用于生产重组蛋白的方法与流程

本公开涉及生产重组蛋白的方法。更具体地，本公开涉及制备生物制品的方法，这些生物制品诸如单克隆抗体、融合蛋白或其抗原结合片段。特别地，本公开涉及改善此类制造工艺的细胞活力和目标蛋白质生产率并且降低宿主细胞蛋白质杂质的方法和补料方案的使用。更具体地，本公开涉及生产替瑞奇珠单抗（tildrakizumab）的方法。

背景技术：

1、重组dna技术用于生产允许用于在一系列治疗应用中使用的量的蛋白质。重组蛋白生产中的一项重要任务是优化细胞培养补料和条件，以便使用最有效的生产手段获得高蛋白质滴度。任何改善（包括增量改善）都可以具有巨大的经济效益。在制药工业中，优化用于在治疗疾病的疗法中使用的生物制品的蛋白质生产是有利的，因为当大规模制造生物制品时，任何改善都可能对生产率具有显著影响。因此，本领域仍然需要从表达用于在医学使用的生物蛋白的细胞培养物中最大化蛋白质生产。典型地，哺乳动物细胞培养补料基于可商购获得的补料制剂。然而，这些补料制剂通常不是最佳富集的，以提高生物蛋白质表达。

2、宿主细胞蛋白质（hcp）是具有不同物理化学特性的蛋白质的复杂混合物。一些hcp被认为是高风险hcp。高风险hcp包括具有免疫原性和酶活性的那些，其具有降解在制剂中使用的产物分子或赋形剂的潜力。因此，hcp被认为是关键质量属性（cqa），因此需要在进行工艺改变时进行监测。

3、抗体滴度的改善可以通过培养条件优化来实现。培养条件的变化可能对高风险hcp谱具有不利影响。例如，培养基、进料策略、工艺持续时间、峰值细胞密度和搅拌速度的变化可以影响细胞活力，这最终将导致显著不同的hcp组成。因此，重要的是开发一种目的是消除高风险hcp的工艺。

4、制药工业需要容易生产的蛋白质，用于在作为治疗研究的一部分的一系列应用中使用。需要商业上可行的生产工艺来最大化以最有效方式生产的重组蛋白的产量。因此，仍然需要用于使蛋白质生产最大化的改进的细胞培养补充剂和细胞培养方法。

技术实现思路

1、本公开涉及生产重组蛋白的方法。更具体地，本公开涉及制备生物制品的方法，这些生物制品诸如单克隆抗体、融合蛋白或其抗原结合片段。特别地，本公开涉及改善此类制造工艺的细胞活力和蛋白质生产率并且降低宿主细胞蛋白质杂质的补料制备方法和进料方案。更具体地，本公开涉及生产替瑞奇珠单抗的方法。

2、因此，本公开涉及用于显著改善商业生产的单克隆抗体滴度的产量的方法。更具体地，本公开涉及包括改善细胞培养补料以改善单克隆抗体生产率和在该工艺的收获阶段的细胞活力的方法。在细胞培养期间活力的增加减少了无细胞上清液中hcp的量。这是较高细胞活力的结果，其因此影响培养期间的细胞裂解，导致收获期间较低的hcp含量。

3、本公开提供了通过组合补料改善细胞培养物密度、活力和生产率的制造方法。本公开提供了非常有利的组合补料，因为其在一种制剂中含有营养素的组合。本公开提供了与用于生产重组蛋白的标准工艺相比使收获滴度几乎加倍的方法和组合补料。

4、本文提供了一种生产抗il-23p19抗体的方法，该方法包括：(a)通过将能够表达重组蛋白的细胞接种到含有第一培养基的容器中来制备细胞培养物；(b)培养细胞；(c)降低细胞培养物的温度；(d)向细胞培养物中添加第二培养基；(e)培养细胞；(f)从细胞培养物中收获细胞；以及(g)从收获的细胞中分离重组蛋白。

5、本文还提供了一种生产抗il-23p19抗体的方法，该方法包括：(a)在合适的培养基中制备并按比例扩大能够表达重组蛋白的种子细胞培养物；(b)在合适的生产培养基中接种并培养种子细胞培养物以制备细胞培养物；(c)降低细胞培养物的温度；(d)定期向细胞培养物中添加补料；(e)培养细胞；(f)从细胞培养物中收获细胞；以及(g)从收获的细胞中分离重组蛋白。

6、从结合所附权利要求的以下具体实施方式中，将更全面地理解本公开的这些和其他特征和优点。应注意，权利要求的范围由其中的叙述限定，而不是由本说明书中阐述的特征和优点的具体讨论限定。

