生产6

s-humulone中的应用。

背景技术：

1、啤酒花（

humulus lupulusl.，2n=2x=20），是大麻科（cannabaceae）葎草属多年生攀缘草本。雌花主要用于啤酒酿造工业，是啤酒特有香味和苦味物质的主要来源。啤酒的品质如何，在很大程度上取决于啤酒花。作为区别啤酒与其他酒精饮料的特征成分，啤酒花甚至被誉为“啤酒的灵魂”，啤酒花对于啤酒酿造的重要性可见一斑。

2、苦味酸是啤酒花特有的次生代谢产物，其含量约占腺毛总化合物的30%（vancleemput

et al., 2009）。苦味酸在结构上由苯环骨架、酰基侧链和异戊烯基团三部分组成。根据苯环上异戊烯基侧链和羟基数量不同，可分为α-苦味酸和β-苦味酸。除赋予啤酒特殊的风味（主要是苦味），苦味酸还具有够稳定啤酒泡沫和延长啤酒保存时间的功效（zanoli and zavatti, 2008, abram

et al., 2015）。另外，苦味酸在诸如抑菌、抗氧化、消炎、抗癌、抗肿瘤方面也表现出十分良好的应用前景（chen and lin, 2004, yajima

et

al., 2005, van cleemput

et al., 2009）。

3、鉴于啤酒花植物所具有的重要经济价值和药用价值，早在20世纪60年代，学者们就已经开始对啤酒花中苦味酸的合成途径进行探索（wright and howard, 1961, mori,1961）。经过半个多世纪的研究，苦味酸的生物合成途径已基本得到阐明。在线粒体中，支链氨基酸转移酶bcat和酮酸脱氢酶bckhd催化氨基酸发生降解，生成支链脂酰辅酶a，支链脂酰辅酶a并不直接参与苦味酸骨架的构建，需先经硫脂水解酶te水解产生相应的支链脂肪酸，而后通过自由扩散或转运蛋白转运穿过线粒体膜转移到细胞质中，由胞质中的羧基辅酶a连接酶ccl2或ccl4催化，再次生成相应的支链脂酰辅酶a，在苯戊酮合酶vps催化下与丙二酰辅酶a缩合生成苦味酸骨架结构—酰化间苯三酚化合物（pibp/pivp/pmbp）。质体膜上异戊烯基转移酶pt1l/pt2复合体催化酰化间苯三酚化合物发生三次异戊烯基化，从而生成β-苦味酸。

4、研究发现，啤酒花中的α-苦味酸（主要包括humulone、cohumulone和adhumulone）具有6

s手性构象（urban

et al., 2013）。然而，作为啤酒苦味主要来源的6

s-α-苦味酸，其催化合成的酶学机制尚不明晰。因此，解析6

s-α-苦味酸合成途径仍然是一项十分具有挑战性的工作。

5、单加氧酶涉及众多基因家族，包括细胞色素p450家族、铁离子/酮戊二酸依赖的氧化酶家族以及黄素依赖的单加氧酶家族等。同时，各基因家族在植物中有众多的成员，例如拟南芥（

arabidopsis thaliana）基因组编码246个p450蛋白，大约130个铁离子/酮戊二酸依赖的氧化酶（hagel and facchini, 2018, mitchell and weng, 2019）。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题是如何特异制备humulone产物中的6

s-humulone，也即如何提高humulone产物中6

s-humulone与6

r-humulone的比例。

2、为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种蛋白质，所述蛋白质来源于啤酒花（

humulus lupulusl.），其名称为hlmo18蛋白质，hlmo18蛋白质为a1）、a2）或a3）：

3、a1）氨基酸序列是seq id no.1的蛋白质；a2）将序列表中seq id no.1所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加、与a1）所述蛋白质具有98%以上同一性且具有相同功能的蛋白质；a3）在a1）或a2）的n端或/和c端连接标签得到的融合蛋白质。

4、本发明中，所述具有98%以上同一性为具有98%或99%的同一性。同一性是指氨基酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如ncbi主页网站的blast网页。例如，可在高级blast2.1中，通过使用blastp作为程序，将expect值设置为10，将所有filter设置为off，使用blosum62作为matrix，将gap existence cost，per residue gap cost和lambda ratio分别设置为11，1和0.85（缺省值）并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值（%）。

5、上述a2）中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

6、上述a2）中的蛋白质的编码基因可通过将seq id no.2所示的dna序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上标签的编码序列得到。其中，seq id no.2所示的dna分子编码seq id no.1所示的hlmo18蛋白质。

