基因组合在制备自发光转基因蒲公英中的应用

本技术属于植物基因工程，具体涉及基因组合在制备自发光转基因蒲公英中的应用。

背景技术：

1、生物发光是生命体通过自然化学反应产生的光，广泛存在于海洋和陆地物种中，是自然界最神奇的现象之一。作为一种强大的生物信号，生物发光一直都是许多科学领域研究人员关注的焦点，包括基础和应用生物学、化学、医学。在现代化推进过程中，具有观赏性的植物也将在现代城市建设和家庭生活中扮演也来越重要的角色。此外，植物具有独立的能量生产和储存机制以及自主的自我修复能力，因此对植物进行生物发光和可持续发光的研究和改造是十分有意义的事情。

2、随着不同发光细菌和真菌的生物发光机制被相继解析，研究人员通过将这些发光通路上的基因一起转移到植物体内进行表达，成功创制了无需外施荧光素就能发光的植物。对于自发光植物的研究已有相关报道。2018年，kotlobay等人成功解析了一类发光蘑菇生物发光途径fbp，该发光途径可通过四种酶组成的咖啡酸代谢循环产生光，具体地，咖啡酸在牛奶树碱合酶（hispidin synthase，hisps）的作用下转换成牛奶树碱，随即被牛奶树碱-3-羟化酶（hispidin-3-hydroxylase，h3h）催化生成3-羟基化牛奶树碱（真菌荧光素），荧光素在荧光素酶（luciferase，luz）作用下被氧化成咖啡酰丙酮酸并产生光子，最后由咖啡酰丙酮酸水解酶（caffeoyl pyruvate hydrolase，cph）将咖啡酰丙酮酸转化成咖啡酸，从而开始新的代谢循环产生光。

3、蒲公英兼具药用价值、生态价值与观赏价值，是重要的药食同源植物与生态修复植物。基因工程技术是实现蒲公英次生代谢调控、抗逆改良、性状定向优化的核心手段。

4、目前公开的蒲公英遗传转化体系主要采用根癌农杆菌介导，普遍存在阳性转化率较低、嵌合体发生率高、再生周期长、多基因转化难度大等缺陷，严重限制了蒲公英多性状同步改良育种。其次，cn109182374a公开了一种利用发根农杆菌诱导蒲公英产生毛状根的方法，包括：外植体的制备、发根农杆菌的活化、发根农杆菌浸染及共培养、毛状根除菌和继代培养。该方法利用发根农杆菌诱导蒲公英产生毛状根，但并未建立“转基因毛状根→完整植株”的再生体系。

5、此外，自发光性状的创制涉及多基因共转化，而多基因共表达面临的基因沉默、表达失衡、通读干扰等问题是植物合成生物学领域的共性难题；现有蒲公英转化体系缺乏对多基因共转化稳定性的系统优化。

6、因此，通过对fbp发光途径进行优化，开发多基因组合在蒲公英中的稳定共转化，得到自发光转基因蒲公英植株，提高蒲公英自发光多基因遗传转化的转化效率，成为目前亟待解决的技术问题之一。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足，本技术的目的在于提供基因组合在制备自发光转基因蒲公英中的应用。本技术将发光相关的5基因转入蒲公英中，实现了多基因的稳定表达，得到的自发光转基因蒲公英具有高强度发光效果。

