一种PD-L1单域抗体及其用途的制作方法

本发明涉及生物医学或生物制药，更具体地涉及一种抗pd-l1单域抗体及其用途。

背景技术：

1、程序性死亡配体1 (pd-l1)(cd274)是程序性死亡受体1 (pd-1)的配体、可以与pd-1配对结合的蛋白，由290个氨基酸残基组成。pd-l1主要由三部分组成：短细胞质尾区、跨膜区、igv和igc样胞外结构域，在肿瘤细胞和抗原呈递细胞（apc）中表达。

2、pd-1/pd-l1通路控制肿瘤微环境中免疫耐受的诱导和维持。pd-1/pd-l1的活性负责癌症中t细胞的活化、增殖和细胞毒性分泌，从而降低抗肿瘤免疫反应。t细胞上的pd-1与肿瘤细胞或apc上的pd-l1结合后，pd-1的itim和itsm被磷酸化，蛋白酪氨酸磷酸酶shp-2（src同源磷酸酶2）被募集并激活，有效抑制t细胞活化，甚至导致t细胞凋亡、细胞因子产生减少、t细胞裂解和诱导抗原耐受性，从而使肿瘤逃避免疫监视。

3、单克隆抗体在癌症的检测及靶向治疗方面的成功应用，引起了肿瘤治疗的变革。然而，传统的单克隆抗体(150kd)分子质量过大，难以穿透组织，造成肿瘤区域的有效浓度较低，治疗效果不充分。此外，完全人源化的传统抗体开发周期长，生产成本高，稳定性不够等诸多因素限制其在临床中的应用及普及。单域抗体是目前最小的抗体分子，其分子量(不含fc)是普通抗体的1/10。单域抗体除具备单克隆抗体的抗原反应性外，还拥有一些独特的功能特性，如分子质量小，稳定性强、可溶性好、易表达、穿透性强、人源化简单，制备成本低廉，可以克服传统抗体的缺陷。

4、然而，目前本领域尚缺乏令人满意的针对pd-l1的单域抗体。因此，本领域迫切需要开发有效针对pd-l1的特异性单域抗体。

技术实现思路

1、本发明的抗体结构

2、本发明提供了一种程序性死亡配体1 (pd-l1)结合分子，其能够特异性结合pd-l1且包含至少一个免疫球蛋白单一可变结构域，所述至少一个免疫球蛋白的单一可变结构域包含cdr1、cdr2和cdr3；所述免疫球蛋白单一可变结构域是vhh；可选的，所述pd-l1结合分子还包括免疫球蛋白fc区。在一个具体实施方式中，所述pd-l1结合分子为单域抗体，单域抗体可以为驼源抗体、嵌合抗体或人源化抗体；在一个具体的实施方式中，fc区为ch2和ch3区。

3、根据本发明的实施例，所述抗体或其抗原结合片段包含选自下列至少之一的cdr序列或与其具有至少85%同一性的氨基酸序列，vhh区cdr序列：seq id no: 1-231，271-319，或与其具有至少85%同一性的氨基酸序列中cdr1、cdr2、cdr3，或者与其所源自的序列相比具有一个或几个氨基酸的取代、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的取代、缺失或添加)；优选地，所述的取代是保守取代。

4、根据本发明的实施例，所述抗体或其抗原结合片段包含3个可变区cdr，任选的，所述抗体包括seq id no: 233-251、320-331、344-381任一项的氨基酸所示的vhh区的cdr1、cdr2和cdr3序列，并且还包含与上述序列具有至少85%同一性的氨基酸序列。

5、根据本发明的实施例，所述抗体或其抗原结合片段包括分别如seq id no: 1、2、3所示的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列；

6、分别如seq id no: 4、5、6所示的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列；

7、分别如seq id no: 7、8、9所示的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列；

8、分别如seq id no: 10、11、12所示的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列；

9、分别如seq id no: 13、14、15所示的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列；

10、分别如seq id no: 16、17、18所示的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列；

11、分别如seq id no: 19、20、21所示的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列；

12、分别如seq id no: 22、23、24所示的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列；

13、分别如seq id no: 25、26、27所示的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列；

14、分别如seq id no: 28、29、30所示的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列；

15、分别如seq id no: 31、32、33所示的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列；

16、分别如seq id no: 22、34、35所示的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列；

17、分别如seq id no: 36、37、38所示的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列；

18、分别如seq id no: 36、39、40所示的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列；