7、本发明中，所述标签可为利用dna体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述标签可为poly-arg、poly-his、flag、strep-tag ii、c-myc、mbp标签、ha标签、gst标签和/或sumo标签等。

8、为解决上述技术问题，本发明还提供了调控hlmo18蛋白质的物质。

9、上述物质可为下述b1）至b7）中的任一种：b1）编码hlmo18蛋白质的核酸分子；b2）含有b1）所述核酸分子的表达盒；b3）含有b1）所述核酸分子的重组载体、或含有b2）所述表达盒的重组载体；b4）含有b1）所述核酸分子的重组微生物、或含有b2）所述表达盒的重组微生物、或含有b3）所述重组载体的重组微生物；b5）含有b1）所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有b2）所述表达盒的转基因植物细胞系；b6）含有b1）所述核酸分子的转基因植物组织、或含有b2）所述表达盒的转基因植物组织；b7）含有b1）所述核酸分子的转基因植物器官、或含有b2）所述表达盒的转基因植物器官。

10、其中，所述核酸分子可以是dna，如cdna、基因组dna或重组dna；所述核酸分子也可以是rna，如mrna或hnrna等。

11、本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码hlmo18蛋白质的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的hlmo18蛋白质的核苷酸序列75%或者更高同一性的核苷酸，只要编码hlmo18蛋白质且具有hlmo18蛋白质功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

12、上述物质中，b1）所述核酸分子可为编码序列是序列表中seq id no.2的dna分子。

13、具体的，b1）所述核酸分子可为seq id no.2所示的dna分子。

14、上述物质中，b2）所述的含有编码hlmo18蛋白质的核酸分子的表达盒（hlmo18基因表达盒），是指能够在宿主细胞中表达hlmo18蛋白质的dna，该dna不但可包括启动hlmo18基因转录的启动子，还可包括终止hlmo18基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。

15、可用现有的表达载体构建含有所述hlmo18基因表达盒的重组载体。

16、上述物质中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。所述质粒具体可为pesc-his载体或pesc-his-vps载体。其中，pesc-his-vps为将pesc-his载体的ecor i和noti识别序列间的小片段替换为seq id no.12所示的

vps基因得到的重组载体。

17、b3）所述重组载体具体可为pesc-his-vps-mo18。所述pesc-his-vps-mo18为将pesc-his-vps载体的bamhi和sali识别序列间的小片段替换为seq id no.2所示的

hlmo18基因得到的重组载体。

18、本发明还提供了hlmo18蛋白质或所述调控hlmo18蛋白质的物质的下述至少一种应用：

19、x1、生产humulone；x2、制备生产humulone的产品；x3、（特异性）生产6s-humulone；x4、制备（特异性）生产6s-humulone的产品；x5、提高humulone中6s-humulone的比例；x6、制备提高humulone中6s-humulone的比例的产品。

20、本发明还提供了一种产品，所述产品由m1）与m3）组成，或由m2）与m3）组成，或由m1）与m4）组成，或由m2）与m4）组成：

21、m1）hlmo18蛋白质；m2）所述调控hlmo18蛋白质的物质；m3）ccl2蛋白质、ccl4蛋白质、atpt1ltp蛋白质、atpt2tp蛋白质和/或vps蛋白质；m4）调控ccl2蛋白质的物质、调控ccl4蛋白质的物质、调控atpt1ltp蛋白质的物质、调控atpt2tp蛋白质的物质和/或调控vps蛋白质的物质。

22、上述产品中，所述ccl2蛋白质可为c1）、c2）或c3）：c1）氨基酸序列是seq id no.3的蛋白质；c2）将序列表中seq id no.3所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加、与c1）所述蛋白质具有98%以上同一性且具有相同功能的蛋白质；

23、c3）在c1）或c2）的n端或/和c端连接标签得到的融合蛋白质；所述ccl4蛋白质可为d1）、d2）或d3）：d1）氨基酸序列是seq id no.5的蛋白质；d2）将序列表中seq id no.5所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加、与d1）所述蛋白质具有98%以上同一性且具有相同功能的蛋白质；d3）在d1）或d2）的n端或/和c端连接标签得到的融合蛋白质；

24、所述atpt1ltp蛋白质可为e1）、e2）或e3）：e1）氨基酸序列是seq id no.7的蛋白质；e2）将序列表中seq id no.7所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加、与e1）所述蛋白质具有98%以上同一性且具有相同功能的蛋白质；e3）在e1）或e2）的n端或/和c端连接标签得到的融合蛋白质；

25、所述atpt2tp蛋白质可为f1）、f2）或f3）：f1）氨基酸序列是seq id no.9的蛋白质；f2）将序列表中seq id no.9所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加、与f1）所述蛋白质具有98%以上同一性且具有相同功能的蛋白质；f3）在f1）或f2）的n端或/和c端连接标签得到的融合蛋白质；