2、为达到此发明目的，本技术采用以下技术方案：

3、第一方面，本技术提供基因组合在制备自发光转基因蒲公英中的应用，所述基因组合包括

mchispss基因、

nnluzs-i3s/n4t/f11l/i63t基因、

nnh3hs-d37e/v181i基因、

nncphs基因和

npgas基因。

4、所述

mchispss基因的核苷酸序列包括seq id no.1所示的序列或与其具有至少90%同源性且功能相似的序列；

5、所述

nnluzs-i3s/n4t/f11l/i63t基因的核苷酸序列包括seq id no.2所示的序列或与其具有至少90%同源性且功能相似的序列；

6、所述

nnh3hs-d37e/v181i基因的核苷酸序列包括seq id no.3所示的序列或与其具有至少90%同源性且功能相似的序列；

7、所述

nncphs基因的核苷酸序列包括seq id no.4所示的序列或与其具有至少90%同源性且功能相似的序列；

8、所述

npgas基因的核苷酸序列包括seq id no.5所示的序列或与其具有至少90%同源性且功能相似的序列。

9、在一些具体实施方式中，所述

mchispss基因、

nnluzs-i3s/n4t/f11l/i63t基因、

nnh3hs-d37e/v181i基因、

nncphs基因和

npgas基因分别依次由

mchisps基因、

nnluz基因、

nnh3h基因、

nncph基因和

npga基因根据蒲公英的密码子偏好性优化和/或氨基酸单点突变得到。

10、本技术优化了来自真菌的发光系统，除了重构

hisps、h3h、luz、cph这四个咖啡酸循环过程中的重要基因，还添加了4'-磷酸泛酰巯基乙胺转移酶（4’-phosphopantetheinyltransferase，

npga）基因用以促进植物体内活性咖啡酸的合成。

11、同时，本技术按照植物（蒲公英）密码子偏爱性优化基因密码子，提高基因翻译效率；消除基因内部的常用限制性内切酶的识别位点，便于表达盒构建；消除基因内部和相邻基因之间逆向重复序列、茎环结构和转录终止信号，使基因内部的gc/at均衡，提高rna的稳定性；消除内含子识别序列，避免在编码区内发生内含子剪接，导致基因功能的丧失；rna的使基因编码蛋白符合n端原则，以提高翻译蛋白的稳定性；避免6个或更多的连续的a+t序列，5个或更多的g+c序列；避免2、3位用cg和ta双寡核苷酸，以上序列在植物中易造成甲基化，从而引起基因沉默。

12、在基因密码子优化过程中，由于仅通过同义密码子置换无法彻底规避上述核酸序列结构缺陷，因此在不改变蛋白核心空间构象与生物学功能的前提下，对编码区非关键保守氨基酸位点进行适度微调，得到

nnluzs-i3s/n4t/f11l/i63t基因和

nnh3hs-d37e/v181i基因，以破坏有害二级结构、消除回文及异常信号序列，匹配宿主密码子偏爱性的同时，保障基因在宿主中高效转录与翻译。

13、本技术的上述基因组合，可进一步构建一基因一启动子和终止子的独立串联表达盒，解决多基因共表达沉默、表达失衡、通读干扰等问题。

14、第二方面，本技术提供一种自发光转基因蒲公英植株的制备方法，所述制备方法包括：

15、将多基因植物转化载体导入发根农杆菌，得到重组发根农杆菌；重组发根农杆菌活化后与侵染液混合，得到农杆菌侵染液；

16、农杆菌侵染液与预培养后的蒲公英外植体混合进行侵染处理和共培养，筛选抗性毛状根，然后进行植株再生培养，得到自发光转基因蒲公英植株；

17、所述多基因植物转化载体包括：包含

mchispss基因的基因表达盒、包含

nnluzs-i3s/n4t/f11l/i63t基因的基因表达盒、包含

nnh3hs-d37e/v181i基因的基因表达盒、包含

nncphs基因的基因表达盒、包含

npgas基因的基因表达盒及植物表达载体。

18、现有蒲公英遗传转化体系多采用根癌农杆菌介导，存在阳性率低、嵌合体高发、再生周期长的缺陷；同时，现有发根农杆菌介导蒲公英转化仅获得了毛状根，未成功建立完整植株再生体系。

19、本技术涉及的制备方法，通过将发光相关的5个基因转入蒲公英中，可实现多基因的稳定表达，获得肉眼可见的自发光蒲公英植株，且获得阳性苗的整个周期约为45天。与现有的根癌农杆菌介导的蒲公英遗传转化体系相比，可获得更高的转化效率和更短的转化周期，且使嵌合体发生率大幅降低。