1.一种生产抗il-23抗体的方法，所述方法包括：

2.一种生产抗il-23抗体的方法，所述方法包括：

3.一种生产抗il-23p19抗体的方法，所述方法包括：

4.一种生产抗il-23p19抗体的方法，所述方法包括：

5.如权利要求3或权利要求4所述的方法，其中所述抗il-23p19抗体包含：

6.如权利要求3或权利要求4所述的方法，其中所述抗il-23p19抗体包含：

7.如权利要求1或权利要求3所述的方法，其中所述容器是500 ml摇瓶或5l生物反应器。

8.如权利要求1或权利要求3所述的方法，其中向所述容器中接种0.3 x106至0.9 x106个活细胞/ml。

9.如权利要求1至6中任一项所述的方法，其中当所述细胞培养物中的活细胞计数达到2.3 x 106至3.0 x 106个细胞/ml时，降低所述温度。

10.如权利要求9所述的方法，其中当所述细胞培养物中的活细胞计数达到2.5 x 106个细胞/ml时，降低所述温度。

11.如权利要求1至6中任一项所述的方法，其中在培养所述细胞之前或在培养所述细胞的约72小时时，降低所述温度。

12.如权利要求1或权利要求3所述的方法，其中从培养所述细胞的第2天起每隔一天添加一次所述第二培养基。

13.如权利要求12所述的方法，其中向所述细胞培养物中添加约2% v/v的所述第二培养基。

14.如权利要求1或权利要求3所述的方法，其中从培养所述细胞的第2天起每四天添加一次所述第二培养基。

15.如权利要求14所述的方法，其中向所述细胞培养物中添加约4% v/v的所述第二培养基。

16.如权利要求1或权利要求3所述的方法，其中所述第二培养基是dme/f12、营养物补料溶液、balancd cho feed 4或cell boost 5。

17.如权利要求1或权利要求3所述的方法，其中所述第二培养基是含有balancd chofeed 4和cell boost 5的组合补料。

18.如权利要求17所述的方法，其中所述组合补料具有1.25x、1.5x、1.75x或2x的补料强度。

19.如权利要求18所述的方法，其中所述组合补料具有2x的补料强度。

20.如权利要求19所述的方法，其中所述组合补料含有约112 g/l balancd cho feed4和约35 g/l cell boost 5。

21.如权利要求20所述的方法，其中从培养所述细胞的第2天起每隔一天添加一次所述组合补料。

22.如权利要求21所述的方法，其中从培养所述细胞的第2天起每四天添加一次所述组合补料。

23.如权利要求22所述的方法，其中在培养所述细胞的2天、6天、10天、14天和18天之后添加所述组合补料。

24.如权利要求23所述的方法，其中向所述细胞培养物中添加约2% v/v至约4% v/v的所述组合补料。

25.如权利要求24所述的方法，其中向所述细胞培养物中添加约4% v/v的所述组合补料。

26.如权利要求18所述的方法，其中所述组合补料具有1.75x的补料强度。

27.如权利要求26所述的方法，其中所述组合补料含有约84.0 g/l balancd cho feed4和约26.25 g/l cell boost 5。

28.如权利要求26所述的方法，其中从培养所述细胞的第2天起每隔一天添加一次所述组合补料。

29.如权利要求26所述的方法，其中从培养所述细胞的第2天起每四天添加一次所述组合补料。

30.如权利要求29所述的方法，其中在培养所述细胞的2天、6天、10天、14天和18天之后添加所述组合补料。

31.如权利要求30所述的方法，其中向所述细胞培养物中添加约2% v/v至约4% v/v的所述组合补料。

32.如权利要求31所述的方法，其中向所述细胞培养物中添加约4% v/v的所述组合补料。

33.如权利要求21所述的方法，其中所述组合补料具有1.5x的补料强度。

34.如权利要求33所述的方法，其中所述组合补料含有约56.1 g/l balancd cho feed4和约17.5 g/l cell boost 5。

35.如权利要求33所述的方法，其中从培养所述细胞的第2天起每隔一天添加一次所述组合补料。

36.如权利要求33所述的方法，其中从培养所述细胞的第2天起每四天添加一次所述组合补料。

37.如权利要求36所述的方法，其中在培养所述细胞的2天、6天、10天、14天和18天之后添加所述组合补料。

38.如权利要求37所述的方法，其中向所述细胞培养物中添加约2% v/v至约4% v/v的所述组合补料。

39.如权利要求38所述的方法，其中向所述细胞培养物中添加约4% v/v的所述组合补料。

40.如权利要求16所述的方法，其中所述第二培养基是营养物补料溶液。

41.如权利要求40所述的方法，其中向所述细胞培养物中添加固定体积的营养物补料溶液。

42.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中当培养物活力下降至低于75%时或在生物过程的第22天，以先发生者为准，从所述细胞培养物中收获所述细胞。

43.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中从在所述细胞培养物中所收获的细胞中分离至少1.0至3.0 g/l的重组蛋白。

44.如权利要求43所述的方法，其中从在所述细胞培养物中所收获的细胞中分离至少2.2 g/l的重组蛋白。

45.如权利要求43所述的方法，其中从在所述细胞培养物中所收获的细胞中分离至少2.2 g/l的重组蛋白。

46.如权利要求43所述的方法，其中从在所述细胞培养物中所收获的细胞中分离至少2.5 g/l的重组蛋白。

47.如权利要求43所述的方法，其中从在所述细胞培养物中所收获的细胞中分离至少3.0 g/l的重组蛋白。

48.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中在所收获的细胞中的宿主细胞蛋白质（hcp）污染物与在标准工艺中所收获的细胞中的hcp污染物相比减少。

49.如权利要求48所述的方法，其中所述hcp污染物是高风险hcp污染物。

50.如权利要求49所述的方法，其中所述高风险hcp污染物包括78 kda葡萄糖调节蛋白（grp78，bip）、溶酶体磷酸脂酶a2（lpla2）和/或肝羧酸酯酶1中的一种或多种。

51.一种生产抗il-23p19抗体的方法，所述方法包括：