CmYLCV9.11启动子在大豆育种中的应用的制作方法

本技术属于生物，更具体地说，是涉及cmylcv9.11启动子在大豆育种中的应用。

背景技术：

1、启动子是基因表达调控的重要顺式调控元件，在一定程度上决定基因表达的强度和时空特异性。在植物基因工程中，启动子的选择直接关系外源基因的表达水平和模式。根据表达模式，用于植物的启动子可分为组成型启动子、组织特异性启动子和诱导型启动子三类。组成型启动子能够驱动基因在植物各器官和发育阶段持续表达，因其适用范围广，在植物育种中应用最为广泛。常用的组成型启动子包括花椰菜花叶病毒camv35s启动子、根癌农杆菌胭脂碱合成酶基因nos启动子、玉米ubiquitin启动子、以及水稻actin1启动子等。其中camv35s启动子使用最为广泛，但随着研究的深入，其局限性也逐渐显现。主要体现在其在部分双子叶植物中表达效率较低，且在多基因共表达体系中多次使用该启动子时容易引起基因沉默。因此，开发并利用具有不同序列特征的新型启动子，是植物育种工具开发的重要方向。

2、夜香树黄曲叶病毒（cmylcv）启动子是一种病毒来源的组成型启动子，在多种植物中具有高活性。sahoo等（comparative analysis of synthetic dna promoters forhigh-level gene expression in plants. planta, 2014, 240(4): 855-875.）从该病毒基因组中分离了长度为465 bp的cmylcv9.11启动子片段（-329至+137区域），发现其在烟草瞬时转化和稳定转化体系中的活性均显著高于camv35s启动子。该启动子在水稻、玉米、番茄等多种植物中均具有较高的转录活性，是一种广谱性较强的组成型启动子。

3、大豆的基因功能研究对于大豆品种改良具有重要参考意义。亚细胞定位和转基因表达是大豆基因功能研究的重要技术手段，而耐盐性改良则是大豆育种的重要应用目标。其中，亚细胞定位需要组成型启动子驱动荧光蛋白与目标蛋白的融合表达以产生清晰可辨的荧光信号；转基因需要启动子驱动目标基因在受体材料中实现有效表达；耐盐性改良则需要启动子高效驱动耐盐基因的表达。然而，camv35s启动子在大豆中的驱动效率有限。因此，挖掘并验证在大豆中具有高活性的启动子，是提升大豆育种研发效率的关键环节。

技术实现思路

1、本技术的目的在于提供cmylcv9.11启动子在大豆育种中的应用，从而解决或者至少缓解现有技术中存在的上述问题和其他方面的问题中的一个或多个。

2、本技术实施例的第一方面，提供了cmylcv9.11启动子在大豆育种中的应用，所述cmylcv9.11启动子用于驱动目的基因在大豆中的表达，所述cmylcv9.11启动子的核苷酸序列如seq id no.4所示；所述目的基因为报告基因或耐盐基因；所述报告基因为mcherry、ruby或gfp；所述耐盐基因为atsos1δ998，其核苷酸序列如seq id no.10所示。

3、在一种实施例中，当所述目的基因为报告基因时，所述应用为用于大豆蛋白亚细胞定位或用于大豆毛状根转化效率评估。

4、在一种实施例中，当所述应用为用于大豆蛋白亚细胞定位时，所述报告基因为mcherry。

5、本技术中，申请人将cmylcv9.11启动子与mcherry编码序列连接，构建mcherry表达载体，转化大豆原生质体，荧光显微镜下可观察到清晰的荧光信号。

6、在一种实施例中，当所述应用为用于大豆毛状根转化效率评估时，所述报告基因为ruby或gfp。

7、本技术中，申请人将cmylcv9.11启动子与ruby编码序列连接，通过发根农杆菌介导的转化法获得转基因毛状根，肉眼可见转化后的大豆毛状根呈现明显的红色表型。此外，申请人将cmylcv9.11启动子与gfp编码序列连接，通过发根农杆菌介导的转化法获得转基因毛状根，转化后的大豆毛状根在激发光下可见明显的荧光信号。

