过表达SLC15A3的基因在提高PD-L1蛋白稳定性的用途

本技术涉及生物，具体涉及一种过表达slc15a3的基因在提高pd-l1蛋白稳定性的用途。

背景技术：

1、程序性死亡配体1（programmed death ligand-1，pd-l1）作为pd-1的配体，是一种重要的免疫检查点蛋白，表达于抗原呈递细胞、部分上皮细胞及胎盘滋养层细胞，发挥免疫调节功能，是机体免疫调节的关键因素。以t细胞为例，pd-l1与t细胞的pd-1结合后，pd-1招募shp-2，使tcr去磷酸化、cd28去磷酸化、zap70去磷酸化，抑制t细胞的免疫应答。

2、然而，现有技术缺乏明确的pd-l1调控机制，致使免疫治疗过程中涉及到pd-l1的免疫治疗方法可控性差。典型代表有用于免疫调节的间充质干细胞（mesenchymal stemcells，mscs），mscs可通过分泌免疫调节因子、调控炎症微环境以及与免疫细胞直接接触等方式发挥显著的免疫抑制作用，因此在器官移植、自身免疫病、移植物抗宿主病（gvhd）及炎症相关疾病中具有重要应用前景。mscs膜表面表达的pd-l1可与免疫细胞表面的pd-1结合，传递抑制性信号，从而调控免疫应答。因此，pd-l1是mscs发挥免疫抑制功能的重要分子基础。由于针对代谢相关基因调控msc免疫功能的研究仍十分有限，且缺乏明确的pd-l1调控机制，现有技术主要通过炎症因子尤其是干扰素γ（ifnγ）诱导mscs表达pd-l1，以增加mscs的免疫抑制作用。然而，该技术存在以下几点不足：

3、1）形成的pd-l1表达不稳定：天然mscs中pd-l1表达水平较低，且高度依赖炎症刺激环境。当炎症刺激消失后，pd-l1表达迅速下降，导致mscs免疫抑制功能难以长期维持；这直接限制了其免疫抑制功能的稳定性和可预测性。

4、2）形成的mscs免疫抑制能力有限：天然mscs在体内的免疫抑制效果往往不足以有效阻止强烈的免疫排斥反应，导致治疗失败。

5、基于以上，如何能提高pd-l1蛋白稳定性，以维持或提高免疫治疗过程中pd-l1高表达的能力，是本领域亟待解决的技术瓶颈。

技术实现思路

1、针对上述存在的技术局限性，本技术提出了一种过表达slc15a3的基因在提高pd-l1蛋白稳定性的用途；其克服了背景技术中提到的不足和缺陷。

2、为实现上述目的，本技术采用了以下技术方案：

3、第一方面，本发明提供了一种过表达slc15a3的基因在提高pd-l1蛋白稳定性的用途，通过过表达slc15a3的基因提高pd-l1蛋白稳定性。

4、优选地，前述方案所述的用途，所述pd-l1蛋白由细胞受外源性刺激或诱导产生。

5、可选地，所述细胞受外源性刺激或诱导可以是细胞因子刺激、特定信号通路激活、药物或化合物处理以及基因工程改造等方法产生的pd-l1蛋白。

6、可选地，所述细胞也可以由受含过表达基因的载体诱导产生；优选地，所述的过表达基因载体为过表达slc15a3基因的载体。

7、可选地，所述pd-l1蛋白可以是试剂盒在应用过程中产生的pd-l1蛋白。

8、优选地，前述所述的细胞为间充质干细胞；进一步优选地，所述细胞为诱导多能干细胞来源的间充质干细胞。

9、本发明第二方面，提供一种载体。

10、进一步地，所述载体包含过表达的slc15a3基因。

11、优选地，前述所述的载体，其包含crispr-cas系统；

12、可选地，前述方案所述crispr-cas系统中的cas蛋白选自cas9、cas12a、cas12b、cas12i、cas12c、cas12d、cas12e、cas12f、cas12g、cas12h、cas12j、cas13a、cas13b、cas13d、cas13x、cas13y或其功能变体。

13、优选地，前述方案所述的crispr-cas系统的cas蛋白为cas9，更优选地，所述crispr-cas系统为crispr-dcas9。

14、进一步地，前述方案所述的crispr-dcas9系统的slc15a3基因启动子区的sgrna选自下述任一核苷酸序列，或与下述核苷酸序列有至少85%的同一性：

