一种脐带间充质干细胞的规模化制备工艺及其应用的制作方法

本发明涉及生物，具体涉及一种脐带间充质干细胞的规模化制备工艺及其应用。

背景技术：

1、脐带间充质干细胞（uc-mscs）因其来源丰富、增殖能力强、免疫原性低、伦理争议小等优势，已成为再生医学领域理想的种子细胞来源，在骨组织工程和骨质疏松症治疗中展现出良好的应用前景。目前，国内外已有多个研究团队开展了uc-mscs制备技术的研究，例如现有技术（cn 101974484 a）公开了一种人脐带间充质干细胞的制备方法，通过组织块冻存技术降低制备成本；四川新生命干细胞科技股份有限公司开发了增强uc-mscs成骨和成软骨分化特性的培养基及制备工艺；现有技术（cn 119638837 a）公开了一种人脐带间充质干细胞扩增培养基及制备工艺，旨在提高增殖效率。

2、现有uc-mscs制备方法存在以下技术问题：在规模化制备方面，前期培养成本高（单份样本培养成本超过2万元），细胞经多次传代易丢失干性，传统冻存保护液（如10%dmso）复苏活率仅约70%，冻存液残留率超过5%，且二维平面培养扩增效率不足；在成骨分化诱导方面，传统成骨诱导培养基需添加β-甘油磷酸钠、地塞米松、胰岛素等外源物质，这些物质对uc-mscs均有一定毒副作用，且可能使uc-mscs丧失低免疫原性特性，不同批次、不同来源的uc-mscs在成骨分化能力上存在显著差异；在工艺标准化方面，现有技术尚未建立全流程标准化工艺，存在批次间细胞质量不稳定、人工操作个体差异大（手工剪碎组织块尺寸差异可达2-5mm3）、质量控制体系不完善等问题。

3、综上所述，现有技术中的制备工艺制备成本高、细胞干性易丢失、冻存复苏活率低、外源诱导物具有毒副作用及免疫原性升高风险、全流程缺乏标准化规模化工艺。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种脐带间充质干细胞的规模化制备工艺及其应用，解决了现有技术中的制备工艺制备成本高、细胞干性易丢失、冻存复苏活率低、外源诱导物具有毒副作用及免疫原性升高风险、全流程缺乏标准化规模化工艺的技术问题。

2、为实现上述目的，本发明提供了一种脐带间充质干细胞的规模化制备工艺，包括：

3、首先进行脐带组织采集与预处理：截取脐带并用生理盐水冲洗去除残留血液，置于含抗生素的脐带保存液中，2-8℃保存，同步采集母血用于病原体检测，所截取的脐带长度15-20cm；

4、然后采用脐带组织切割机将脐带华通氏胶组织块切割为标准化的1.5±0.3mm3立方体；

5、将标准化组织块浸入复合型冻存保护液中5-10分钟，程序降温至-80℃后转移至液氮长期保存，降温过程中，每分钟降温1℃；

6、于37℃水浴解冻组织块，用生理盐水洗涤2-3次，去除残留冻存液；将组织块接种于仿生型扩增培养基中，置于37℃、5% co2培养箱培养10-20天，获得p0代细胞；

7、采用三维微载体悬浮培养系统对p0-p3代细胞进行规模化扩增；

8、将扩增后的uc-mscs接种于成骨分化诱导培养基中诱导7-14天，成骨分化诱导培养基以dmem/df12为基础培养基，添加胎牛血清和肿瘤坏死因子α（tnf-α）或白介素1β（il-1β）；

9、收集诱导后的uc-mscs，并进行质量检测。

10、其中，所述复合型冻存保护液的配方为：

11、按体积百分比：

12、基础液：自体脐血血清或人ab血清，体积百分比为30%-50%；

13、渗透性保护剂：二甲基亚砜（dmso）体积百分比为5%-8%，甘油体积百分比为2%-5%；

14、非渗透性保护剂：海藻糖质量体积比为0.05-0.15 g/ml，羟乙基淀粉质量体积比为0.01-0.05 g/ml；

15、余量为基础培养基。

16、其中，采用三维微载体悬浮培养系统对p0-p3代细胞进行规模化扩增时：

17、具体参数如下：

18、微载体：cytodex 3或同类型的明胶包被微载体，浓度2-5 g/l；

19、接种密度：3-5×104cells/ml；

20、培养方式：搅拌式生物反应器，转速30-60 rpm；

21、培养时间：5-7天；

22、收获密度：1-3×106cells/ml，扩增倍数≥50倍。

23、其中，诱导培养的具体条件为：

24、tnf-α浓度：5-20 ng/ml，或il-1β浓度：1-10 ng/ml；

25、胎牛血清体积百分比：5%-10%；

26、诱导时间：7-14天；

27、每3天换液一次。

28、其中，在收集诱导后的uc-mscs，并进行质量检测时，检测项目如下：

29、细胞形态：倒置显微镜下观察细胞形态，应为长梭形、成纤维样；

30、表面标志物：流式细胞仪检测，cd73、cd90、cd105阳性率≥95%，cd34、cd45、hla-dr阳性率≤2%；

31、成骨分化功能验证：茜素红染色检测钙结节形成率≥90%；

32、无菌检测：细菌、真菌、支原体检测均为阴性；

33、冻存液残留检测：残留量≤0.5%。

34、如上述所述的脐带间充质干细胞的规模化制备工艺所制备的脐带间充质干细胞的应用，

35、将脐带间充质干细胞用于制备治疗骨质疏松症药物；

36、骨质疏松症为绝经后骨质疏松症。

37、本发明的一种脐带间充质干细胞的规模化制备工艺及其应用，首先进行脐带组织采集与预处理；然后采用脐带组织切割机将脐带华通氏胶组织块切割为标准化的1.5±0.3mm3立方体；将标准化组织块浸入复合型冻存保护液中5-10分钟，程序降温至-80℃后转移至液氮长期保存，降温过程中，每分钟降温1℃；于37℃水浴解冻组织块，用生理盐水洗涤2-3次，去除残留冻存液；将组织块接种于仿生型扩增培养基中，置于37℃、5% co2培养箱培养10-20天，获得p0代细胞；采用三维微载体悬浮培养系统对p0-p3代细胞进行规模化扩增；将扩增后的uc-mscs接种于成骨分化诱导培养基中诱导7-14天，成骨分化诱导培养基以dmem/df12为基础培养基，添加胎牛血清和肿瘤坏死因子α（tnf-α）或白介素1β（il-1β）；收集诱导后的uc-mscs，并进行质量检测，解决了以下技术问题：

38、降低uc-mscs制备成本，提高复苏活率和细胞干性维持能力；

39、避免成骨诱导过程中外源添加物的毒副作用和免疫原性升高问题；

40、建立标准化、可放大的uc-mscs培养工艺，支撑骨质疏松症细胞治疗的ind申报。

1.一种脐带间充质干细胞的规模化制备工艺，其特征在于，

2.如权利要求1所述的脐带间充质干细胞的规模化制备工艺，其特征在于，

3.如权利要求2所述的脐带间充质干细胞的规模化制备工艺，其特征在于，

4.如权利要求3所述的脐带间充质干细胞的规模化制备工艺，其特征在于，

5.如权利要求4所述的脐带间充质干细胞的规模化制备工艺，其特征在于，

6.如权利要求5所述的脐带间充质干细胞的规模化制备工艺所制备的脐带间充质干细胞的应用，其特征在于，