26、所述vps蛋白质可为g1）、g2）或g3）：g1）氨基酸序列是seq id no.11的蛋白质；g2）将序列表中seq id no.11所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加、与g1）所述蛋白质具有98%以上同一性且具有相同功能的蛋白质；g3）在g1）或g2）的n端或/和c端连接标签得到的融合蛋白质；

27、所述调控ccl2蛋白质的物质可为下述h1）至h7）中的任一种：h1）编码所述ccl2蛋白质的核酸分子；h2）含有h1）所述核酸分子的表达盒；h3）含有h1）所述核酸分子的重组载体、或含有h2）所述表达盒的重组载体；h4）含有h1）所述核酸分子的重组微生物、或含有h2）所述表达盒的重组微生物、或含有h3）所述重组载体的重组微生物；h5）含有h1）所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有h2）所述表达盒的转基因植物细胞系；h6）含有h1）所述核酸分子的转基因植物组织、或含有h2）所述表达盒的转基因植物组织；h7）含有h1）所述核酸分子的转基因植物器官、或含有h2）所述表达盒的转基因植物器官；

28、所述调控ccl4蛋白质的物质可为下述i1）至i7）中的任一种：i1）编码所述ccl4蛋白质的核酸分子；i2）含有i1）所述核酸分子的表达盒；i3）含有i1）所述核酸分子的重组载体、或含有i2）所述表达盒的重组载体；i4）含有i1）所述核酸分子的重组微生物、或含有i2）所述表达盒的重组微生物、或含有i3）所述重组载体的重组微生物；i5）含有i1）所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有i2）所述表达盒的转基因植物细胞系；i6）含有i1）所述核酸分子的转基因植物组织、或含有i2）所述表达盒的转基因植物组织；i7）含有i1）所述核酸分子的转基因植物器官、或含有i2）所述表达盒的转基因植物器官；

29、所述调控atpt1ltp蛋白质的物质可为下述j1）至j7）中的任一种：j1）编码所述atpt1ltp蛋白质的核酸分子；j2）含有j1）所述核酸分子的表达盒；j3）含有j1）所述核酸分子的重组载体、或含有j2）所述表达盒的重组载体；j4）含有j1）所述核酸分子的重组微生物、或含有j2）所述表达盒的重组微生物、或含有j3）所述重组载体的重组微生物；j5）含有j1）所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有j2）所述表达盒的转基因植物细胞系；j6）含有j1）所述核酸分子的转基因植物组织、或含有j2）所述表达盒的转基因植物组织；j7）含有j1）所述核酸分子的转基因植物器官、或含有j2）所述表达盒的转基因植物器官；

30、所述调控atpt2tp蛋白质的物质可为下述k1）至k7）中的任一种：k1）编码所述atpt2tp蛋白质的核酸分子；k2）含有k1）所述核酸分子的表达盒；k3）含有k1）所述核酸分子的重组载体、或含有k2）所述表达盒的重组载体；k4）含有k1）所述核酸分子的重组微生物、或含有k2）所述表达盒的重组微生物、或含有k3）所述重组载体的重组微生物；k5）含有k1）所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有k2）所述表达盒的转基因植物细胞系；k6）含有k1）所述核酸分子的转基因植物组织、或含有k2）所述表达盒的转基因植物组织；k7）含有k1）所述核酸分子的转基因植物器官、或含有k2）所述表达盒的转基因植物器官；

31、所述调控vps蛋白质的物质可为下述l1）至l7）中的任一种：l1）编码所述vps蛋白质的核酸分子；l2）含有l1）所述核酸分子的表达盒；l3）含有l1）所述核酸分子的重组载体、或含有l2）所述表达盒的重组载体；l4）含有l1）所述核酸分子的重组微生物、或含有l2）所述表达盒的重组微生物、或含有l3）所述重组载体的重组微生物；l5）含有l1）所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有l2）所述表达盒的转基因植物细胞系；l6）含有l1）所述核酸分子的转基因植物组织、或含有l2）所述表达盒的转基因植物组织；l7）含有l1）所述核酸分子的转基因植物器官、或含有l2）所述表达盒的转基因植物器官。