19、分别如seq id no: 41、42、43所示的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列；

20、分别如seq id no: 44、45、46所示的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列；

21、分别如seq id no: 22、47、35所示的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列；

22、分别如seq id no: 22、48、49所示的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列；

23、分别如seq id no: 50、51、52所示的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列；

24、分别如seq id no: 31、271、33所示的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列；

25、分别如seq id no: 31、272、33所示的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列；

26、分别如seq id no: 44、273、46所示的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列；

27、分别如seq id no: 44、274、46所示的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列；

28、分别如seq id no: 44、275、46所示的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列；

29、分别如seq id no: 276、277、46所示的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列；

30、分别如seq id no: 36、278、40所示的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列；

31、分别如seq id no: 36、279、40所示的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列；

32、分别如seq id no: 36、280、40所示的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列；

33、分别如seq id no: 36、281、40所示的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列；

34、分别如seq id no: 36、282、40所示的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列；或

35、分别如seq id no: 36、283、40所示的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列；

36、以上cdr1-3是根据kabat编码体系确定并注释的，并且还包含与上述序列具有至少85%同一性的氨基酸序列。

37、根据本发明的实施例，所述抗体或其抗原结合片段包括分别如seq id no: 53、54、55所示的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列；

38、分别如seq id no: 56、57、58所示的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列；

39、分别如seq id no: 59、60、61所示的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列；

40、分别如seq id no: 62、63、64所示的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列；

41、分别如seq id no: 65、66、67所示的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列；

42、分别如seq id no: 68、69、70所示的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列；

43、分别如seq id no: 71、72、73所示的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列；

44、分别如seq id no: 74、75、76所示的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列；

45、分别如seq id no: 77、78、79所示的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列；

46、分别如seq id no: 80、81、82所示的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列；

47、分别如seq id no: 83、84、85所示的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列；

48、分别如seq id no: 86、87、88所示的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列；

49、分别如seq id no: 89、90、91所示的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列；

50、分别如seq id no: 92、93、94所示的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列；

51、分别如seq id no: 95、96、97所示的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列；

52、分别如seq id no: 98、99、100所示的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列；

53、分别如seq id no: 86、101、88所示的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列；

54、分别如seq id no: 102、103、104所示的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列；

55、分别如seq id no: 105、106、107所示的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列；

56、分别如seq id no: 83、284、85所示的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列；

57、分别如seq id no: 83、285、85所示的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列；

58、分别如seq id no: 98、286、100所示的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列；

59、分别如seq id no: 98、288、100所示的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列；

60、分别如seq id no: 98、287、100所示的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列；

61、分别如seq id no: 92、289、94所示的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列；

62、分别如seq id no: 92、290、94所示的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列；或

63、分别如seq id no: 92、291、94所示的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列；

64、以上cdr1-3是根据imgt编码体系确定并注释的，并且还包含与上述序列具有至少85%同一性的氨基酸序列。

65、根据本发明的实施例，所述抗体或其抗原结合片段包括分别如seq id no: 108、109、3所示的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列；

66、分别如seq id no: 110、111、6所示的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列；

67、分别如seq id no: 112、113、9所示的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列；

68、分别如seq id no: 114、115、12所示的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列；

69、分别如seq id no: 116、117、15所示的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列；

70、分别如seq id no: 118、119、18所示的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列；

71、分别如seq id no: 120、119、21所示的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列；

72、分别如seq id no: 121、122、24所示的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列；

73、分别如seq id no: 123、124、27所示的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列；

74、分别如seq id no: 125、126、30所示的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列；

75、分别如seq id no: 127、128、33所示的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列；

76、分别如seq id no: 129、130、35所示的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列；

77、分别如seq id no: 131、132、38所示的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列；

78、分别如seq id no: 133、134、40所示的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列；

79、分别如seq id no: 135、136、43所示的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列；

80、分别如seq id no: 121、137、46所示的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列；

81、分别如seq id no: 129、138、35所示的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列；

82、分别如seq id no: 139、140、49所示的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列；

83、分别如seq id no: 141、142、52所示的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列；

84、分别如seq id no: 127、292、33所示的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列；

85、分别如seq id no: 127、293、33所示的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列；

86、分别如seq id no: 121、294、46所示的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列；

87、分别如seq id no: 121、295、46所示的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列；

88、分别如seq id no: 121、296、46所示的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列；