15、caccgtccctgcttcacttcgctgc（seq id no.7）；

16、aaacgcagcgaagtgaagcagggac（seq id no.8）；

17、caccggcggatagggcctgtgaaag（seq id no.9）；

18、aaacctttcacaggccctatccgcc（seq id no.10）。

19、本发明第三方面，提供一种过表达slc15a3的细胞。

20、进一步地，所述细胞通过过表达slc15a3以调控pd-l1蛋白稳定性。

21、优选地，前述所述的细胞为间充质干细胞；进一步优选地，所述细胞为诱导多能干细胞来源的间充质干细胞。

22、本发明第四方面，提供一种提高pd-l1蛋白稳定性的产品。

23、进一步地，所述产品通过过表达slc15a3基因以调控pd-l1蛋白稳定性。

24、优选地，所述产品为药品、试剂和/或试剂盒。

25、本发明第五方面，提供一种制备过表达slc15a3的细胞的方法。

26、进一步地，所述方法包括：通过载体系统将slc15a3基因导入细胞或通过基因编辑技术激活上调细胞内源slc15a3基因。

27、优选地，所述方法通过将前述方案所述的载体导入细胞实现slc15a3基因过表达。

28、优选地，前述的方案，所述方法还包含如下步骤：

29、s1：采用含嘌呤霉素抗性基因和dcas9-vpr内源基因激活系统的慢病毒载体感染间充质干细胞，并采用嘌呤霉素筛选，获得稳定表达的dcas9-vpr母株；

30、s2：使用lenti-sgrna-slclenti-sgrna-bsd慢病毒载体感染s1所述dcas9-vpr母株，采用杀稻瘟菌素筛选，获得同时整合了dcas9-vpr和sgrna的双重稳定细胞系，即过表达slc15a3的细胞。

31、本发明第六个方面，提供一种过表达slc15a3的基因编码的蛋白的氨基酸序列。

32、进一步地，前述方案所述的载体、细胞、产品或方法，包含seq id no.1至seq idno.3所示氨基酸序列，或包含与seq id no.1至seq id no.3所示氨基酸序列具有至少85%的同一性氨基酸序列。

33、本发明第七方面，提供一种过表达slc15a3的基因的核苷酸序列。

34、进一步地，前述方案所述的载体、细胞、产品或方法，所述过表达slc15a3的基因的核苷酸序列包含seq id no.4至seq id no.6所示核苷酸序列，或包含与seq id no.4至seqid no.6所示氨基酸序列具有至少85%的同一性核苷酸序列。

35、本发明第八个方面，提供一种应用，前述方案所述的载体、细胞、产品或方法，氨基酸序列或核苷酸序列在预防和/或治疗机体自身免疫异常或过度激活的免疫反应相关疾病中的应用。

36、优选地，前述的方案，所述疾病包括自身免疫性疾病、器官移植、自身免疫性疾病和移植物抗宿主病（gvhd）、细胞因子风暴、急性肺损伤、过敏性疾病以及部分神经免疫性疾病。

37、与现有技术相对比，本技术具有以下优点：

38、本发明通过提供一种过表达slc15a3的基因的工程化间充质干细胞，在ifnγ 刺激24小时后pd-l1阳性率从58.7%提升至73.4%；48小时后从51.5%提升至71.1%；ifnγ撤除12小时后仍维持74.8%的pd-l1阳性率（对照组为60.3%），说明本发明的工程化间充质干细胞具有更强且更持久的免疫抑制能力，显著增强mscs免疫抑制功能，同时也表明，过表达slc15a3的基因能够提高pd-l1蛋白稳定性。

39、此外，体外实验表明，msc-slc15a3oe对jurkat t细胞活化的抑制效果显著优于对照mscs（p＜0.0001），且对t细胞增殖的抑制能力明显增强，可见本发明提供的过表达slc15a3的基因的工程化间充质干细胞，显著抑制t细胞活化，能够应用于预防/或治疗机体自身免疫异常或过度激活的免疫反应相关疾病。体内实验表明，msc-slc15a3oe可通过抑制人源t细胞应答，显著减轻免疫排斥反应，延长人源化小鼠异种移植模型中人源皮肤移植物的存活时间。