32、上述c2）、d2）、e2）、f2）和g2）中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

33、上述c2）、d2）、e2）、f2）和g2）中的蛋白质的编码基因可分别通过将seq id no.4、seq id no.6、seq id no.8、seq id no.10、seq id no.12所示的dna序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上标签的编码序列得到。其中，seq id no.4、seq id no.6、seq id no.8、seq idno.10、seq id no.12所示的dna分子分别编码seq id no.3所示的ccl2蛋白质、seq idno.5所示的ccl4蛋白质、seq id no.7所示的atpt1ltp蛋白质、seq id no.9所示的atpt2tp蛋白质、seq id no.11所示的vps蛋白质。

34、上述产品中，h1）所述核酸分子可为编码序列是序列表中seq id no.4的dna分子；

35、i1）所述核酸分子可为编码序列是序列表中seq id no.6的dna分子；

36、j1）所述核酸分子可为编码序列是序列表中seq id no.8的dna分子；

37、k1）所述核酸分子可为编码序列是序列表中seq id no.10的dna分子；

38、l1）所述核酸分子可为编码序列是序列表中seq id no.12的dna分子。

39、具体的，h1）所述核酸分子可为序列表中seq id no.4所示的dna分子；

40、i1）所述核酸分子可为序列表中seq id no.6所示的dna分子；

41、j1）所述核酸分子可为序列表中seq id no.8所示的dna分子；

42、k1）所述核酸分子可为序列表中seq id no.10所示的dna分子；

43、l1）所述核酸分子可为序列表中seq id no.12所示的dna分子。

44、可用现有的表达载体构建含有所述ccl2基因表达盒、ccl4基因表达盒、atpt1ltp基因表达盒、atpt2tp基因表达盒和/或vps基因表达盒的重组载体。

45、上述产品中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。所述质粒具体可为pesc-his载体或pesc-leu载体或pesc-ura。

46、所述重组载体具体可为上述pesc-his-vps-mo18，pesc-leu-ccl2-ccl4和/或pesc-ura-atpt1ltp-atpt2tp。pesc-leu-ccl2-ccl4为将pesc-leu载体的not i和pac i识别序列间的小dna片段替换为seq id no.4所示的

ccl2基因、将pesc-leu-ccl2的bamh i和xho i识别序列间的小dna片段替换为seq id no.6所示的

ccl4基因得到的重组载体。pesc-ura-atpt1ltp-atpt2tp为将pesc-ura载体的bamh i和sal i识别序列间的小片段替换为seq id no.8所示的

atpt1ltp基因、将pesc-ura-atpt1ltp载体的spe i和pac i识别序列间的小片段替换为seq id no.10所示的

atpt2tp基因得到的重组载体。

47、上述产品具体可为含有hlmo18蛋白质的编码基因、所述ccl2蛋白质的编码基因、所述ccl4蛋白质的编码基因、所述atpt1ltp蛋白质的编码基因、所述atpt2tp蛋白质的编码基因和所述vps蛋白质的编码基因的重组酵母。

48、在本发明的一个实施例中，所述重组酵母将上述pesc-his-vps-mo18，pesc-leu-ccl2-ccl4和pesc-ura-atpt1ltp-atpt2tp导入酵母dd104菌株中得到。

49、本发明中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。在本发明的一个实施例中，酵母为酵母dd104菌株。

50、本发明中，所述转基因植物细胞系、转基因植物组织和转基因植物器官均不包括繁殖材料。

51、上述产品可用于生产humulone，（特异性）生产6s-humulone和/或提高humulone产物中6s-humulone的比例。

52、上述产品的下述至少一种应用，也属于本发明的保护范围：

53、x1、生产humulone；x2、制备生产humulone的产品；x3、（特异性）生产6s-humulone；x4、制备（特异性）生产6s-humulone的产品；x5、提高humulone中6s-humulone的比例；x6、制备提高humulone中6s-humulone的比例的产品。

54、本发明中，生产humulone的方法可包括：培养所述含有hlmo18蛋白质的编码基因、所述ccl2蛋白质的编码基因、所述ccl4蛋白质的编码基因、所述atpt1ltp蛋白质的编码基因、所述atpt2tp蛋白质的编码基因和所述vps蛋白质的编码基因的重组酵母，得到培养液；提取培养液中菌体和/或菌体外液体中的humulone，即得到6

r-humulone含量低于6s-humulone含量的humulone。

55、实验证明，将本发明的hlmo18蛋白质的编码基因与ccl2蛋白质的编码基因、ccl4蛋白质的编码基因、atpt1ltp蛋白质的编码基因、atpt2tp蛋白质的编码基因和vps蛋白质的编码基因一起导入酵母中后，不仅可以制备humulone，还可以大幅度提高humulone产物中6

s-humulone的比例。说明，本发明的hlmo18蛋白质可以特异性地催化6

s-humulone的生成，在啤酒酿造工业中有潜在的应用价值。

56、下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。