89、分别如seq id no: 133、134、40所示的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列；

90、分别如seq id no: 133、298、40所示的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列；

91、分别如seq id no: 133、299、40所示的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列；或

92、分别如seq id no: 133、300、40所示的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列；

93、以上cdr1-3是根据chothia编码体系确定并注释的，并且还包含与上述序列具有至少85%同一性的氨基酸序列。

94、根据本发明的实施例，所述抗体或其抗原结合片段包括分别如seq id no: 143、144、3所示的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列；

95、分别如seq id no: 145、146、6所示的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列；

96、分别如seq id no: 147、148、9所示的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列；

97、分别如seq id no: 149、150、12所示的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列；

98、分别如seq id no: 151、152、15所示的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列；

99、分别如seq id no: 153、154、18所示的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列；

100、分别如seq id no: 155、156、21所示的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列；

101、分别如seq id no: 157、158、24所示的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列；

102、分别如seq id no: 123、159、27所示的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列；

103、分别如seq id no: 160、161、30所示的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列；

104、分别如seq id no: 162、163、33所示的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列；

105、分别如seq id no: 164、165、35所示的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列；

106、分别如seq id no: 166、167、38所示的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列；

107、分别如seq id no: 168、169、40所示的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列；

108、分别如seq id no: 170、171、43所示的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列；

109、分别如seq id no: 172、173、46所示的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列；

110、分别如seq id no: 164、174、35所示的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列；

111、分别如seq id no: 175、176、49所示的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列；

112、分别如seq id no: 177、178、52所示的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列；

113、分别如seq id no: 162、301、33所示的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列；

114、分别如seq id no: 162、302、33所示的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列；

115、分别如seq id no: 172、303、46所示的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列；

116、分别如seq id no: 172、304、46所示的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列；

117、分别如seq id no: 172、305、46所示的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列；

118、分别如seq id no: 301、306、46所示的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列；

119、分别如seq id no: 168、307、40所示的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列；

120、分别如seq id no: 168、308、40所示的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列；或

121、分别如seq id no: 168、309、40所示的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列；

122、以上cdr1-3是根据abm编码体系确定并注释的，并且还包含与上述序列具有至少85%同一性的氨基酸序列。

123、根据本发明的实施例，所述抗体或其抗原结合片段包括分别如seq id no: 179、180、181所示的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列；

124、分别如seq id no: 182、183、184所示的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列；

125、分别如seq id no: 185、186、187所示的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列；

126、分别如seq id no: 188、189、190所示的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列；

127、分别如seq id no: 191、192、193所示的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列；

128、分别如seq id no: 194、195、196所示的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列；

129、分别如seq id no: 197、198、199所示的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列；

130、分别如seq id no: 200、201、202所示的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列；

131、分别如seq id no: 203、204、205所示的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列；

132、分别如seq id no: 206、207、208所示的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列；

133、分别如seq id no: 209、210、211所示的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列；

134、分别如seq id no: 200、212、213所示的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列；

135、分别如seq id no: 214、215、216所示的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列；

136、分别如seq id no: 217、218、219所示的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列；

137、分别如seq id no: 220、221、222所示的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列；

138、分别如seq id no: 223、224、225所示的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列；

139、分别如seq id no: 200、226、213所示的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列；

140、分别如seq id no: 200、227、228所示的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列；

141、分别如seq id no: 229、230、231所示的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列；

142、分别如seq id no: 209、311、211所示的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列；

143、分别如seq id no: 209、312、211所示的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列；

144、分别如seq id no: 223、313、225所示的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列；

145、分别如seq id no: 223、314、225所示的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列；

146、分别如seq id no: 223、315、225所示的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列；

147、分别如seq id no: 310、316、225所示的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列；

148、分别如seq id no: 217、317、219所示的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列；

149、分别如seq id no: 217、318、219所示的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列；或

150、分别如seq id no: 217、319、219所示的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列；

151、以上cdr1-3是根据contact编码体系确定并注释的，并且还包含与上述序列具有至少85%同一性的氨基酸序列。

152、根据本发明的实施例，所述抗体或其抗原结合片段包括seq id no: 233-251、320-331、344-381任一项所示的vhh氨基酸序列，并且还包含与上述序列具有至少85%同一性的氨基酸序列。