8、说明cmylcv9.11启动子可用于大豆蛋白亚细胞定位荧光成像或大豆毛状根转化效率评估。

9、在一种实施例中，当所述目的基因为atsos1δ998时，所述应用选自如下a1~a4中的至少一种：

10、a1、提高大豆植株耐盐性；

11、a2、培育耐盐性大豆植株；

12、a3、降低盐胁迫下大豆植株的生长受抑制程度；

13、a4、盐胁迫条件下维持大豆植株正常生长；

14、所述atsos1δ998的核苷酸序列如seq id no.10所示。

15、本技术提供了cmylcv9.11启动子在大豆耐盐性改良中的应用。申请人将cmylcv9.11启动子与耐盐基因atsos1δ998编码序列连接，构建耐盐基因表达载体，通过发根农杆菌介导的转化法获得转基因毛状根嵌合体植株（地上部分为野生型，根系为转基因毛状根），在盐胁迫条件下对转基因毛状根嵌合体植株进行整体耐盐性评估，转基因毛状根嵌合体植株生长状态显著优于空载对照，表明cmylcv9.11启动子能够驱动耐盐基因在大豆毛状根中高效表达，提高转基因大豆嵌合体植株的耐盐性。

16、本技术实施例的第二方面，提供了一种生物材料在大豆育种中的应用，所述生物材料选自如下b1~b3中的任意一种：

17、b1、包含报告基因和cmylcv9.11启动子的表达盒；

18、b2、包含报告基因和cmylcv9.11启动子的表达载体或包含b1所述表达盒的表达载体；

19、b3、包含报告基因和cmylcv9.11启动子或包含b1所述表达盒或b2所述表达载体的转化体；所述cmylcv9.11启动子的核苷酸序列如seq id no.4所示；

20、所述报告基因为mcherry、ruby或gfp；

21、所述应用为用于蛋白亚细胞定位荧光成像或用于大豆毛状根转化效率评估。

22、在一种实施例中，所述报告基因为mcherry，所述应用为用于大豆蛋白亚细胞定位荧光成像。

23、在一种实施例中，所述报告基因为ruby或gfp，所述应用为用于大豆毛状根转化效率评估。

24、本技术实施例的第三方面，提供了一种生物材料在大豆育种中的应用，所述生物材料选自如下c1~c6中的任意一种：

25、c1、包含atsos1δ998和cmylcv9.11启动子的表达盒；

26、c2、包含atsos1δ998和cmylcv9.11启动子的表达载体或包含c1所述表达盒的表达载体；

27、c3、包含所述atsos1δ998和cmylcv9.11启动子或包含c1所述表达盒或c2所述表达载体的转化体；

28、c4、具有掺入基因组的外源核酸分子的大豆，所述核酸分子包括atsos1δ998和cmylcv9.11启动子；

29、c5、具有掺入基因组的外源核酸分子的大豆，所述核酸分子包括c1所述的表达盒或c2所述的表达载体；

30、c6、由c3所述的转化体再生得到的大豆；

31、所述atsos1δ998的核苷酸序列如seq id no.10所示；所述cmylcv9.11启动子的核苷酸序列如seq id no.4所示。

32、在一种实施例中，所述应用为选自如下d1~d4中的至少一种：

33、d1、提高大豆植株耐盐性；

34、d2、培育耐盐性大豆植株；

35、d3、降低盐胁迫下大豆植株的生长受抑制程度；

36、d4、盐胁迫条件下维持大豆植株正常生长。

37、本技术实施例提供的cmylcv9.11启动子在大豆育种中的应用的有益效果在于：本技术将cmylcv9.11启动子在大豆原生质体中进行了活性验证，具体为：将cmylcv9.11启动子与nanoluc荧光素酶报告基因（nluc）连接，构建双荧光素酶报告载体，转化大豆原生质体，通过检测双荧光素酶活性，发现cmylcv9.11启动子驱动报告基因的表达强度是对照camv35s启动子的4倍以上，在多种应用场景中，其驱动外源基因的表达水平均显著优于camv35s启动子，为大豆育种提供了高效的启动子元件。