20、在一些具体实施方式中，所述基因表达盒均包含依次连接的camv35s启动子、目标基因和nos终止子。

21、所述目标基因分别选自第一方面所述的应用中的

mchispss基因、

nnluzs-i3s/n4t/f11l/i63t基因、

nnh3hs-d37e/v181i基因、

nncphs基因和

npgas基因的任意一种。

22、即，所述

mchispss基因表达盒包含依次连接的camv35s启动子、

mchispss基因（核苷酸序列包括seq id no.1所示的序列或与其具有至少90%同源性且功能相似的序列）和nos终止子。

23、所述

nnluzs-i3s/n4t/f11l/i63t基因表达盒包含依次连接的camv35s启动子、

nnluzs-i3s/n4t/f11l/i63t基因（核苷酸序列包括seq id no.2所示的序列或与其具有至少90%同源性且功能相似的序列）和nos终止子。

24、所述

nnh3hs-d37e/v181i基因表达盒包含依次连接的camv35s启动子、

nnh3hs-d37e/v181i基因（核苷酸序列包括seq id no.3所示的序列或与其具有至少90%同源性且功能相似的序列）和nos终止子。

25、所述

nncphs基因表达盒包含依次连接的camv35s启动子、

nncphs基因（核苷酸序列包括seq id no.4所示的序列或与其具有至少90%同源性且功能相似的序列）和nos终止子。

26、所述

npgas基因表达盒包含依次连接的camv35s启动子、

npgas基因（核苷酸序列包括seq id no.5所示的序列或与其具有至少90%同源性且功能相似的序列）和nos终止子。

27、在一些具体实施方式中，所述camv35s启动子来源于花椰菜花叶病毒，其核苷酸序列如seq id no.6所示。

28、在一些具体实施方式中，所述nos终止子的核苷酸序列如seq id no.7所示。

29、在一些具体实施方式中，camv35s启动子、目标基因和nos终止子的融合采用改良重叠延伸pcr技术（rihe peng et al., applied microbiology biotechnology. 2006,73:234-240）进行。

30、在一些具体实施方式中，所述用改良重叠延伸pcr技术中，pcr扩增的程序为：

31、94-96℃预变性20-40 s；

32、94-96℃变性30-60 s；56-72℃退火30-60 s；70-74℃延伸1-5 min；扩增25-35个循环；

33、70-74℃终延伸5-15 min。

34、其中，94-96℃中的具体点值可以选择94℃、94.5℃、95℃、95.5℃、96℃等，56-72℃中的具体点值可以选择56℃、60℃、64℃、68℃、72℃等，70-74℃中的具体点值可以选择70℃、71℃、72℃、73℃、74℃等，20-40 s中的具体点值可以选择20 s、25 s、30 s、35 s、40s等，30-60 s中的具体点值可以选择30 s、35 s、40 s、45 s、50 s、55 s、60 s等，1-5 min中的具体点值可以选择1 min、2 min、3 min、4 min、5 min等，5-15 min中的具体点值可以选择5 min、8 min、11 min、13 min、15 min等。