153、根据本发明的实施例，所述抗体或其抗原结合片段可以包含seq id no: 232所示的恒定区，并且还包含与上述序列具有至少85%同一性的氨基酸序列。

154、根据本发明的实施例，所述抗体或其抗原结合片段包括seq id no: 252-270、332-343、382-419任一项所示氨基酸序列，并且还包含与上述序列具有至少85%同一性的氨基酸序列。所述氨基酸序列优选为抗体全长序列；进一步的，当为pd-l1单域抗体时，优选为抗体全长序列。

155、核酸分子

156、本发明提供了编码前述pd-l1结合分子的核酸分子；根据本发明的实施例，所述核酸分子为dna。需要说明的是，对于本文中所提及的核酸分子，本领域技术人员应当理解，其实际包括互补双链的任意一条，或者两条。为了方便，在本说明书和权利要求书中，虽然多数情况下只给出了一条链，但实际上也公开了与之互补的另一条链。另外，本技术中的核酸序列包括dna形式或rna形式，公开其中一种，意味着另一种也被公开。本领域技术人员能够根据不同细胞密码子偏好性设计出能够表达本发明pd-l1结合分子的核酸分子。

157、重组载体

158、本发明提供了表达载体，其包含编码前述pd-l1结合分子的核酸分子。根据本发明的实施例，所述表达载体携带前述核酸分子。在将上述核酸分子连接到载体上时，可以将所述核酸分子与载体上的控制元件直接或者间接连接，只要这些控制元件能够控制所述核酸分子的翻译和表达等即可。当然，这些控制元件可以直接来自于载体本身，也可以是外源性的，即并非来自于载体本身。当然，所述核酸分子与控制元件进行可操作地连接即可。本文中“可操作地连接”是指将外源基因连接到载体上，使得载体内的控制元件，例如转录控制序列和翻译控制序列等等，能够发挥其预期的调节外源基因的转录和翻译的功能。常用的载体例如可以为质粒、噬菌体等等。根据本发明的一些具体实施例的表达载体在导入合适的受体细胞后，可在调控系统的介导下，有效实现前述抗体或抗原结合片段的表达，进而实现抗体或抗原结合片段在体外的大量获得。根据本发明的实施例，所述表达载体为真核表达载体或者原核表达载体，优选的，所述表达载体为质粒表达载体。

159、重组细胞

160、本发明提供了重组细胞，其包含编码前述pd-l1结合分子的核酸分子，或者包含前述表达载体。根据本发明的实施例，所述重组细胞：携带前述核酸分子；或，表达前述抗体或其抗原结合片段。利用该重组细胞在适合条件下，能够在细胞内有效地表达前述抗体或抗原结合片段。根据本发明的实施例，宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性实例有：大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；果蝇s2或sf9的昆虫细胞；cho、cos7、293细胞的动物细胞等。

161、制备方法

162、本发明进一步提供了一种产生pd-l1结合分子的方法，在适合产生抗体的条件下，培养如前所述的宿主细胞，从而获得含有所述抗pd-l1结合分子的培养物；以及，从所述培养物中分离或回收所述抗pd-l1结合分子。

163、在本发明的一个优选例中，所述单域抗体带有可检测的标记物。更优选地，所述标记物选自下组：同位素、胶体金标记物、有色标记物或荧光标记物。

164、药物组合物及治疗用途、制药用途

165、本发明还提供了一种组合物。优选地，所述的组合物是药物组合物，它含有上述抗体或其活性片段或其融合蛋白，以及药学上可接受的载剂。本发明还提供了治疗、检测用途。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中ph通常约为5-8，更优选地ph约为6-8，尽管ph值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。本发明的药物组合物含有安全有效量(如0.001wt％-99wt％,优选地0.01％-90wt％，更优选地0.1％-80wt％)的本发明所述的单域抗体(或其偶联物)以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约10微克/千克体重-约50毫克/千克体重。此外，本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。

166、本发明所述的抗体或抗原结合片段或药物组合物的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于：所述的活性成分的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；所要治疗的患者疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。例如，根据治疗状况的迫切要求，可每天给予若干次分开的剂量，或将剂量按比例地减少。

167、配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：瘤内、腹膜内、静脉内、皮下、腹膜内、肌肉内或局部给药。这些药物可以被制备成各种形式。例如液体、半固体和固体剂型等，包括但不限于液体溶液( 例如，注射溶液和输注溶液)或冻干粉。典型的药物为注射溶液或输注溶液形式。前述抗体或抗原结合片段或前述药物组合物可通过静脉输注或注射或肌肉内或皮下注射来施用。

168、使用药物组合物时，可以将安全有效量的免疫偶联物施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约50毫克/千克体重，优选地该剂量是约10微克/千克体重-约10毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、患者健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

169、本发明的pd-l1结合分子以及包含其的药物组合物可直接用于结合pd-l1蛋白分子，因而可用于治疗肿瘤。本发明涉及pd-l1结合分子、包含其的组合物在预防和/或治疗癌症中的用途，以及在制备用于预防和/或治疗癌症的药物中的用途。在一些实施方案中，所述癌症选自肺癌、卵巢癌、结肠癌、直肠癌、黑色素瘤、肾癌、膀胱癌、乳腺癌、肝癌、淋巴瘤、恶性血液病、头颈癌、胶质瘤、胃癌、鼻咽癌、喉癌、宫颈癌、子宫体癌、骨肉瘤中的至少一种。

170、本发明还提供了前述pd-l1结合分子在制备用于检测生物学样品中pd-l1的存在和/或pd-l1的表达水平的试剂盒中的用途。

171、本发明还提供了前述pd-l1结合分子在制备用于诊断pd-l1相关疾病的试剂盒中的用途，所述疾病为pd-l1高表达相关的肿瘤。

172、该试剂盒包括识别pd-l1蛋白的抗体，用于溶解样本的裂解介质，检测所需的通用试剂和缓冲液，如各种缓冲液、检测标记、检测底物等。该检测试剂盒可以是体外诊断装置。

173、抗体的功能

174、体外结合活性测定

175、可以通过检测细胞表面抗体的荧光信号，通过流式细胞仪检测荧光信号强度，定量分析抗体结合活性，来评价抗体的结合能力。所述细胞包括但不限于mda-mb-231细胞、a549细胞、h1975细胞、hcc827细胞、pc-9细胞、hepg2细胞、sk-br-3细胞、thp-1细胞、u87细胞、hct116细胞、b16-f10细胞、jurkat细胞等。通常，可以采用流式细胞术。当然，也可以采用荧光显微镜观察荧光标记的抗体与细胞表面pd-l1的结合情况。或者，将细胞固定在微孔板中，通过酶标二抗和底物反应来检测抗体结合活性。或者，将pd-l1蛋白固定在芯片上，通过检测抗体结合引起的信号变化来评估结合活性。或者，利用表面等离子共振（spr）、生物膜干涉（bli）、荧光共振能量转移（fret）检测抗体与pd-l1的结合。还可以采用生物膜层干涉技术(bli)测定抗pdl1抗体与人pdl1蛋白的反应亲和力。

176、pbmc或nk细胞杀伤验证

177、pdl1（程序性死亡配体1）在多种肿瘤细胞表面高表达，与t细胞表面的pd1结合，抑制t细胞活化，介导肿瘤免疫逃逸。pdl1抗体可以阻断pd1/pdl1通路，恢复t细胞的抗肿瘤活性。本发明所涉及的pdl1抗体，具备使得哺乳动物或人pbmc或nk细胞杀伤pdl1高表达肿瘤细胞的功能，具体的可以选择pdl1高表达的肿瘤细胞系，如a549、hcc827、mda-mb-231等。

178、具体的可以设计多种实验进行验证，仅为示例：可以利用pdl1高表达的肿瘤细胞作为靶细胞，人pbmc或nk细胞作为效应细胞，通过检测不同pdl1抗体处理后效应细胞对靶细胞的杀伤率，筛选出具有增强免疫细胞杀伤活性的pdl1抗体。培养pdl1高表达的肿瘤细胞；取人pbmc细胞调整细胞密度，可选的，也可以进一步分离nk细胞，将效应细胞与靶细胞共培养，通过荧光标记肿瘤细胞，之后检测荧光信号来分析肿瘤细胞死亡情况，或者采用ldh法检测杀伤情况。本发明中优选的抗体分子都能够与对照抗体达到相当或更优的杀伤效果。

179、体内药效

180、可以采用本发明所涉及的抗体分子，进行体内药效的验证，采用包括但不限于肿瘤移植模型，例如皮下移植模型如人肿瘤细胞（如mda-mb-231、a549、h1975等）、原位移植模型、转移模型，通过检测肿瘤体积、重量，生存期分析，免疫细胞浸润（如cd8+t细胞）和pd-l1表达水平。