35、在一些具体实施方式中，所述植物表达载体包括pcambia1301。

36、在一些具体实施方式中，所述发根农杆菌为发根农杆菌k599。

37、在一些具体实施方式中，所述导入的方式包括电转化导入。

38、在一些具体实施方式中，所述侵染液包含：ms液体基础培养基、乙酰丁香酮和聚醚三硅氧烷。

39、在一些具体实施方式中，所述侵染液包含：ms液体基础培养基、80-120 μm乙酰丁香酮和0.005%-0.04%wt聚醚三硅氧烷。

40、在一些具体实施方式中，聚醚三硅氧烷为商购可得到的break-thru® s 233。

41、本技术通过在侵染液中加入聚醚三硅氧烷，可润湿疏水伤口表面、降低液体表面张力、提升菌液铺展渗透，进而提升阳性转化率。

42、在一些具体实施方式中，所述蒲公英外植体选自蒲公英的子叶叶片、真叶叶片、叶柄或下胚轴。

43、在一些具体实施方式中，所述蒲公英外植体为蒲公英的子叶叶片。本技术研究表明，在遗传转化过程中，子叶叶片相较于真叶叶片、叶柄或下胚轴，具有更高的阳性愈伤率。

44、在一些具体实施方式中，所述预培养后的蒲公英外植体由蒲公英外植体在预培养基上经过光暗交替预培养得到。

45、在一些具体实施方式中，所述预培养基为ms基础培养基。

46、在一些具体实施方式中，所述光暗交替预培养包括：每天14-18 h光照、6-10 h黑暗，光暗交替，培养1-3天。

47、在一些具体实施方式中，所述侵染处理包括将预培养后的蒲公英外植体浸入农杆菌侵染液中，侵染10-30 min。

48、在一些具体实施方式中，所述共培养处理包括将侵染处理后的蒲公英外植体转入共培养基，于黑暗条件下，先在24-26℃下共培养12-20 h，再在20-23℃下共培养28-36 h。

49、本技术通过对外植体进行分段共培养，前段24-26℃促进菌体增殖和吸附伤口，后段20-23℃低温促进t-dna转运，抑制发根农杆菌过量生长。

50、在一些具体实施方式中，所述共培养处理的培养基为ms基础培养基。

51、在一些具体实施方式中，所述筛选抗性毛状根包括：将共培养后的蒲公英外植体转移到选择培养基上，进行光暗交替筛选培养，经初代选择培养基、二代选择培养基和三代选择培养基逐级继代筛选至长出毛状根。

52、在一些具体实施方式中，所述光暗交替筛选培养包括：每天14-18 h光照、6-10 h黑暗，光暗交替，每5-10天继代一次。

53、在一些具体实施方式中，所述初代选择培养基包含：ms基础培养基、美罗培南、羧苄西林和潮霉素。

54、在一些具体实施方式中，所述初代选择培养基包含：ms基础培养基、5-10 mg/l美罗培南、100-400 mg/l羧苄西林和1-5 mg/l潮霉素。

55、在一些具体实施方式中，所述二代选择培养基包含：ms基础培养基、美罗培南、羧苄西林和潮霉素。

56、在一些具体实施方式中，所述二代选择培养基包含：ms基础培养基、3-7 mg/l美罗培南、100-400 mg/l羧苄西林和1-5 mg/l潮霉素。

57、在一些具体实施方式中，所述三代选择培养基包含：ms基础培养基、羧苄西林和潮霉素。

58、在一些具体实施方式中，所述三代选择培养基包含：ms基础培养基、100-400 mg/l羧苄西林和1-5 mg/l潮霉素。

59、在一些具体实施方式中，由于侵染处理阶段选择了渗透能力较强的侵染液，后续被侵染的外植体发根农杆菌较难抑制，采用包含美罗培南和羧苄西林的复合抗生素可减少外植体染菌概率；同时，初代、二代、三代选择培养基中抗生素种类或浓度逐步减少，在保证筛选压力的同时，有效减轻对转化细胞的生长抑制。

60、在一些具体实施方式中，所述植株再生培养包括：筛选能够自发光的毛状根转移到再生培养基中，进行光暗交替再生培养，至长出幼芽。

61、在一些具体实施方式中，所述光暗交替再生培养包括：每天14-18 h光照、6-10 h黑暗，光暗交替。

62、在一些具体实施方式中，所述再生培养基包含：ms基础培养基、羧苄西林和潮霉素。

63、在一些具体实施方式中，所述再生培养基包含：ms基础培养基、100-500 mg/l羧苄西林和1-5 mg/l潮霉素。

64、在一些具体实施方式中，所述制备方法包括：

65、将多基因植物转化载体通过电转化的方式导入发根农杆菌，得到重组发根农杆菌；重组发根农杆菌活化后与侵染液混合，得到农杆菌侵染液。

66、蒲公英外植体先在预培养基上经过光暗交替预培养，然后浸入农杆菌侵染液进行侵染处理，然后转入共培养基于黑暗条件下，先在24-26℃下共培养12-20 h，再在20-23℃下共培养28-36 h。

67、将共培养后的蒲公英外植体转移到选择培养基上，进行光暗交替筛选培养，经初代选择培养基、二代选择培养基和三代选择培养基逐级继代筛选至长出毛状根；筛选能够自发光的毛状根转移到再生培养基中，进行光暗交替再生培养，至长出幼芽，即得自发光转基因蒲公英植株。

68、上述14-18 h中的具体点值可以选择14 h、15 h、16 h、17 h、18 h等，6-10 h中的具体点值可以选择6 h、7 h、8 h、9 h、10 h等，12-20 h中的具体点值可以选择12 h、14 h、16 h、18 h、20 h等，28-36 h中的具体点值可以选择28 h、30 h、32 h、34 h、36 h等，1-3天中的具体点值可以选择1天、1.5天、2天、2.5天、3天等，10-30 min中的具体点值可以选择10min、15 min、20 min、25 min、30 min等，0.5-3天中的具体点值可以选择0.5天、1天、1.5天、2天、2.5天、3天等，5-10天中的具体点值可以选择5天、6天、7天、8天、9天、10天等，100-500mg/l中的具体点值可以选择100 mg/l、200 mg/l、300 mg/l、400 mg/l、500 mg/l等，200-600 mg/l中的具体点值可以选择200 mg/l、300 mg/l、400 mg/l、500 mg/l、600 mg/l等，1-5 mg/l中的具体点值可以选择1 mg/l、2 mg/l、3 mg/l、4 mg/l、5 mg/l等，3-7 mg/l 中的具体点值可以选择3 mg/l、4 mg/l、5 mg/l、6 mg/l、7 mg/l等，5-10 mg/l中的具体点值可以选择5 mg/l、6 mg/l、7 mg/l、8 mg/l、9 mg/l、10 mg/l等，100-400 mg/l中的具体点值可以选择100 mg/l、200 mg/l、300 mg/l、400 mg/l等，80-120 μm中的具体点值可以选择80 μm、90 μm、100 μm、110 μm、120 μm等，0.005%-0.04%wt中的具体点值可以选择0.005%wt、0.01%w、0.015%wt、0.02%w、0.025%wt、0.03%w、0.035%wt、0.04%wt等，24-26℃中的具体点值可以选择24℃、24.5℃、25℃、25.5℃、26℃等，20-23℃中的具体点值可以选择20℃、21℃、22℃、23℃等。

69、第三方面，本技术涉及一种自发光转基因蒲公英植株，所述自发光转基因蒲公英植株含有第一方面所述的应用中的基因组合。

70、所述基因组合包括

mchispss基因、

nnluzs-i3s/n4t/f11l/i63t基因、

nnh3hs-d37e/v181i基因、

nncphs基因和

npgas基因。

71、所述

mchispss基因的核苷酸序列包括seq id no.1所示的序列或与其具有至少90%同源性且功能相似的序列；

72、所述

nnluzs-i3s/n4t/f11l/i63t基因的核苷酸序列包括seq id no.2所示的序列或与其具有至少90%同源性且功能相似的序列；

73、所述

nnh3hs-d37e/v181i基因的核苷酸序列包括seq id no.3所示的序列或与其具有至少90%同源性且功能相似的序列；

74、所述

nncphs基因的核苷酸序列包括seq id no.4所示的序列或与其具有至少90%同源性且功能相似的序列；

75、所述

npgas基因的核苷酸序列包括seq id no.5所示的序列或与其具有至少90%同源性且功能相似的序列。

76、与现有技术相比，本技术具有如下有益效果：

77、本技术创造性地将

mchispss基因、

nnluzs-i3s/n4t/f11l/i63t基因、

nnh3hs-d37e/v181i基因、

nncphs基因和

npgas基因组合用于制备自发光转基因蒲公英，得到的自发光转基因蒲公英具有高强度发光效果，可用作阳台观赏性绿植或小夜灯，具有重要的观赏应用价值和市场前景。

78、采用本技术提供的发根农杆菌介导的的蒲公英遗传转化方法，将发光相关的5基因转入蒲公英中，可实现多基因的稳定表达，获得肉眼可见的自发光蒲公英植株，且转化效率高，整个周期约为45天。