181、可以采用人源化小鼠模型，如pbmc人源化模型、cd34+人源化模型、肿瘤-免疫双人源化模型，检测肿瘤生长和生存期，人免疫细胞（如cd8+t细胞、treg细胞）的浸润和活性，细胞因子水平（如ifn-γ、tnf-α）。

182、可以采用同源肿瘤模型，如mc38模型、b16-f10模型、4t1模型，检测肿瘤生长和生存期、免疫细胞浸润（如cd8+ t细胞、tam）、肿瘤微环境中的pd-l1表达水平。

183、药效学生物标志物检测

184、可以通过检测血液或肿瘤组织中的生物标志物，评估pd-l1结合分子的药效，为药效评估提供分子和细胞水平的证据。可以使用流式细胞术检测肿瘤微环境中免疫细胞（如cd8+ t细胞、treg细胞、mdsc）的比例和活性；可以使用免疫组化（ihc）检测肿瘤组织中pd-l1表达水平和免疫细胞浸润；可以使用elisa/msd检测血清中细胞因子（如ifn-γ、il-2、tnf-α）的水平；可以使用rna测序或qpcr，分析肿瘤微环境中免疫相关基因的表达变化。

185、定义

186、需要说明的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。进一步地，在本发明的描述中，除非另有说明，否则“多个”的含义是两个或两个以上。

187、在本文中，术语“包含”或“包括”为开放式表达，即包括本发明所指明的内容，但并不排除其他方面的内容。

188、在本文中，术语“任选地”、“任选的”或“任选”通常是指随后所述的事件或状况可以但未必发生，并且该描述包括其中发生该事件或状况的情况，以及其中未发生该事件或状况的情况。

189、在本文中，术语“抗体”通常是指可识别一种或多种抗原表位的抗体，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多聚体抗体和cdr移植抗体。本发明主要涉及单域抗体，术语“单域抗体”、“纳米抗体”和“vhh抗体”可互换使用，其最初被描述为“重链抗体”(即“缺乏轻链的抗体”)的抗原结合免疫球蛋白(可变)域(hamers-casterman c, atarhoucht,muyldermans s, robinson g, hamers c, songa eb, bendahman n, hamers r.:“naturallyoccurring antibodies devoid of light chains”；nature 363, 446-448(1993))，只包含重链可变区（vhh），并可选的可以包含ch2与ch3区，其通过重链可变区与抗原特异性结合。

190、在可变区中某些区域的氨基酸组成和排列顺序具有更高的变化程度，称为高变区（hypervariable region，hvr），高变区为抗原和抗体结合的位置，因此也称为互补决定区（complementarity-determining region，cdr）。重链可变区和轻链可变区上均有三个cdr。

191、本发明所提供的抗体或者抗原结合片段与上述重链和轻链相比，具有保守氨基酸取代。“抗原结合片段”是指保持特异性结合抗原能力的抗体片段，抗原结合片段的实例包括vhh区纳米抗体或最小识别单位中的至少一种。“保守氨基酸取代”指的是氨基酸被另一氨基酸发生生物学上、化学上或者结构上相似的残基所取代。生物学上相似指的是该取代不破坏抗体或者抗体与抗原结合的生物学活性。结构上相似指的是氨基酸具有相似长度的侧链，如丙氨酸、甘氨酸或丝氨酸，或具有相似大小的侧链。化学相似性指的是氨基酸具有相同的电荷或者都是亲水或者疏水的。例如疏水残基异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或者甲硫氨酸相互取代。或者用极性氨基酸例如用精氨酸取代赖氨酸、谷氨酸取代天冬氨酸、谷氨酰胺取代天冬酰胺，丝氨酸取代苏氨酸等等。

192、在本文中，术语“最小识别单位”和“mru”均是指仅由一个cdr组成的抗体，其分子量十分小，仅占完全抗体的1%左右。

193、在本文中，术语“同一性”、“同源性”或“相似相”均用于描述相对于参考序列的氨基酸序列或核酸序列时，采用通过常规的方法进行确定两个氨基酸序列或核酸序列之间的相同氨基酸或核苷酸的百分比，例如参见，ausubel等，编著(1995)，current protocols inmolecular biology，第19章(greene publishing and wiley-interscience，new york)；和 align程 序 (dayhoff (1978)，atlas of protein sequence and structure 5：suppl. 3 (national biomedical research foundation，washington，d.c.)。关于比对序列和测定序列同一性有很多算法，包括needleman等(1970)j.mol.biol.48：443的同源性比对算法；smith等(1981) adv. appl. math. 2：482的局部同源性算法；pearson等(1988)proc. natl. acad. sci. 85：2444的相似性搜索方法；smith-waterman 算法(meth. mol.biol. 70：173-187(1997)；和blastp，blastn，和blastx算法(参见altschul等(1990) j.mol. biol. 215：403-410)。利用这些算法的计算机程序也是可获得的，并且包括但不限于：align或megalign (dnastar)软件，或者wu-blast-2 (altschul 等，meth. enzym.，266：460-480(1996))；或者gap，bestfit，blast altschul等，同上文，fasta，和tfasta，在genetics computing group(gcg)包，8版，madison，wisconsin，usa中可获得；和intelligenetics，mountain view，california提供的pc/gene程序中的clustal。

194、在本文中，术语“至少85%同一性”指与各参考序列至少为85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%、99.9%的同一性。进一步的，在85%的同一性中，还包括与目标序列包含至多有50个(较佳地为1-20个，更佳地为1-10个、更佳地1-5个，最佳地为1-3个)氨基酸不相同，其中，所述的不相同包括氨基酸的取代、缺失或添加，所述取代优选为保守取代。

195、在本文中，术语“表达载体”通常是指能够插入在合适的宿主中自我复制的核酸分子，其将插入的核酸分子转移到宿主细胞中和/或宿主细胞之间。所述表达载体可包括主要用于将dna或rna插入细胞中的载体、主要用于复制dna或rna的载体，以及主要用于dna或rna的转录和/或翻译的表达的载体。所述表达载体还包括具有多种上述功能的载体。所述表达载体可以是当引入合适的宿主细胞时能够转录并翻译成多肽的多核苷酸。通常，通过培养包含所述表达载体的合适的宿主细胞，所述表达载体可以产生期望的表达产物。

196、在本文中，术语“重组细胞”通常是指采用基因工程技术或细胞融合技术对宿主细胞的遗传物质进行修饰改造或重组，获得具有稳定遗传的独特性状的细胞。其中，术语“宿主细胞”是指可导入重组表达载体的原核细胞或真核细胞。本文所用术语“转化”或“转染”是指通过本领域已知的各种技术将核酸（例如载体）引入细胞。合适的宿主细胞可以用本发明的dna序列转化或转染，并且可以用于靶蛋白的表达和/或分泌。

197、在本文中，术语“药物组合物”通常是指单位剂量形式，并且可以通过制药领域中熟知的方法的任何一种进行制备。所述方法包括使活性成分与构成一种或多种附属成分的载体相结合的步骤。通常，通过使活性抗体或其抗原结合片段与液体载体、细碎固体载体或这两者均匀并充分地结合，制备组合物。

198、在本文中，术语“药学上可接受的辅料”或“药学上可接受的载剂”均可包括任何溶剂、固体赋形剂、稀释剂或其他液体赋形剂等等，适合于特有的目标剂型。除了任何常规的辅料与本发明的抗体或其抗原结合片段不相容的范围（例如所产生的任何不良的生物效应或与药学上可接受的组合物的任何其他组分以有害的方式产生的相互作用）之外，它们的用途也是本发明所考虑的范围。

199、在本文中，术语“给药”指将预定量的物质通过某种适合的方式引入患者。本发明的抗体或抗原结合片段或药物组合物可以通过任何常见的途径被给药，只要它可以到达预期的组织。给药的各种方式是可以预期的，包括腹膜、静脉注射、肌肉注射、皮下注射等等，但是本发明不限于这些已举例的给药方式。

200、在本文中，术语“治疗”是指用于获得期望的药理学和/或生理学效果。所述效果就完全或部分预防疾病或其症状而言可以是预防性的，和/或就部分或完全治愈疾病和/或疾病导致的不良作用而言可以是治疗性的。本文使用的“治疗”涵盖哺乳动物、特别是人的疾病，包括：(a)在容易患病但是尚未确诊得病的个体中预防疾病或病症发生；(b)抑制疾病，例如阻滞疾病发展；或(c)缓解疾病，例如减轻与疾病相关的症状。本文使用的“治疗”涵盖将药物或抗体或其抗原结合片段给予个体以治疗、治愈、缓解、改善、减轻或抑制个体的疾病的任何用药，包括但不限于将含本文所述抗体或其抗原结合片段的药物给予有需要的个体。